circ_0038467靶向miR-495/NF-κB通路調控血管緊張素Ⅱ誘導的心肌細胞損傷*

雷 蕾, 夏桂玲, 李 璐, 胡鱗方, 袁 露, 楊 輝

貴州省人民醫院 1干部醫療科/老年醫學科 2藥劑科,貴陽 550002

急性心肌梗死等缺血性心肌病具有高發病率與高死亡率,嚴重威脅患者生命安全。心肌細胞損傷、心室重構等均可能引起急性心肌梗死[1-2]。環狀RNA(circular RNA,circRNA)屬于新型的非編碼RNA,由前體mRNA反向剪接生成共價閉環結構,其與線性RNA不同,它具有穩定的結構不易被RNase R降解。研究表明circRNA與急性心肌梗死等多種心血管疾病有關[3-4]。circ_0038467在脂多糖(LPS)誘導的人胚肺成纖維細胞損傷中表達上調,沉默其表達可抑制LPS誘導的人胚肺成纖維細胞凋亡和炎癥反應[5]。但circ_0038467與急性心肌梗死等心血管疾病的相關報道相對較少。生物信息學分析顯示miR-495是circ_0038467的潛在靶點。研究表明miR-495過表達可抑制LPS誘導的人胚肺成纖維細胞凋亡[6]。但關于miR-495對血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)誘導心肌細胞損傷的影響研究較少。此外,抑制NF-κB信號通路可緩解急性心肌梗死的發展進程[7]。同時,miR-495已經被證實參與一些人類疾病中NF-κB信號的調控[8-9]。因此,本研究通過對大鼠心肌細胞H9C2進行AngⅡ誘導建立心肌細胞損傷模型,探究circ_0038467調控miR-495/NF-κB對AngⅡ誘導的心肌細胞損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠心肌細胞H9C2購自武漢普諾賽生命科技有限公司;AngⅡ購自上海酶聯生物科技有限公司;Trizol試劑購自賽默飛世爾科技公司;Lipofectamine2000、反轉錄及熒光定量PCR試劑購自北京百奧萊博科技有限公司;si-NC、anti-miR-NC、si-circ_0038467、miR-NC、anti-miR-495、miR-495 mimics購自廣州銳博生物公司;pcDNA、pcDNA-circ_0038467購自上海吉瑪制藥公司;雙熒光素酶報告基因載體及其活性檢測試劑盒購自美國Promega公司;LDH、MDA、SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;細胞凋亡、兔抗鼠cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bcl-2、p-P65、P65、p-IκBα及IκBα蛋白抗體購自武漢艾美捷科技公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 AngⅡ組:在濃度為1 μmol/L的DMEM培養液中培養H9C2細胞,培養時間為24 h[10];Con組:正常培養的H9C2細胞。采用脂質體轉染法將si-circ_0038467、miR-NC、si-NC、miR-495 mimics依次轉染H9C2細胞,在轉染成功的H9C2細胞內加入濃度為1 μmol/L AngⅡ的DMEM培養液培養24 h,并記為AngⅡ+si-NC組、AngⅡ+si-circ_0038467組、AngⅡ+miR-NC組、AngⅡ+miR-495組。采用脂質體轉染法將si-circ_0038467和anti-miR-NC、si-circ_0038467和anti-miR-495依次轉染H9C2細胞,在濃度為1 μmol/L AngⅡ的DMEM培養液中培養轉染成功的H9C2細胞24 h,并記為AngⅡ+si+anti-miR-NC組、AngⅡ+si+anti-miR-495組。

1.2.2 采用qRT-PCR方法對circ_0038467、miR-495進行檢測 利用Trizol試劑提取各組H9C2細胞總RNA,在42℃15 min,95℃3 min的反應條件下反轉錄,并加入RNase-Free ddH2O補足至20μL;按照qRT-PCR試劑盒說明進行擴增,反應條件為95℃ 20 s,60℃ 30 s;72℃ 30 s,共40個循環。相對表達量用2-ΔΔCt法計算。

1.2.3 MDA水平、LDH、SOD活性檢測 收集各組H9C2細胞培養液上清,采用試劑盒檢測LDH的活性;在H9C2細胞加入RIPA裂解液后,采用試劑盒檢測MDA水平及SOD的活性。

1.2.4 流式細胞術 細胞分組培養48 h,收集后加入PBS沖洗,再加入結合緩沖液進行重懸,按照說明書中的指示先后加入10 μL的Annexin Ⅴ-FITC和PI 5 μL,再按照說明書中的溫度要求進行避光染色,15 min后上流式細胞儀,檢測細胞凋亡率。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因實驗 Circinteractome預測circ_0038467與miR-495的靶向結合區域,合成野生型載體Wt-circ_0038467和缺失miR-495結合區域的突變型載體Mut-circ_0038467,采用脂質體轉染法用miR-NC或miR-495對H9C2細胞進行轉染,培養箱中孵育24 h,熒光素酶試劑盒測定基因熒光強度。

1.2.6 蛋白表達水平檢測 RIPA裂解液提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。蛋白經SDS-PAGE、轉膜、封閉后,加入稀釋的一抗4℃孵育過夜,加入按照1∶3000稀釋的HRP標記的二抗,室溫搖床孵育2 h,ECL顯色,暗室下X線膠片顯影、定影。Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 circ_0038467和miR-495在血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞損傷中的表達

AngⅡ組circ_0038467水平為(2.82±0.23),相較于Con組,AngⅡ組circ_0038467水平顯著升高(P<0.05);AngⅡ組miR-495水平為(0.34±0.03),相較于Con組,AngⅡ組水平(0.34±0.03)顯著降低(P<0.05)。

2.2 干擾circ_0038467表達對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞氧化應激的影響

與Con組比較,AngⅡ組LDH的活性和MDA水平升高(均P<0.05),SOD活性降低(P<0.05);與AngⅡ+si-NC組比較,AngⅡ+si-circ_0038467組LDH的活性和MDA的水平降低(均P<0.05),SOD的活性升高(P<0.05),見表1。

表1 干擾circ_0038467表達對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞氧化應激的影響

2.3 干擾circ_0038467表達對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞凋亡的影響

AngⅡ組細胞凋亡率、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-9蛋白水平較Con組升高(均P<0.05),Bcl-2蛋白水平較Con組降低(P<0.05);AngⅡ+si-circ_0038467組細胞凋亡率較AngⅡ+si-NC組降低,cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9表達也降低,,Bcl-2蛋白水平則升高(均P<0.05),見圖1、表2。

A:凋亡相關蛋白表達;B:細胞凋亡流式圖;1:Con組;2:AngⅡ組;3:AngⅡ+si-NC組;4:AngⅡ+si-circ_0038467組

表2 干擾circ_0038467表達對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞凋亡的影響

2.4 circ_0038467對miR-495表達的調控作用

圖2顯示circ_0038467與miR-495之間的結合位點。miR-495高表達能夠抑制野生型載體Wt-circ_0038467的熒光素酶活性(0.58±0.05vs.1.05±0.09,P<0.05)。pcDNA-circ_0038467組miR-495的表達低于pcDNA組(0.44±0.04vs.1.00±0.00,P<0.05);si-circ_0038467組miR-495的表達高于si-NC組(2.86±0.24vs.0.98±0.06,P<0.05)。

圖2 miR-495與circ_0038467之間結合位點

2.5 miR-495過表達對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞損傷的影響

與AngⅡ+miR-NC組比較,AngⅡ+miR-495組LDH的活性和MDA的水平降低(均P<0.05),SOD的活性升高,細胞凋亡率和cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高(均P<0.05),見圖3、表3。

A:凋亡相關蛋白表達;B:細胞凋亡流式圖;1:AngⅡ+miR-NC組;2:AngⅡ+miR-495組

表3 miR-495過表達對AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激的影響

2.6 下調miR-495表達可逆轉circ_0038467敲除對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞凋亡和氧化應激的影響

與AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-NC組比較,AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-495組LDH的活性、MDA水平、細胞凋亡率、cleaved Caspase-3及cleaved Caspase-9蛋白水平均明顯提高(均P<0.05),但Bcl-2蛋白和SOD的活性降低(均P<0.05),見圖4、表4。

A:凋亡相關蛋白表達;B:細胞凋亡流式圖;1:AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-NC組;2:AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-495組

表4 下調miR-495表達可逆轉circ_0038467敲除對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞凋亡和氧化應激的影響

2.7 下調miR-495可逆轉干擾circ_0038467對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞NF-κB信號通路的影響

與AngⅡ+si-NC組比較,AngⅡ+si-circ_0038467組p-P65及p-IκBα蛋白水平降低(均P<0.05);AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-495組p-P65及p-IκBα蛋白水平較AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-NC組升高(均P<0.05),見圖5、表5。

1:AngⅡ+si-NC組;2:AngⅡ+si-circ_0038467組;3:AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-NC組;4:AngⅡ+si-circ_0038467+anti-miR-495組

表5 下調miR-495可逆轉干擾circ_0038467對血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞NF-κB信號通路的影響

3 討論

AngⅡ可誘導心肌細胞氧化應激等反應,從而加重心肌細胞損傷,而circRNA異常表達可參與心血管疾病發生及發展[11-12]。circRNA具有穩定性與組織特異性,其廣泛存在于真核生物體內,并可通過調節miRNA/mRNA表達對心肌細胞的活力及凋亡進行調控,可作為治療心血管疾病的新型靶點[13-14]。

先前的研究表明降低circ_0038467的表達能夠削弱LPS對支氣管上皮細胞的損傷[15]。circ_0038467可促進PM2.5誘導的支氣管上皮細胞損傷[16]。本研究發現在AngⅡ誘導的心肌細胞中circ_0038467表達升高,提示circ_0038467可能參與心血管疾病發生過程。研究表明心肌細胞損傷時抗氧化能力減弱,LDH、MDA的水平升高,而SOD的活性降低,并可加重心肌組織損傷[17]。本研究顯示,在AngⅡ誘導的心肌細胞中,干擾circ_0038467表達可降低LDH的活性和MDA的水平,提升SOD活性,表明下調circ_0038467表達對AngⅡ誘導的心肌細胞氧化應激具有抑制作用。此外,心肌細胞凋亡率和cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9蛋白水平經AngⅡ作用后均顯著提升,與楊麗紅等[18]研究結果相符,而干擾circ_0038467表達可抑制AngⅡ誘導的心肌細胞凋亡。

miRNA和circRNA的相互作用是探索circRNA生物學功能的基礎之一。目前的研究已經發現一些circRNA可以作為miRNA的海綿調節各靶基因的表達,從而參與心血管疾病的發生及發展過程。在本次實驗中,我們發現circ_0038467直接結合miR-495并負調控其表達,提示circ_0038467可能通過靶向miR-495促進心血管疾病。早期的研究表明miR-495可減輕冠心病導致的內皮細胞炎癥損傷[19]。miR-495通過抑制NLRP3炎癥小體信號通路而抑制心臟微血管內皮細胞炎癥反應從而減輕細胞損傷[20]。本研究結果表明,AngⅡ誘導組miR-495呈現低表達,其過表達會抑制心肌細胞氧化應激及細胞凋亡。由于過表達miR-495和干擾circ_0038467表達對AngⅡ誘導的心肌細胞損傷的抑制作用一致,且下調circ_0038467表達,提高miR-495的表達水平,這進一步證實circ_0038467可通過靶向miR-495參與AngⅡ誘導的心肌細胞損傷。此外,NF-κB通路在細胞生長發育、炎癥、免疫和生存等多種生物學過程中發揮著重要作用,并參與了心肌細胞AC16細胞的缺血再灌注損傷[21-22]。抑制NF-κB信號通路可降低心肌細胞凋亡水平,保護心肌細胞免受外界刺激誘導的心肌損傷[23]。本研究證實了干擾circ_0038467可通靶向miR-495抑制NF-κB信號通路的激活,從而抑制血管緊張素Ⅱ誘導心肌細胞損傷。

綜上所述,AngⅡ誘導的心肌細胞中circ_0038467呈現高表達,而miR-495呈現低表達,circ_0038467可靶向調控miR-495的表達,干擾circ_0038467表達可通過靶向促進miR-495表達介導NF-κB信號通路,從而對AngⅡ誘導的心肌細胞氧化應激及細胞凋亡具有抑制作用,進而降低細胞損傷。circ_0038467可能作為心血管疾病治療的潛在靶點,但其具體作用機制尚需進一步探究。