一株豬圓環病毒3 型的鑒定和遺傳演化分析

張 琴，楊漫漫，張月，李雪梅，楊潞，田志革，胡曉亮（通信作者），崔鵬博

（1.四川國際旅行衛生保健中心（成都海關口岸門診部），四川成都 610042；2.成都海關，四川成都 610042；3.宜賓學院農林與食品工程學部，四川宜賓 644000；宜賓市動植物檢驗檢疫工程技術研究中心，四川宜賓 644000）

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）為單鏈環狀DNA 病毒，無囊膜，是已知最小的動物病毒之一。PCV 有4 種病毒類型，分別為PCV1、PCV2、PCV3 和PCV4[1]。PCV1 通常認為不具有致病性。PCV2 能夠引起宿主機體的免疫抑制，導致斷奶仔豬發生多系統衰弱綜合征、母豬的皮炎與腎病綜合征[2]和繁殖障礙的臨床癥狀[3-4]。2016 年，PCV3 首次發現于美國密蘇里州、明尼蘇達州和南達科塔州，感染后，使宿主患有心肌炎、呼吸系統和神經系統疾病，母豬流產率增加，出現產死胎或木乃伊胎現象[5]。PCV3 的基因組全長1999～2001bp，包含3 個主要的ORFs，ORF1 編碼復制起始相關蛋白Rep 和Rep’由296～297 個氨基酸組成，是圓環病毒基因組最保守的區域。ORF2 編碼圓環病毒粒子中唯一的結構蛋白，即衣殼蛋白，由214 個氨基酸組成，具有免疫原性。ORF3 能夠調控宿主細胞凋亡的非結構蛋白，由231 個氨基酸組成。本研究從四川省宜賓市某豬場患有呼吸困難的仔豬血液中鑒定一株PCV3，命名為SC-YB2212，通過遺傳變異分析，了解SC-YB2212 的分子特征，為PCV3 分子流行病學研究和防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來源

臨床樣本來源于2022 年10 月四川省宜賓市某養殖場，發病癥狀主要包括仔豬呼吸困難、氣喘等狀況，采集仔豬的血液。按照DNA 提取試劑盒說明書，提取豬的血液DNA 備用，存于-80℃。

1.2 主要試劑

病毒DNA 提取試劑盒，購自天根生物科技有限公司；膠回收試劑盒，購自愛思進生物科技有限公司；pMD18T，DH5α，DL2000 marker、ExTaq酶、均購自TAKARA。

1.3 引物設計

利用豬圓環病毒3 型鑒定引物R-F：5’-CCCCCATGGGGGGAGCGGTTTC-3’；R-R：5’-ATTCCGGGGCCGGTTTTCTC-3’對血液DNA 進行PCR 鑒定。

1.4 PCR 擴增及測序

反應條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行35 個循環；72 ℃終延伸10 min。PCR 產物由成都擎科生物科技有限公司進行測序，鑒定的病毒株命名為SC-YB2212。

1.5 基因序列分析

從GenBank 中選擇不同基因型PCV3 全基因序列。利用DNAStar 軟件中的MegAlign Clustal W 計算法對SC-YB2212 的基因組序列進行同源性分析，用MEGA6.0 比鄰法進行遺傳變異分析，構建遺傳進化樹，分析SC-YB2212 與參考毒株的遺傳進化關系。（見圖1）。

2 結果

2.1 基因序列的比較分析

SC-YB2212 與參考序列之間的同源性最高的為美國株KX898030（97.9%），與德國株MG014368的同源性最低為94.9%，與其他國內株同源性較高（97.0%～97.7%）。SC-YB2212 與四川宜賓株SCYB2203 相比，衣殼蛋白同源性為98.6%，這表明宜賓地區的PCV3 抗原性多樣的情況。

2.2 SC-YB2203 遺傳進化分析

使用MEGA6.0 軟件將SC-YB2212 與國內外PCV3 核酸序列進行比對，構建進化樹。結果顯示SC-YB2212 與河北株 MF318449 和廣西株MG650174、云南株MG650176 屬于同一分支，與西班牙株MH579746 和美國株MK496280 親緣關系較近，與四川株MZ449244 和重慶株KY075992 親緣關系較遠（見圖2）。

圖2 PCV3 衣殼蛋白遺傳進化分析

3 討論

本研究通過采集呼吸困難仔豬的血液，進行PCR 方法檢測和鑒定，獲得一株PCV3 序列，命名為SC-YB2212。序列分析顯示PCV3 沒有明顯的地域性，與國內株PCV3 序列同源性為97%～97.9%。

遺傳進化分析發現SC-YB2212 與河北株MF318449、廣西株MG650174、云南株MG650176 屬于同一分支，與西班牙株MH579746 和美國株MK496280 親緣關系較近，與四川株MZ449244 和重慶株KY075992 親緣關系較遠。這說明SCYB2212 與豬只頻繁調動相關，導致毒株交叉傳播。PCV3 衣殼蛋白作為主要抗原性蛋白，而西南地區PCV3 存在多基因亞型并存現象，說明抗原性發生變異，因此，不同基因型存在是否影響致病性需要進一步研究。

綜上所述，本研究鑒定了一株PCV3，SCYB2212，遺傳分析發現其與多株國外毒株和廣西株和云南株遺傳關系較近，與四川株和重慶株遺傳關系較遠，本研究有助于豐富西南地區PCV3 的基因型特征，為后續防控提供依據。