群體感應淬滅酶AiiO的克隆表達及其發酵工藝優化

田 唱, 郭 婉 萍, 陳 陽, 趙 晶, 陳 明

( 1.大連工業大學 生物工程學院, 遼寧 大連 116034;2.大連民族大學 生命科學學院, 遼寧 大連 116600 )

0 引 言

?；呓z氨酸內酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)是革蘭氏陰性菌群體感應系統(Quorum sensing,QS)中廣泛存在的一種信號分子,當AHLs濃度超過一定閾值時,能夠與相應的受體蛋白結合,進而調控多種生理功能,如毒力基因的表達、生物膜的形成等[1]。群體感應淬滅酶能夠通過酶促反應降解信號分子AHLs,保持信號分子濃度低于閾值,進而有效干擾細菌的QS系統,抑制病原菌的致病性[2-3]。目前,已經有很多群體感應淬滅酶被分離鑒定,高絲氨酸內酯酶和?；甘侨后w感應淬滅酶中重要的兩類。群體感應淬滅酶作為一種研究最多也是最有效的淬滅途徑,在克隆表達[4]、分離純化[5]、酶學性質[6]、作用機理[7]、抗菌活性[8]、工業應用[9]等方面研究成果豐富。AiiO酶于蒼白桿菌Ochrobactrumsp. A44中被發現[10],屬于AHL?；钢械摩?β水解酶折疊酶系[4],能夠降解?；鶄孺滈L度為4～14的AHLs及其相應的3OH-Cx-HSLs[11]。國內外對AiiO酶的相關報道比較少,高效表達AHL?；窤iiO有利于后續的病原菌防控制劑開發及其在致病菌中的應用研究。目前,常規表達外源蛋白的方法是利用大腸桿菌表達系統和IPTG誘導的方式。但是,課題組前期采用這種方式誘導表達AiiO可溶性表達量很低,無法滿足后續研究的需要。

乳糖是乳糖操縱子的天然誘導劑,相較于常用的IPTG誘導劑昂貴的價格和潛在的毒性,在工業化生產中更加具有應用前景。林曉栩等[12]利用乳糖誘導重組環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)表達,胞外酶活達19.87 U/mL。

本研究利用構建的重組工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO進行乳糖自誘導發酵,并對該發酵過程中誘導溫度、氮源濃度、乳糖添加時機和乳糖濃度等因素進行優化,以期提高目的蛋白AiiO的表達量。

1 材料與方法

1.1 菌種及質粒

小麥蒼白桿菌(Ochrobactrumtritici)、質粒pET-28a,本實驗室保存;大腸桿菌E.coliDH5α、BL21(DE3),北京全式金生物技術有限公司。

1.2 培養基

LB液體培養基(g/L):蛋白胨10,酵母提取物5,氯化鈉10。

高密度增殖培養基(g/L):葡萄糖5,磷酸氫二鈉3.55,磷酸二氫鉀3.40,氯化銨2.68,硫酸鈉0.71,七水合硫酸鎂0.50,檸檬酸三鈉0.30,六水合琥珀酸鈉2.50、三氯化鐵(0.1 mol/L) 1 mL。

復合自誘導培養基(g/L):蛋白胨(T)10,酵母粉(Y)5,甘油26,乳糖2,磷酸氫二鈉3.56,磷酸二氫鉀3.40,氯化銨2.68,硫酸鈉0.71,七水合硫酸鎂0.50,葡萄糖0.50,檸檬酸三鈉0.30,六水合琥珀酸鈉5.40,三氯化鐵(0.1 mol/L) 1 mL。

1.3 重組表達載體pET-28a(+)-aiiO的構建

根據GeneBank中公布AiiO蛋白的基因堿基序列,以及載體pET-28a(+)中的多克隆酶切位點,利用NCBI設計上下游引物,引物序列分別為F:5′-GGGAATTCCATATGATGAAATCCC ATGAAAT-3′(下劃線處為NdeI位點);R:5′-C GGAATTCTTAAGCCGTGCAGTC-3′(下劃線處為EcoRI位點)。提取O.tritici基因組,以此為模板擴增aiiO(810 bp),采用酶切酶連的方法將擴增產物與pET-28a載體連接。將連接產物化學轉化E.coliDH5α感受態細胞,挑取陽性重組子,對重組質粒pET-28a(+)-aiiO進行雙酶切驗證。選取驗證正確的重組質粒送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 重組蛋白AiiO的誘導表達及發酵條件優化

將測序正確的重組質粒pET-28a(+)-aiiO轉化到E.coliBL21(DE3),接種于高密度增殖培養基(含50 μg/mL卡那霉素)中,37 ℃、180 r/min過夜活化后按照0.1%接種量轉接于復合自誘導培養基,37 ℃、250 r/min條件下培養。

采用單因素試驗依次對發酵過程中誘導溫度、氮源濃度、乳糖添加時機和乳糖濃度進行優化,比較發酵過程中甘油消耗、菌體干重、AiiO表達量,確定最優發酵條件。

1.5 重組蛋白AiiO的純化

收集菌液,4 ℃、6 000 r/min離心15 min,將收集的菌體懸浮于Tris-HCl緩沖液中進行超聲破碎,功率40%,工作2 s停3 s,共破碎40 s,再于4 ℃、13 000 r/min離心30 min,收集上清液。對收集的上清液進行親和層析純化、10 U/mg 凝血酶20 ℃水浴過夜酶切、凝膠過濾層析。

1.6 分析方法

1.6.1 甘油消耗量

取1 mL發酵液,6 000 r/min離心15 min,收集上清液,0.22 μm無菌濾膜過濾后的清液作為樣品,選用北京普利萊基因技術有限公司的甘油測定試劑盒對甘油質量濃度進行測定。

1.6.2 菌體干重

取50 mL發酵液,4 ℃、6 000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀用Tris-HCl緩沖液洗滌兩次,80 ℃烘干至質量穩定,記錄菌體干重。

1.6.3 目的蛋白AiiO含量

對細胞破碎液全蛋白和其離心后上清液進行SDS-PAGE檢測。以已純化且已知濃度的AiiO為標準上樣,利用Quantity One軟件對電泳圖進行分析,計算目的蛋白含量。

2 結果與討論

2.1 重組表達載體及工程菌的構建

將PCR擴增得到的目的基因aiiO(810 bp)切膠純化后,用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果如圖1(a)所示。在750～1 000 bp存在單一條帶,其大小與理論值相符,表明aiiO基因擴增成功。連接后的質粒經雙酶切電泳驗證,結果如圖1(b)所示,在5 369和810 bp附近各有一條酶切條帶,符合載體pET-28a(+)和目的基因aiiO的大小,初步判斷為陽性克隆,送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將測序正確的質粒導入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中,成功構建重組工程菌E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO。

(a) PCR擴增目的基因

2.2 培養條件的優化

2.2.1 誘導溫度

菌體轉接至復合自誘導培養基,37 ℃培養2～3 h,OD600在0.6～0.8,分別于20、25、30 ℃進行誘導培養。由圖2(a)可知,在誘導溫度30 ℃時,0～8 h內甘油消耗較快,誘導結束時菌體干重最大。但在30 ℃條件下,胞內可溶性目的蛋白AiiO濃度極低,可能是因為菌體生長過快,導致包涵體的形成。20 ℃的低溫誘導條件下雖然有利于肽鏈的正確折疊,但由于菌體生長緩慢,最終胞內可溶性AiiO濃度也較低。25 ℃培養菌體誘導產酶,胞內可溶性目的蛋白AiiO產量最高,因此選擇25 ℃為最適誘導溫度。

(a) 誘導溫度

2.2.2 初始氮源質量濃度

利用不同質量濃度氮源(T 10 g/L+Y 5 g/L,T 15 g/L+Y 7.5 g/L,T 20 g/L+Y 10 g/L)的復合自誘導培養基,37 ℃培養菌體OD600為0.6～0.8,25 ℃進行誘導,至OD600趨于穩定。由圖2(b)可以看出,在氮源質量濃度選擇T 20 g/L+Y 10 g/L時,菌體干重高于其他,同時甘油消耗量也最大。由表1可知,隨著氮源質量濃度的增大,胞內可溶蛋白AiiO產量隨之增加,在T 20 g/L+Y 10 g/L條件下,胞內可溶性AiiO產量最高,達到276.04 mg/L。因此,選取T 20 g/L+Y 10 g/L為最適氮源質量濃度。

表1 不同條件下發酵產AiiO蛋白結果

2.2.3 添加乳糖誘導時機

選擇T 20 g/L+Y 10 g/L復合自誘導培養基,37 ℃培養菌體OD600為0.6～0.8,25 ℃繼續培養,分別在發酵初始、對數前期(6 h)、對數中期(8 h)添加2 g/L乳糖誘導產AiiO。由圖2(c)和表1可知,在菌體生長的對數中期添加乳糖,基本不能起到誘導作用;在對數前期添加乳糖,雖然在細胞破碎后的全蛋白中檢測到較高濃度的AiiO,但胞內可溶性AiiO濃度很低。在發酵初始添加乳糖,胞內可溶性AiiO產量最高,說明乳糖最佳添加時機為發酵初始時。

2.2.4 乳糖添加量

在氮源選擇T 20 g/L+Y 10 g/L、發酵初始添加誘導物乳糖、誘導溫度25 ℃的優化條件下,考察不同乳糖添加量(2.0、5.0、7.5、10.0 g/L)對重組菌株發酵產目的蛋白AiiO的影響,結果見圖2(d)和表1?？梢钥闯?不同的乳糖添加量對重組菌株E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO甘油消耗和菌體細胞生長的影響較小,4種乳糖添加量下甘油消耗和菌體干重變化趨勢基本一致,說明重組菌株優先利用復合自誘導培養基中甘油、蛋白胨和酵母粉等碳氮源,乳糖作為一種不易被利用的碳源,其添加量多少對甘油消耗及菌體細胞生長基本沒有影響。由表1可見,4種乳糖添加量下,細胞內可溶性目的蛋白AiiO(上清)產量表現出較大差異,乳糖添加量為5 g/L時,胞內可溶性AiiO產量最高,達到374.26 mg/L,明顯高于其他3種。因此,選取誘導物乳糖的適宜添加量為5 g/L。

3 結 論

以常規誘導劑IPTG誘導重組菌株E.coliBL21(DE3)-pET-28a(+)-aiiO產AiiO蛋白,可溶性表達量極低。采用乳糖代替 IPTG為誘導劑,從誘導溫度、氮源濃度、乳糖添加時機和乳糖添加量等4個方面進行優化。結果發現,相較于IPTG,以乳糖為誘導劑顯著提高了AiiO蛋白的可溶性表達,在誘導溫度25 ℃、氮源為20 g/L蛋白胨和10 g/L酵母粉、發酵初始添加5 g/L乳糖條件下,胞內可溶性目的蛋白AiiO產量達到374.26 mg/L,占胞內總目的蛋白的52.72%。