基于質譜技術篩選釀酒酵母中Hrr25在自噬中的相互作用蛋白

姜文艷, 徐佳鈺, 崔艷美, 王 娟

(北京工業大學 環境與生命學部,北京 100124)

自噬是一種高度保守的細胞降解過程[1].在自噬過程中,細胞質成分被隔離在稱為自噬體的雙膜囊泡中,并被轉運到溶酶體或液泡中進行降解[2].自噬可以以非選擇性和選擇性的方式發生[3],選擇性自噬包括細胞質到液泡靶向途徑(cytoplasmic to vacuolar targeting pathway,CVT)、過氧化物酶體自噬、線粒體自噬等.酵母中的遺傳篩選鑒定自噬相關基因揭示了自噬過程的分子機制.迄今已鑒定出40多種自噬相關蛋白(autophagy-related protein,Atg),有19種直接參與了饑餓誘導的自噬體的生物發生.自噬對于維持能量平衡和保護細胞免受壓力至關重要,在發育和傳染病、神經變性和癌癥等疾病中起著重要作用[4-5].

Hrr25是釀酒酵母中I型酪蛋白激酶家族成員,具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性.Hrr25蛋白質結構域可分為N-端激酶結構域(氨基酸1～290)和“中心域”(氨基酸290～394),以及C-端脯氨酸/富含谷氨酰胺的結構域[6].其可以定位于細胞核、內吞部位、芽頸、紡錘體和高爾基體等[7-11].最初研究發現 Hrr25可以參與DNA修復及影響細胞分裂,隨著研究的深入發現Hrr25通過與多種蛋白的相互作用參與自噬[12-18]、囊泡運輸[19]、鈣離子調節[20]、弱有機酸脅迫途徑[21]、核糖體生物發生[22-26]、微管組裝[27]等多個細胞過程,對于釀酒酵母維系自身穩態、應對環境壓力至關重要.在選擇性自噬過程中,Hrr25可以磷酸化選擇性受體Atg19,Atg34和Atg36影響與支架蛋白Atg11的相互作用,從而調控選擇性自噬的發生.而在饑餓誘導的非選擇性自噬過程過程中,Hrr25可以磷酸化COPⅡ衣被蛋白Sec24,而調節自噬體的數量以及與Atg9 C端的相互作用[28-29].雖然現在關于Hrr25在自噬中的作用和作用機制的研究已有一些重要進展,但Hrr25在自噬過程中還有哪些尚未鑒定的新底物參與仍有待研究.本研究通過質譜篩選釀酒酵母中Hrr25在自噬中新的相互作用蛋白,為解析Hrr25調控自噬的分子機制,準確認識Hrr25與自噬的關系,深入了解自噬調控網絡提供新信息.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 釀酒酵母菌株

MATaura3-1-his3-i1,15trp1-1-1lev2-3,112ade2-1can1-100

1.1.2 主要實驗試劑

Phanta Max Super-fidelity DNA Polymerase(南京諾唯贊生物股份科技有限公司),FastDigest XhoⅠ,FastDigestBamHⅠ,FastDigestNcoI(Thermo Fisher Scientific),Clon Express One Step Cloning Kit(南京諾唯贊生物科技公司),DH-5α感受態細胞(北京天根生物科技有限公司),T3 Super PCR Mix(北京擎科生物科技有限公司),瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、普通DNA產物純化試劑盒、快速質粒小提試劑盒(北京天根生物科技有限公司).引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成,其引物序列如表1.

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequence

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒構建

使用pRS305-Hrr25(+145～+1482)正向及pRS305-Hrr25(+145～+1482)反向引物以及酵母基因組為模板調取目的基因片段,同時使用XhoⅠ和BamHⅠ酶切載體.將PCR調取的核酸片段及酶切后的載體進行瓊脂糖凝膠電泳及核酸片段回收.核酸片段回收后進行同源重組,并將同源重組產物轉化到DH-5α感受態細胞中,待單克隆在含有抗性的培養基中長出,挑取單克隆,進行PCR驗證.驗證出陽性菌株后提取質粒并送測序.

1.2.2 菌株的構建

將構建好的pRS305-Hrr25-13MYC質粒使用限制性內切酶NcoI線性化處理,將線性化后的核酸片段通過酵母轉化轉入到酵母菌株中.將轉化處理后的菌株涂在篩選培養板SC-Leu上,待單克隆長出后進行菌落PCR和Western Blot驗證.

1.2.3 質譜樣品制備

收集生長期的菌株100 OD(光密度,optical density,OD),在SD-N培養基中饑餓處理4 h.對應的收集生長期的菌株100 OD不做饑餓處理.然后再次收集菌株并用蝸牛酶處理菌株獲得原生質體.將原生質體重新懸浮在1 000 μL的裂解緩沖液(25 mmol/L tris-HCl,pH 7.4,150 mmol/L NaCl,1 % triton X-100,1 mmol/L EDTA,5 %甘油,蛋白酶抑制劑)中,冰上孵育10 min設置條件為12 000 r/min,4 ℃離心10 min.取上清到新的離心管中,即獲得蛋白樣品.將獲得的蛋白樣品先與Myc抗體在室溫孵育1 h,然后再與磁珠室溫孵育1 h.用TBST清洗磁珠4～5次后加入2×SDS-PAGE Loading Buffer,100 ℃金屬浴煮10 min.然后進行SDS-PAGE電泳,待樣品跑到分離膠1 cm處,停止電泳.用考馬斯亮藍對膠塊染色1 h,脫色液脫色.膠塊寄送北京蛋白質組研究中心進行LC-MS/MS分析.樣品使用Orbitrap Fusion質譜儀搭載easy-nLC 1000 nanoflow高效液相色譜系統,設置質譜參數如下:Orbitrap 掃描的自動獲得控制目標(automatic gain control target,AGC target)為5×105,最大注入時間50 ms,MS/MS二級掃描AGC target為5×103,最大注入時間35 ms,動態排除設定18 s.

1.2.4 與Hrr25相互作用蛋白篩選

將不同條件下質譜篩選出的蛋白輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1,得出在誘導自噬條件下特異與Hrr25相互作用的蛋白.

1.2.5 基因本體論(GO)功能分析和京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將所得到的誘導自噬特異性表達基因導入David數據庫(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)進行GO的生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細胞組分(cell component,CC)及KEGG通路富集分析,并將結果可視化.

2 實驗結果

2.1 質粒構建

構建pRS305-HRR25-13MYC質粒,HRR25選擇的基因片段為+145～+1 482.用合成的引物pRS305～Hrr25(+145～+1 482)-Forward及pRS305-Hrr25(+145～+1 482)-Reverse以酵母基因組為模板進行PCR,調取所需核酸片段.如圖1a核酸片段從酵母全基因組上調取出來,大小為1 391 bp.然后利用同源重組的方法將調取的核酸片段與載體結合,并熱激轉化到DH5α細胞.利用菌落PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測單克隆菌株確定陽性菌株,質粒的陽性菌株PCR結果預計陽性大小1 391 bp,如圖1b獲得陽性菌株,陽性結果條帶大小與預計大小一致.進一步將陽性單克隆菌株提取質粒并進行DNA測序確定質粒構建成功.

a.調取HRR25基因核酸片段,核酸片段大小為1 391 bp;b.pRS305-HRR25-13MYC-ADH1 terminator質粒構建驗證,PCR陽性結果1 391 bp.圖1 質粒構建Fig.1 Plasmid Construction

2.2 酵母菌株構建

以W303菌株為模式菌株,制備可以表達 Hrr25-13Myc蛋白的釀酒酵母菌株.首先用限制性內切酶NcoI線性化pRS305-Hrr25(+145～+1 482)-13MYC-ADH1 terminator質粒,并通過酵母轉化將線性化的pRS305-HRR25(+145～+1 482)-13MYC-ADH1 terminator核酸片段轉入到酵母菌株中.由于pRS305質粒上所帶的篩選標記為LEU2,所以將轉化好的酵母菌株涂布在SC-Leu營養缺陷型培養基上篩選陽性克隆.待單克隆在篩選培養基SC-Leu中長出,挑取單克隆在分子水平和蛋白水平進行驗證.在分子水平使用引物Hrr25-+62正向引物和pRS305-R進行PCR驗證,陽性菌株PCR大小為1 444 bp.如圖2a所示,驗證出陽性菌株.驗證出的陽性菌株,再對加入標簽后的目的基因序列進行酵母PCR并送測序,確認標簽正確加到目的基因位置.在蛋白水平上,將PCR驗出的陽性菌株在SC-Leu液體培養基中培養,并提取蛋白質進行Western Blot驗證,用Myc抗體進行孵育.如圖2b所示,結果與陰性對照對比Myc標簽融合蛋白基因已成功整合到菌株基因組并成功表達,即表達Hrr25-13Myc蛋白的菌株構建成功.

圖2 表達Hrr25-13Myc菌株分子(a)和蛋白水平驗證(b)Fig.2 Molecular(a)and Protein(b)Level Validation of Hrr25-13Myc Strain

2.3 免疫沉淀聯合質譜篩選和鑒定與Hrr25相互作用蛋白

圖3 Hrr25相互作用蛋白韋恩圖Fig.3 Venny Diagram of Hrr25 Interacting Protein

為了找出與Hrr25相互作用影響自噬的蛋白,以成功表達Hrr25-13Myc蛋白的菌株為模式生物進行實驗.首先對表達Hrr25-13Myc蛋白的菌株進行不同的處理,一組菌株進行饑餓處理誘導自噬,對應的另一組菌株不進行饑餓處理.然后利用免疫沉淀的方法,用Myc抗體以Hrr25-13Myc為靶蛋白進行免疫沉淀,分別從饑餓和非饑餓處理后菌株中將Hrr25及其相互作用的蛋白沉淀下來.蛋白樣本制備完成后,先用蛋白免疫印記實驗進行驗證確認Hrr25-13Myc靶蛋白沉淀下來,然后再將免疫沉淀的樣品進行SDS-PAGE并用考馬斯亮藍染色后送質譜檢測.質譜結果去除置信度較低的一批蛋白后,在非饑餓條件下鑒定出1 869種候選蛋白,在饑餓條件下鑒定出1 838種候選蛋白.將2種狀態下與Hrr25相互作用的蛋白,運用Venny 2.1繪制韋恩圖.如圖3所示,只在非誘導自噬條件下與Hrr25相互作用的候選蛋白有352種,只在誘導自噬條件下與Hrr25相互作用的候選蛋白有321種,在2種狀態下都與Hrr25相互作用的候選蛋白有1 518種.

2.4 Hrr25的互作蛋白功能分析

對在自噬誘導條件下特異與Hrr25相互作用的321種蛋白進行分析.通過David數據庫對這321種蛋白進行GO和KEGG富集分析.GO分析可以通過將差異基因或蛋白進行富集分析后統計顯著富集的區域,對321種蛋白進行GO分析可顯示其在分子功能、生物過程和細胞組成中的分類.根據P<0.05,GO富集共得到23項生物過程(biological process,BP),主要涉及CVT途徑、高爾基囊泡內介導的轉運、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄、糖異生負調控蛋白質轉運,自噬前體結構的蛋白質定位等.16項細胞組成(cellular component,CC)相關主要涉及高爾基膜,高爾基轉運復合體,過氧化物酶體,自噬前體結構,內質網到高爾基體轉運囊泡等.21項分子功能(molecular function,MF)主要涉及蛋白質異二聚活性、氧化還原酶活性、DNA結合、蛋白質復合物支架等.如圖4所示,選擇P值排名前10的生物過程、細胞組成、分子功能進行可視化.在富集的生物過程中,CVT途徑排名最靠前,富集到11種候選蛋白其中包括自噬相關蛋白:Atg9,Atg27,Atg3,Atg4,Atg11,保守寡聚高爾基體(conserved oligomeric golgi,COG)復合物亞基:Cog1,Cog5,Cog6,Cog7,Cog8,SNARE(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor)蛋白Vam7.

圖4 GO富集分析結果Fig.4 Analysis Results of GO Enrichment

對321種蛋白進行KEGG富集分析.根據P<0.05,KEGG富集共得到14條通路.如圖5所示,其中主要包括自噬、過氧化物酶體、碳代謝、檸檬酸循環(TCA循環)、不匹配修復、抗壞血酸和醛酸代謝、基礎轉錄因子、氨基酸代謝等.

圖5 KEGG富集分析結果Fig.5 Analysis Results of KEGG Enrichment

3 討 論

自噬是細胞中一種進化保守的生物學過程,可以通過降解受損的細胞器和多余的蛋白質使細胞在應激損傷時能夠維持正常的平衡.Hrr25作為壓力應對型激酶在自噬過程中發揮多種作用.為了篩選Hrr25在自噬中的相互作用蛋白,首先構建了可以整合到酵母基因組上的pRS305-Hrr25-(+145～+1482)-13Myc質粒,并使用構建好的質粒構建出表達Hrr25-13Myc蛋白的酵母菌株;待構建好的酵母菌株培養到生長期,分成2組,一組進行饑餓誘導自噬,另一組正常培養;用Myc抗體以Hrr25-13Myc為靶蛋白進行免疫沉淀,將免疫沉淀的樣品進行SDS-PAGE,并用考馬斯亮藍染色后送質譜檢測.

LC-MS/MS結果去除置信度較低的一批蛋白后,檢測發現在非饑餓條件處理菌株中鑒定出1 869種蛋白與Hrr25-13Myc存在相互作用,在饑餓條件處理菌株中鑒定出1 838種蛋白與Hrr25-13Myc存在相互作用.利用韋恩圖找出差異性蛋白321種.對321種差異蛋白質進行GO分析,在生物過程中主要涉及CVT途徑、高爾基囊泡內介導的轉運、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄、糖異生負調控蛋白質轉運,自噬前體結構的蛋白質定位等.其中在CVT途徑中,富集到11種候選蛋白Atg9,Atg27,Atg3,Atg4,Atg11,Cog1,Cog5,Cog6,Cog7,Cog8,Vam7.并且通過KEGG富集分析發現相互作用的蛋白在自噬通路中發揮作用.

在自噬過程中,Atg9是核心Atg蛋白中唯一的跨膜蛋白,可以定位于前自噬結構(pre-autophagosomal structure,PAS)和線粒體附近的外圍結構,以循環轉運方式在自噬體的形成過程中對隔離膜的擴張起著關鍵作用[30],在饑餓時,Atg9可以結合到高爾基復合體和線粒體網近端的外圍結構的一個稱為Atg9囊泡的囊泡中,并且在Atg11,Atg23,Atg27和Atg41的幫助下,Atg9囊泡從外圍結構招募到PAS,作為隔離膜的初始膜源[31].保守寡聚高爾基體(conserved oligomeric Golgi,COG)復合物是一種含有螺旋桿的拴留復合物[32].在饑餓誘導自噬過程中,cog突變體中Atg9在PAS的定位明顯減少,Atg9循環受到影響[33].并且在營養豐富條件下,Cog8可以與激活的Arl3和Arl1相互作用,調節Atg9囊泡從反式高爾基轉移至PAS而參與CVT過程[34].

Atg8脂質化在自噬體的形成中發揮重要作用.Atg8蛋白的C端首先被Atg4家族蛋白酶蛋白水解切割,暴露甘氨酸殘基.Atg8隨后在ATP消耗下轉移到E1樣酶Atg7中的半胱氨酸殘基.從那里,Atg8被轉移到E2樣酶的Atg3,Atg3通過其C端甘氨酸介導Atg8與磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)的頭基的連接形成Atg8-PE[35].Atg8-PE參與自噬體形成的多個步驟,包括隔離膜擴張和閉合.此外,Atg8-PE可以被Atg4裂解將Atg8從膜中釋放出來以供重復使用,并且該反應還可以調節自噬體的形成.以上篩選出的蛋白說明Hrr25可能通過與多種參與自噬的蛋白相互作用而影響自噬的發生.但這些篩選出的候選蛋白是否與Hrr25相互作用影響自噬的發生有待進一步研究.綜上所述,本研究的結果為進一步探究Hrr25在自噬中的調控機制提供新的方向.