甜菜BES1基因家族鑒定與生物信息學分析

劉云赫,石 晶,耿 貴,王宇光

(黑龍江大學現農業與生態環境學院,哈爾濱 150080)

0 引言

油菜素內酯(BRs)是一種甾醇類激素在植物體內廣泛分布,主要存在于花和未成熟的種子中,在植物一系列生理調控以及生物和非生物脅迫反應中起至關重要作用[1,2,3]。BES1是介導油菜素內酯 (BRs) 反應基因表達的關鍵轉錄因子[4]。BES1、BZR1及四種BES1/BZR1同源物(BEH1-BEH4)共同組成BES1/BZR1基因家族[5]。研究發現擬南芥中BES1與其同源蛋白BZR1的序列相似度高達88%,分別具有抑制和激活轉錄的作用[6]。在對BR信號通路成員進行鑒定的過程中,人們發現擬南芥bzr1-1D突變體與BRs缺失突變個體在性狀上一致,經染色體分析發現其中包含4個已被注釋的開放閱讀框,突變發生在擬南芥第1號染色體的體臂底端,基因序列中一個單堿基對的變化導致翻譯后的氨基酸由脯氨酸變為亮氨酸,將這個基因命名為BZR1[7]。后續人們又從其抑制突變體bes1-D中分離得到BZR1的高度同源蛋白并命名為BES1[8]。BES1蛋白由三個結構域組成,包括油菜素內酯不敏感磷酸化結構域2(BIN2)、氨基末端結構域和羧基末端結構域[9,10,11],具有識別并結合DNA的能力,BES1轉錄因子可能通過調控其他轉錄因子來參與植物生長發育的調節[12]。由于測序技術的不斷發展,很多物種的全基因組數據已經被鑒定出來,到目前為止已在擬南芥[5]、高粱[13]、水稻[14]、大豆[15]和白菜[16]等多個植物中鑒定出BES1蛋白,然而對甜菜BES1家族基因的認識顯然不足。

甜菜(BetavulgarisL.)二年生草本植物,是制糖的重要原料,可被食用和飼用[17,18]。甜菜制糖的副產物糖蜜還可以用來生產丙酮、甲醇、乙醇、甘油和甜菜堿等化學物質[19]。除此之外,制糖廢料濾泥還可以作為肥料中和土壤中的游離酸等物質[20]。提高作物產量和質量是農業生產的兩個主要目標,在至關重要的植物甾醇類激素中,BRs參與多種細胞反應通過這些反應可以提高作物產量,在甜菜葉叢快速生長期以及糖貯藏期,BRs可以通過提高甜菜葉綠素含量、葉片的凈光合速率和氣孔導度最終提高甜菜產量[21]。盡管已經在甜菜中研究了許多種轉錄因子,但對甜菜中的BES1家族的研究較少,本研究利用生物信息學技術對甜菜BES1基因家族進行全面研究,并從基因結構、蛋白理化性質、進化關系、序列特征、染色體定位和啟動子順式作用元件等方面進行分析,旨在為后續研究甜菜BES1基因家族生物學功能和農業生產中的潛在應用提供借鑒參考,為鑒定和表征其他物種的BES1基因提供了基礎。

1 材料方法

1.1 BvBES1基因家族的鑒定

從NCBI 網站(https://ncbi.nlm.nih.gov/)和Pfam網站(http://pfam.xfam.org/)中獲取甜菜的蛋白組數據和BES1結構域的隱馬爾科夫文件(PF05687),利用HMMER軟件篩選出甜菜基因組中潛在的BES1蛋白,將這些篩選結果提交至SMART在線網站(https://smart.embl.de/)以確認保守結構域的具體組成,并進一步驗證篩選結果的準確性,最后在 NCBI 網站中提取已鑒定的BvBES1蛋白對應的基因組序列及CDS序列。

1.2 BvBES1基因家族的分析

1.2.1 蛋白理化性質分析

利用在線程序ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)對目標基因的基本理化特性進行分析,對BvBES1蛋白的蛋白長度、分子量及等電點進行預測。利用Wolf PSORT在線網站(https://wolfpsort.hgc.jp/)來預測BvBES1蛋白的亞細胞定位信息,并從NCBI網站中獲取染色體位置信息。

1.2.2 系統進化分析

使用MEGA5軟件對擬南芥AtBES1、波菜SpBES1、大豆GmBES1、水稻OsBES1及甜菜BvBES1蛋白的序列進行多序列比對,基于比較結果,采用最大簡約法(Maximum-parsimony),并將Bootstrap數值設定為1000以此來構建系統發育進化樹,然后使用iTOL在線網站(https://itol.embl.de/)來對系統發育進化樹進行美化處理。

1.2.3 基因結構及蛋白Motif分析

將BvBES1基因家族的基因組序列和CDS序列輸送到GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)在線軟件中,以此觀察BvBES1基因的內含子和外顯子結構。利用MEME在線軟件(http://alternate.meme-suite.org/tools/meme)對BvBES1蛋白的保守基序進行深入分析,設定10個預測值。接著利用TBtools軟件對保守基序進行可視化處理,并據此生成了相應的圖片[22]。

1.2.4 基因家族啟動子分析

提取BvBES1基因CDS序列上游2000bp的序列片段,并將其上傳到PlantCARE在線網站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/h-tml/),以獲取上游啟動子功能元件的數量及種類信息。

2 結果與分析

2.1 BvBES1家族基因定位及蛋白理化性質

通過比對篩選,共鑒定出7個甜菜BES1基因,根據這些基因在基因組中的位置對其進行排序。分別命名為BvBES1-001-BvBES1-007(表1),其中BvBES1-001定位于甜菜1號染色體;BvBES1-002被定位于甜菜4號染色體;BvBES1-003、BvBES1-004、BvBES1-005三個基因位于甜菜5號染色體上;BvBES1-006和BvBES1-007分別被定位在甜菜6號和8號染色體上(圖1)。蛋白理化性質預測結果顯示7個蛋白的長度在147.00-703.00 aa之間,BvBES1-003蛋白最短、BvBES1-001蛋白最長,相對分子質量范圍為16.25-78.63 kDa、等電點范圍為5.62-9.40。Wolf PSORT網址預測的蛋白亞細胞定位結果表明除BvBES1-003和BvBES1-004蛋白位于細胞質以外,其余5個蛋白均位于細胞核內。

圖1 BvBES1基因染色體定位Fig.1 Chromosomal localization of theBvBES1 gene

表1 BvBES1基因家族基本信息Tab.1 Basic information about the BvBES1 gene family

2.2 BvBES1蛋白系統發育進化樹

基于7個甜菜BvBES1蛋白、6個波菜SpBES1蛋白、6個水稻OsBES1蛋白、11個大豆GmBES1蛋白和8個擬南芥AtBES1蛋白共38個蛋白,利用MEGA5軟件構建蛋白系統發育進化樹。如圖2所示,參照擬南芥AtBES1蛋白家族分類將38個BES1蛋白分為5組,其中A組共7個成員包括2個擬南芥AtBES1蛋白、B組6個成員BvBES1-006蛋白和2個擬南芥AtBES1蛋白歸于這組,C組最大共15個成員包含2個擬南芥AtBES1蛋白和BvBES1-002、BvBES1-007蛋白。D組同樣包含7個成員2個擬南芥AtBES1蛋白和2個甜菜BvBES1-001、BvBES1-005蛋白,最后最小的E組只有3個成員BvBES1-003和BvBES1-004及1個波菜SpBES1蛋白。一個分支中包含多個物種,而同一物種的蛋白分散在不同分支中,說明BES1蛋白具有一定的多樣性,推測BES1蛋白的分化過程發生在菠菜、水稻、大豆、擬南芥和甜菜的進化之前。

圖2 BES1家族蛋白系統發育進化樹Fig.2 Phylogenetic evolutionary tree of BES1 family proteins

2.3 BvBES1基因結構和蛋白Motif分析

由基因結構分析(圖3B)可知,BvBES1家族7個基因結構差異較大,結合蛋白系統發育進化樹結果,發現BvBES1-001和BvBES1-005、BvBES1-002和BvBES1-007進化距離較近其基因結構除長度外也基本相同。而進化距離相對較遠的蛋白其基因結構也有著明顯的差異,如BvBES1-003和BvBES1-006。說明BvBES1家族具有一定的特異性。為了解BES1蛋白結構的多樣性,采用MEME分析預測甜菜BES1家族蛋白的保守基序結果如圖3B,其中motif1(圖4)在全部7個基因中均存在,表明其具有相似的功能,推測為BvBES1家族的保守序列(圖3C)。

圖3 BvBES1基因家族基因結構圖A 啟動子順式元件分析圖;B BvBES1蛋白保守基序分析圖;CBvBES1基因結構圖Fig.3 Gene structure of theBvBES1 gene familyA promoter cis-element analysis; B BvBES1 protein conserved motif analysis; C BvBES1 gene structure diagram

圖4 蛋白保守Motif1序列圖Fig.4 Sequence map of the protein conserved Motif1

2.4 BvBES1順式元件分析

使用PlantCARE分析了翻譯起始位點上游約2000bp的序列預測結果如圖3A?？偣舶l現了 66個順式作用元件,其中與激素響應相關的元件數量最多共25個,其次是脅迫響應元件23個,而光響應元件最少只有3個,說明BvBES1基因家族參與激素響應、脅迫響應及光響應等生命過程。每個基因不僅擁有不同數量的順式作用元件,而且在元件的具體類型上也存在的差異。在對BvBES1家族成員啟動子中的激素響應元件類型進行更深入的分析后共識別出赤霉素、水楊酸、茉莉酸和脫落酸四種不同類型的激素響應元件。其中,赤霉素主要負責調節和促進植株生長,而其他三種則主要負責促進植株成熟。

3 討論

BRs作為一種近幾十年來發現的植物激素,被稱為繼生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸和乙烯之后的第六種激素,BRs密切參與植物生長和各種應激反應[23]。BES1轉錄因子對BR信號的調控過程已被證明與植物脅迫響應有關,如水分脅迫、熱脅迫、冷脅迫等,BES1還在植物生長和發育的多個方面起著至關重要的作用[24]。本研究利用生物信息學方法共鑒定出7個甜菜BES1基因。為更好地了解不同物種之間的進化聯系將擬南芥、菠菜、水稻和大豆蛋白加入到系統進化樹中,38個BES1蛋白共分5組,7個甜菜BES1蛋白分別劃分在B、C、D、E四組中,這與前人研究的結果一致[25]。結果顯示BES1蛋白在不同物種間的系統進化關系較近,而同一物種中的進化關系相對較遠,這表明BES1蛋白本身具有一定的多樣性,該蛋白的分化過程遠在菠菜、水稻、大豆、擬南芥和甜菜的進化之前,BES1基因在擬南芥、波菜、水稻、大豆和甜菜可能具有不同的作用。

通過分析甜菜BES1家族的基因結構、序列特征、染色體定位、啟動子順式作用元件等。發現甜菜BES1蛋白都包含典型的BES1_N結構域具有高度特異性與系統發育進化樹結果一致。同時不同基因擁有不同數量不同種類的順式作用元件,在多種脅迫及激素反應過程中具有潛在的生物學作用,推斷不同BES1基因在甜菜中具有不同的作用。前人基于全基因組序列,分別在擬南芥、波菜、水稻和大豆中鑒定出8、6、6和11個BES1基因,相較下甜菜BES1基因家族包含的成員要少得多。小麥中共鑒定出23個TaBES1家族成員,研究發現TaBES1-3B2、TaBES1-3D2和TaBES1-6D可能是干旱脅迫相關基因。此外,TaBES1-3B2和TaBES1-3D2還可能在低溫誘導的雄性不育信號通路中發揮作用[26]。在黃瓜基因組中鑒定出6個CsBES1基因家族成員,根據系統進化樹將其劃分為3個分支,相比較下甜菜BES1家族成員數量與之相近但分類更為豐富。黃瓜CsBES1基因對激素誘導有反應、對大多數脅迫表現出顯著的響應、CsBZR6在各種黃瓜組織中高表達,可能是調控黃瓜生長發育的重要基因[27]。BES1在不同葡萄器官中的表達也存在差異,在鹽脅迫和熱脅迫下,BES1在不同葡萄品種中表達存在差異,葡萄VvBES1的表達也隨著鹽脅迫處理時間的延長而變化[28],在甜菜BES1基因中也發現了響應脅迫的順式作用元件,推測BES1基因在甜菜多種脅迫中也扮演重要的角色。本研究結果為揭示該家族在甜菜BRs信號通路中的功能和調控機制奠定了基礎,同時也為該家族在其他物種中的研究提供了建議。