耐鹽堿抗鋅菌株的分離鑒定及其特性

王雪琦，范曉丹，張晉璇，韓熠博

（天津城建大學a.環境與市政工程學院；b.天津市水質科學與技術重點實驗室；c.環境與市政級實驗教學示范中心；d.天津市國際聯合研究中心，天津 300384）

隨著工業的快速發展，土壤重金屬污染問題日益突出.土壤重金屬污染是逐漸積累且不可逆的過程，具有隱蔽性、停滯性和破壞性的特點.尤其是土壤中鋅含量過高，不僅會對土壤生態系統產生破壞，也會影響農作物的生長，通過食物鏈危害人體健康[1-2].土壤鹽堿化已是一個世界性的難題，會引起植物資源減少、生物多樣性減少等一系列生態環境問題[3].鹽堿化土壤也面臨重金屬污染的問題，若采取有效的措施來進行治理，可提高土地利用面積，具有重要的現實意義[4].目前，微生物修復技術起步較晚，但由于其廉價且環保，應用潛力較大，已成為重要的重金屬污染修復技術[5]. 微生物修復技術主要通過從污染土壤中分離篩選出高效耐性菌株，對特定的污染物進行去除修復[6-7].

曹禮等[8]在造紙廠排污口分離出一株耐鋅濃度為1 000 mg/L 的菌株HXZ-1，對鋅有較強的抗性和吸附性；Sedlakova-Kadukova 等[9]篩選出一株極耐鋅鏈霉菌K11，并且發現該菌株對鋅積累能力與鋅耐受性有關.但是目前關于鹽堿土壤的抗鋅微生物方面研究還較少，因而篩選耐鹽堿抗鋅性菌株對于推進鹽堿地重金屬污染微生物修復技術的深入發展具有重要意義.

本研究在天津市濱海新區工業廢棄土壤中分離篩選出一株耐鹽堿抗鋅菌，對其進行形態學和分子生物學鑒定，研究該菌株的生長特性及其影響因子，探討菌株的耐鹽堿性，為微生物法修復高鹽堿鋅污染土壤提供理論數據.

1 材料與方法

1.1 土樣采集

土樣采集于天津市濱海新區工業廢棄地，遵循五點采樣法，取土壤放置于無菌袋中，儲存備用.

1.2 培養基

牛肉膏蛋白胨培養基（g/L）：牛肉膏5.0 g、氯化鈉5.0 g、蛋白胨10.0 g、瓊脂20.0 g.

LB 固體培養基（g/L）：胰蛋白胨10.0 g、NaCl 10.0 g、酵母膏5.0 g、瓊脂10～15 g.

馴化培養基：向LB 培養基中加入一定量的ZnSO4溶液，使其Zn2+濃度達到實驗要求.

1.3 土壤重金屬含量和鹽度

土壤pH 值采用國標土壤pH（NY/T 1377—2007）的方法測定；土壤鹽度測定采用土樣和去二氧化碳水按1 ∶5 比例均勻混合，過濾后取上清液水浴加熱，加入（15%）H2O2，直至黃色物質變為白色，放入干燥箱烘干3 h，計算鹽度；土壤樣品采用酸微波消解后用火焰原子吸收光譜儀（型號：SensAA F）測定Zn2+含量.本研究用土壤樣品的部分理化性質如表1 所示，其屬于堿性（7.5～8.5）中鹽漬土（0.5%～1.0%），是天津市特有的鹽堿土，本文在后續抗鋅菌株的分離馴化中重點考慮該土壤的特性.

1.4 耐鋅菌株的分離與馴化

取5 g 土樣置于45 mL 無菌蒸餾水中，振蕩，將振蕩均勻的土壤懸液進行梯度稀釋；分別取10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的稀釋液涂布于含有Zn2+濃度50 mg/L的牛肉膏蛋白胨培養基上；每個梯度設三組平行，在30 ℃恒溫箱中培養，再經接種、純化，將純化后的菌株轉接到LB 固體培養基；并按照（50，200，500，800，1 100，1 500，1 800 mg/L）鋅濃度梯度增加LB 培養基中Zn2+濃度，多次轉接、純化獲得單一菌株，測其對Zn2+最小抑制濃度（MIC）為1 500 mg/L.

1.5 菌株鑒定

（1）形態學觀察. 挑取單菌落放置于顯微鏡下觀察菌落形態.

（2）ITS 基因序列分析. 提取菌株基因組DNA 作為模板，采用購自上海生工公司的Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒（SK8259）操作.使用上游引物ITS1：5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG -3’和下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’進行ITS片段擴增、凝膠電泳和純化回收等步驟；將獲得的ITS序列通過BLAST 程序與GenBank 中核酸數據比對分析進行菌種鑒定.

1.6 菌株生長特性研究

（1）生長曲線的測定.將對照組（Zn2+濃度為50，200，500 mg/L）和空白組（不加Zn）每組設置3 個平行，將菌株活化24 h，按照加菌量5%接種到LB 液體培養基中培養.每隔一定時間用紫外分光光度計測定其OD600值，繪制不同Zn2+濃度下其生長曲線.

（2）環境因子對菌株生長的影響.在不同的溫度、pH 值、鹽度條件下（見表2）恒溫振蕩，每隔一定時間測其OD600值.表2 中每個處理條件設置3 組平行，以未接種的LB 液體培養基作為空白.

表2 菌株生長的環境影響因子

1.7 菌株耐鹽堿性

將分離篩選出的菌株在LB 固體培養基上通過設置不同條件，且30 ℃倒置培養72 h，觀其生長狀況[10].

（1）耐鹽性：調節pH=7.0，NaCl 質量分數分別為1%，2%，2.5%，3.0%，3.5%.

（2）耐堿性：設置NaCl 含量為2%，pH=8，9，10，11，12.

（3）耐鹽堿性：設置三組不用鹽堿度NaCl 為2.5%、pH=10；NaCl 為3.0%、pH=11；NaCl 為3.5%、pH=12.

1.8 菌株對難溶性ZnCO3 的溶解作用

配制LB 液體培養基200 mL，添加難溶性ZnCO3，再挑取菌株進行培養，每隔24 h 取樣，測定上清液中Zn2+含量和pH 值.降堿能力根據下式計算，即

式中：η 為菌株的降堿能力，%；pH前為未加入菌株的培養基初始pH 值；pH后為菌株生長繁殖后的培養基pH 值.

2 結果與分析

2.1 耐鋅菌株的鑒定

2.1.1 形態學鑒定

菌株在LB 平板上30 ℃培養72 h，如圖1a 所示：其菌落較大，呈現乳白色，圓形中間稍有凸起，不透明，有蓬松菌絲縱向蔓延.顯微鏡下如圖1b 所示：菌絲發達，分枝較多；分生孢子梗細長，分生孢子頭為穗球形.菌株在LB 液體培養基中30 ℃、150 r/min 振蕩培養24 h 后，形成黃色菌絲球，直徑在40～80 mm 左右，如圖1c 所示.根據圖1 菌落及菌絲形態初步判斷該菌為霉菌[11].

圖1 菌株形態

2.1.2 ITS 基因序列分析

該菌株的基因片段為525 bp，基因序列通過BLAST 檢索GenBank 中的核酸序列比對，發現該菌株與Fusarium（鐮孢菌屬）的同源性達到100%，通過MEGA軟件構建如圖2 所示的系統發育樹（括號中序號：菌株登錄號），經鑒定為Fusarium incarnatum（半裸鐮孢菌）.

圖2菌株的系統發育樹

2.2 Fusarium incarnatum 的生長特性

2.2.1Fusarium incarnatum生長曲線

Fusarium incarnatum的生長曲線如圖3 所示. 從圖中可以看出：0～12 h 生長比較緩慢，處于適應停滯期，OD600都未達到0.2；12 h 開始增速生長，在24～48 h生長和繁殖速度最快，處于對數增長期，其OD600均可達到2.0 以上；48 h 開始變得緩慢且最終趨于穩定生長，繼續培養，逐步進入衰亡期. 從圖中也可以發現，隨著培養基中Zn2+濃度的增加，Fusarium incarnatum的生長速度變緩，生物量有所降低，表明Zn2+對菌株生長有一定的抑制作用，在500 mg/L Zn2+時生長速度最慢，但OD600值在48 h 都可達到2.0 以上，仍能正常生長，說明Fusarium incarnatum對Zn2+有一定的抗性.研究表明，菌株的生長周期對吸附效果有一定的影響[12-13]. 經試驗，處于對數生長期的菌株通過處理后吸附的效果明顯高于其他時期. 結合生長曲線可知，實驗中所需菌株培養到48 h 可以達到最佳的處理效果.

圖3 Fusarium incarnatum 生長曲線

2.2.2 環境因子對Fusarium incarnatum生長的影響

溫度對微生物生長的影響如由圖4a 所示.隨著溫度的升高，Fusarium incarnatum生長速率呈先增后減的趨勢，在15 ℃時生長繁殖速度最慢，其OD600值相較于其他溫度都低；隨著溫度的升高，Fusarium incarnatum生長繁殖速度變快，主要體現在對數生長期，呈現出先增加后減少的趨勢；在30 ℃時到達最大生長量，24 h左右OD600值就可達到2.0，而在溫度繼續增加到35 ℃時，生長速率開始變慢，說明30℃是Fusariumincarnatum最適生長溫度[14].

圖4 不同環境因子對Fusarium incarnatum 生長的影響

在30 ℃條件下，圖4b 和4c 是pH 和鹽度對Fusarium incarnatum生長狀態的影響.

pH 值對Fusarium incarnatum的生長速率影響如圖4b 所示：其波動范圍不是很大而且適應范圍較寬，pH 值在4～5 時，生長速率慢，對菌株Fusariumincarnatum的繁殖和代謝方式有一定的抑制作用；pH =6 時生長速率較快；在pH=7 時生長速率最大，而隨著pH值的繼續增加，生長速率開始變得緩慢，但在pH 值在8～9 的范圍時Fusarium incarnatum仍能正常生長，在30 h 時OD600值可以達到2.0 左右，說明Fusarium incarnatum在堿性條件下也能很好的生長.

影響Fusarium incarnatum生長的另一因素鹽度如圖4c 所示.作為微生物生長的必需元素，Cl-的濃度影響菌株的新陳代謝，從圖中可知，隨著鹽度的增加，Fusarium incarnatum的生長速率變慢，鹽度在5～10 g/L時生長速率最快，24 h 其OD600值可以達到1.8 以上.鹽度在15～40 g/L 的范圍時，生長速率相對緩慢，但波動不大，只是生長周期有所延緩.鹽度在40 g/L 仍能較好的生長，證明Fusarium incarnatum 對鹽度有一定耐性.鹽度過低會抑制生長，過高會使細胞因失水而死亡，使菌株的生長受到抑制[15].

綜上所述，Fusarium incarnatum的最適生長溫度、pH 值和鹽度分別為30 ℃、pH = 7 和10 g/L，并且Fusarium incarnatum表現出了很高的耐鹽堿性，這對處理特定的高鹽堿地重金屬Zn 污染有一定的優勢.

2.3 Fusarium incarnatum 耐鹽堿性分析

在生長因素影響實驗中，Fusarium incarnatum表現出了很高的耐鹽堿性. 表3 是Fusarium incarnatum在高鹽堿性條件下生長狀況，從中可以看出，Fusarium incarnatum在鹽度1.0%～3.0%之間都能較好的生長，培養3～5 d 時LB 固體培養基上能夠看到明顯的菌落，在鹽度3.5%時仍能正常生長；pH 值在8.0～10.0 范圍內同樣能夠有良好的長勢；當pH=11.0 和pH=12.0時也能正常生長，培養基上有菌落長出.這與張建等[16]研究結果一致. 在pH = 10，2.5%NaCl 的培養基中，菌株生長良好；pH = 11，3.0%NaCl 條件下生長正常；而pH = 12，3.5%NaCl 時生長困難，菌落生長速度變慢，5 d 時培養基上只長出了很小的菌體，但仍然夠生長，說明Fusarium incarnatum對高鹽堿有一定的耐受性.

表3 Fusarium incarnatum 耐鹽堿性

2.4 菌株溶解性與降堿性分析

一般地，鹽堿地土壤中碳酸鋅含量較高，不利于菌株Fusarium incarnatum對Zn2+的吸附去除，菌株對難溶性ZnCO3的促溶作用實驗如圖5 所示. 結果表明，隨著菌株培養時間的延長，培養基中Zn2+含量逐漸增加，同時pH 值也有所降低，說明該菌株對難溶性ZnCO3有較好的活化效應.培養2 d 左右，培養基中的可溶性鋅含量大幅增加，pH 值也從開始的8.2 降到6.51，這和菌株的生長周期是相對應的，在對數生長期，菌株生長繁殖能力快，代謝能力強，培養液中可溶性鋅含量增加.從2～7 d 開始，培養液中可溶性鋅含量增速變得緩慢，最終達到60.58%；pH 值開始稍有變大，7 d 時穩定在6.91 左右，但仍然處于酸性到中性的環境.菌株的降堿性有利于其對難溶鋅的促溶作用[17-18]，將難溶態轉化為可溶態，有利于后續菌株的吸附去除.

圖5 Fusarium incarnatum 溶解性與降堿性

3 結 論

（1）通過梯度馴化篩選出一株耐鹽堿地耐鋅微生物，經形態學和ITS 序列分析鑒定屬于Fusarium incarnatum（半裸鐮孢菌）.

（2）Fusarium incarnatum對Zn2+的最小抑制濃度為1 500 mg/L.其生長最適條件為：溫度為30 ℃；pH 值為7；NaCl 質量分數為10%.

（3）Fusarium incarnatum耐鹽堿性達到3.5%NaCl，pH=12.能夠使含難溶性ZnCO3的培養基中可溶性鋅含量增加60.58%，有利于在鹽堿地對堿式鋅的活化，提高生物可利用性，同時可以降低溶液的pH 值，有利于對難溶性ZnCO3的促溶作用.