利用分子標記技術鑒定甜菜單胚不育系的混雜程度

陳姝源,吳則東

(黑龍江大學現代農業與生態環境學院,哈爾濱 150080)

0 引言

甜菜是世界上重要的糖料作物之一,也是我國的第二大糖料作物[1]。我國每年甜菜糖的產量大約在150萬噸左右,2021年我國甜菜的播種面積為26.2萬公頃,2021年我國甜菜產量為785.09萬噸。糖甜菜為異花授粉、二年生作物, 育種方法目前主要為三系育種法, 即不育系、保持系和授粉系[2]。盡管甜菜種植面積和食糖產量均不足甘蔗的1/5,但由于甜菜種植簡便、機械化程度高、成本低、效益顯著,使得近幾年甜菜種植面積在穩步提高[3]。目前世界上發達國家的甜菜品種均為單胚品種,國外的甜菜單胚品種均是以單胚細胞質二元雄性不育系為母本,多胚授粉系為父本雜交而成,而國內僅有少數一些育種單位育成的甜菜品種為單交種,其它育種單位也均是采用三交種,因此擁有單胚細胞質雄性不育系和保持系數量的多少就決定了能夠配制多少雜交組合或者多少二元不育系。植物雄性不育是作物雜種優勢利用的重要途徑,并在生產上取得了很大的成功,如我國雜交水稻種植面積占水稻總面積的46%～55%,其產量比常規品種增產20%～30%,同樣在甜菜育種上雜種優勢利用也很廣泛[4]。甜菜單胚不育系和保持系在繁殖的過程中一般都是成對種植,在收獲過程中由于人為的原因很容易造成不育系中混雜有保持系或者保持系中混雜有不育系。通過傳統的形態學鑒定,無法在早期分辨出甜菜自交系的育性。

分子標記在狹義上是指DNA標記,即DNA水平遺傳多態性的直接反映, 表現為核苷酸序列的任何差異[5]。分子標記在20世紀80年代就已經開始應用,它是繼形態學標記、細胞標記和生化標記技術之后發展起來的一種遺傳標記[6]。近幾十年以來,已經有SNP[7]、EST[8]以及ISSR[9]等多種分子標記技術被運用于甜菜遺傳圖譜的構建和遺傳多樣性分析中。近年來,隨著分子標記技術的快速發展,利用分子標記技術對于甜菜細胞質雄性不育系和保持系的快速鑒定已經成為可能。NISHIZAWA等[10]發現在甜菜線粒體基因組中的數目可變的串聯重復序列(VNTR)具有多態性和 4 個不相關的串聯重復序列位點(TR1、TR2 、TR3和TR4),而其中TR1串聯重復序列的多態性最高,串聯重復序列的數量為 2～13 個不等?？梢岳米饔糜谔鸩司€粒體VNTR位點進行甜菜細胞質的育性鑒定。 CHENG等[11]通過對中國甜菜種質資源的研究發現,不同細胞質育性類型的小衛星序列的拷貝數具有多態性,其中細胞質為 OWEN[12]不育型的 TR1片 段有4個拷貝,細胞質為保持系型的拷貝數為 13個。王有昭[13]也用此方法對甜菜主要品系進行VNTR分子檢測時,在葉用甜菜中首次發現了一株特異類型的細胞質,其TR1片段拷貝數為10個。其余試驗結果與程大友[14]的結果一致,經過測序發現,其 TR1不育系擴增條帶大小在500 bp以下,保持系擴增條帶大小在750 bp左右。以這兩個作為對照材料進行PCR擴增,可以通過對比條帶帶型大小的方式來判斷甜菜細胞質類型。

細胞質雄性不育系是甜菜雜交制種的基礎[15]。由于成對的甜菜單胚不育系和保持系細胞核沒有差別,只在細胞質上有差異,并且在育種過程中,作為母本的都是單胚不育系或者二元單胚不育系,因此不育系中混有保持系比保持系中混有不育系對育種的影響更大。因此本研究擬對黑龍江以及新疆共三家育種單位的24份甜菜單胚不育系中是否混有保持系進行分析,了解我國目前甜菜單胚不育系的純度,對于指導將來甜菜育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試的甜菜單胚不育系

試驗中所用到的甜菜單胚不育系中有12份來自新疆石河子農業科學院甜菜研究所,10份來自新疆農業科學院經濟作物研究所,有兩份新改良的單胚不育系來自于黑龍江大學現代農業與生態環境學院。

表1 供試甜菜單胚不育系名稱及來源Tab.1 Test varieties and sources

1.2 試驗方法

1.2.1 甜菜基因組DNA的提取

目前甜菜DNA提取通常使用改良的CTAB法。CTAB (十六烷基三甲基溴化銨簡稱CTAB)是一種陽離子去污劑,可溶解細胞膜 ,它能與核酸形成復合物,在高鹽溶液中 (0.7 M NaCl) 是可溶的,當降低溶液鹽的濃度到一定程度 (0.3 mol/L NaCI) 時從溶液中沉淀,通過離心就可將 CTAB 與核酸的復合物同蛋白、多糖類物質分開,然后將 CTAB 與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液中,再加入乙醇使核酸沉淀 ,CTAB 能溶解于乙醇中。本試驗采用改良CTAB法提取甜菜基因組的DNA[16]。

由于個別不育系發芽率較低,編號6取了12份個體,編號7取了17份個體,編號8取了9份個體,編號9取了11份個體,編號11取了17份個體,編號19取了10份個體,編號20、21取了20份個體,其余編號每份提取24個個體的基因組DNA,用來代表群體。

1.2.2 DNA分子標記

本研究使用的分子標記為引物TR1, 用于識別細胞質的類型,其序列詳見表2[17]。

表2 TR1引物序列Tab.2 Primers for TR 1

1.2.3 PCR反應體系與程序

PCR反應體系為10 μL:包括5 μL 2×Taq PCR Master Mix,0.2 μL 上游引物(0.5 μmol/L),0.2 μL下游引物 (0.5 μmol/L),1 μL DNA (100 ng/μL) ,3.6 μL dd H2O[18]。

PCR反應程序為:95℃ 3 min;94℃ 25 s,60℃ 25 s,72℃ 3 min,28個循環;72℃ 5 min。

1.2.4 PCR產物檢測

PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離,在含有TAE的緩沖液中,130 V、30 min。電泳結束后,凝膠用Gelred熒光核酸染料染色,并通過凝膠成像系統觀察[19]。

2 結果與分析

2.1 細胞質育性分子標記鑒定

試驗共檢測了24個試驗材料的302個植株樣本,經TR1引物分子標記鑒定檢測后,共檢測出238個結果。在這238個結果中,共檢測出750 bp條帶的細胞質類型8份,材料分別為23、24;其余22個材料檢測的均為略低于500 bp的條帶。23、24檢測到的條帶分別有750 bp和500 bp,即750 bp為N型細胞質,500 bp為S型細胞質。

圖1 D084 經TR1引物PCR擴增后的檢測結果Fig.1 Results of D084 detection after PCR amplification with TR 1 primers

2.2 甜菜單胚不育系的混雜程度分析

本次試驗鑒定的24個甜菜單胚不育系中混有保持系的株數及混雜率詳見表3。從表中可以看出,除了兩份改良的甜菜單胚不育系外,其余一直在使用的單胚不育系均沒有混雜的現象。

表3 甜菜單胚不育系混雜株數及其混雜率Tab.3 Number of confounding strains and their confounding rates

3 結論

實驗結果表明,供試的24份甜菜單胚不育系材料中,有22份經常使用的甜菜單胚不育系材料的不育程度達到100%,可以直接用于甜菜育種中;另外兩份由黑龍江大學新改良的單胚不育系出現了混雜的現象。

本研究對國內三家育種機構現有的部分甜菜單胚不育系材料進行了不育系中是否混有保持系的鑒定,研究結果說明這些年來國內對不育系和保持系的隔離采種效果明顯,抽樣調查結果表明,已經應用的不育系中沒有混進保持系的現象。同時也發現了新改良的單胚不育系中仍存在混雜現象,說明在利用多胚改良單胚的過程中,成系之前一定要認真的對不育系和保持系的育性進行認真的調查,在該不育系材料還沒有大量地應用于育種實踐之前,應及時將混雜株剔除,防止在授粉過程中由于不育系中混有保持系形成自交,導致雜交種不純的情況發生;同時也可以避免混雜的保持系給其它不育系授粉,嚴重影響雜交種育種進程。