萊菔硫烷對糖尿病視網膜病變Nrf2通路和NLRP3炎性小體的影響①

王櫻鑾,宿星杰,張 劍,齊艷秀

(佳木斯大學附屬第一醫院眼科,黑龍江 佳木斯 154003)

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy,DR)的發病機制復雜,慢性炎癥是DR的病理學基礎,研究[1]顯示,在糖尿病動物的視網膜和玻璃體中,均檢測到炎癥相關因子如白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-18(IL-18)等異常增加。核苷酸結合寡聚化結構棫樣受體3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)通過介導caspase-1催化激活,裂解和釋放IL-1β和IL-18誘導炎癥,高糖狀態下ROS表達增加,激活caspase-1及NLRP3炎性小體,進而使IL-1β活化[2]。核因子E2相關因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)是在氧化應激和炎癥相關組織損傷中具有重要作用的氧化還原敏感轉錄因子,是維持細胞氧化還原平衡的重要因子,Nrf2敲除的糖尿病鼠ROS顯著增加,谷胱甘肽(glutathione,GSH)顯著減少,早發血-視網膜屏障功能障礙,視覺障礙加重[3]。萊菔硫烷(sulforaphane,SFN)是可使用的異硫氰酸鹽,在缺血再灌注動物模型的研究顯示,SFN可快速上調Nrf及受其調控的抗氧化基因酶表達,但SFN是否可通過Nrf/NLRP3/IL-1β途徑調控DR的進程目前較少見報道[4]。本研究觀察SFN對糖尿病大鼠Nrf/NLRP3/IL-1β通路的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性健康SD大鼠72只,體質量200～250g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物合格證號:SCXK-京-2019-0087,動物在標準條件下置于塑料籠中飼養,光/暗循環12h,溫度21℃,濕度控制在55%,自由攝食和飲水。

1.2 主要試劑

高脂飼料購于上海睿安生物科技有限公司;鏈脲佐菌素(STZ)購于上海如吉生物科技發展有限公司;SFN購于上海瀚香生物科技有限公司;羥苯磺酸鈣購于江蘇萬高藥業股份有限公司,國藥準字H20080288,規格:0.25g;HE染色試劑盒購于北京酷來搏科技有限公司;IL-1β、IL-18酶聯免疫吸附法試劑盒購于北京華夏遠洋科技有限公司;丙二醛(malondialdehyde,MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購于碧云天;Tirzol購于上海源葉生物科技有限公司;逆轉錄試劑盒購于美國GeneCopoeia;Nrf2、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)、NLRP3、凋亡相關點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase-1)、硫氧還蛋白互作蛋白(thioredoxin interacting protein,TXNIP)一抗購于Abcam中國。

1.3 動物分組和干預

隨機抽取12只SD大鼠作為空白對照組(blank control group, BC組),剩余60只SD大鼠用于動物造模。造模組大鼠高脂飼料喂養2周后腹腔注射35mg·kg-1的STZ,3d后,禁食不禁水12h檢測空腹血糖(FPG)>11.1mmol/L即為造模成功。共52組造模成功的大鼠隨機分為模型組(model group,M組)、陽性對照組(positive contorl group, PC組)、SFN低劑量組(SFN low dose group, SLD組)和SFN高劑量組(SFN high dose group,SHD組),每組13只。SLD組給予SFN 25mg/kg腹腔注射,SHD組給予SFN 50mg/kg腹腔注射,PC組給予羥苯磺酸鈣溶液1.0/kg腹腔灌注,BC組和M組給予等量生理鹽水腹腔注射。連續治療6周。

1.4 HE染色觀察大鼠視網膜組織形態表現

實驗結束后,分離得到大鼠視網膜,部分視網膜固定于4%多聚甲醛中,HE染色后鏡下觀察大鼠視網膜組織形態 。

1.5 檢測大鼠視網膜組織炎性因子和氧化還原指標水平

實驗結束后,取部分視網膜組織,制作組織勻漿,采用酶聯免疫吸附法檢測各組大鼠IL-1β、TNF-α水平,采用硫代巴比妥酸法檢測MDA水平,采用黃嘌呤氧化酶法檢測SOD水平。

1.6 采用qRT-PCR法檢測大鼠視網膜中Nrf2-2、HO-1mRNA水平表達

實驗結束后,取大鼠視網膜組織,機械勻漿后,用Trizol提取總RNA,參照逆轉錄試劑盒說明書以RNA為模板逆轉錄合成cDNA,采用CFX96 real-time PCR Detetion System對cDNA進行PCR擴增,反應條件:95℃30s,95℃5s,60℃30s,共39個循環,以β-actin為內參,采用2-ΔΔCT法對Nrf-2、HO-1mRNA檢測結果進行定量分析。引物序列:Nrf2:上游:5’-TTTGGGAATGTGGGCAAC-3’,下游:5’-GAGAATTCCTCCCAATTCAGC-3’;HO-1:上游:5’-AGCGAAACAAGCAGAACCCA-3’,下游:5’-GCCACCAGCAGCTCAGGATG-3’。

1.7 采用Wester blot法檢測蛋白表達水平

取部分視網膜組織,加入裂解液提取總蛋白,進行蛋白濃度檢測后,進行SDS-PAGE蛋白電泳分離蛋白,轉膜,洗滌3次,加脫脂牛奶封閉1h,加入Nrf2(1:1000)、HO-1(1:1000)、NLRP3(1:1000)、ASC(1:1000)、caspase-1(1:1000)、TXNIP(1:1000)一抗,室溫孵育過夜,次日采用TBST洗滌3次后加入相應的二抗,室溫下孵育1h,應用TBST進行3次洗膜,ECL發光進行顯影并采集圖像,以β-actin為內參,計算相應蛋白的相對表達量。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色觀察視網膜組織形態表現

光鏡檢查結果顯示,BC組大鼠視網膜組織結構清晰,未見明顯病理改變;M組大鼠視網膜細胞排列疏松,內外核層拋離紊亂,細胞水腫明顯;PC組、SLD和SHD組視網膜結構較M組清晰,細胞水腫明顯減少;SHD組改善較PC組和SLD組更為明顯,見圖1。

圖1 HE染色觀察視網膜組織形態表現(×200,A:BC組,B:M組,C:PC組,D:SLD組,E:SHD組)

2.2 各組大鼠視網膜炎癥因子和氧化應激指標相比較

M組MDA、IL-1β、TNF-α水平顯著高于BC組(P<0.05),SOD水平低于BC組(P<0.05);PC組和SLD組MDA、IL-1β、TNF-α水平低于M組(P<0.05),SOD水平高于M組(P<0.05);SHD組MDA、IL-1β、TNF-α水平低于M組、PC組和SLD組(P<0.05),SOD水平高于M組、PC組和SLD組(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠視網膜炎癥因子和氧化應激指標相比較

2.3 各組大鼠視網膜Nrf2和HO-1 mRNA表達水平相比較

M組Nrf2和HO-1 mRNA表達水平低于BC組(P<0.05),PC組和SLD組Nrf2和HO-1mRNA表達水平高于M組(P<0.05),SHD組Nrf2和HO-1mRNA表達水平高于PC組和SLD組(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠視網膜Nrf2和HO-1 mRNA表達水平相比較

2.4 各組大鼠視網膜Nrf2、HO-1和NLRP3相關蛋白表達水平相比較

M組大鼠視網膜Nrf2、HO-1水平低于BC組(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1、TXNIP水平高于BC組(P<0.05);PC組和SLD組Nrf2、HO-1水平高于M組,NLRP3、ASC、caspase-1、TXNIP水平低于M組(P<0.05);SHD組Nrf2、HO-1水平高于PC組和SLD組(P<0.05),NLRP3、ASC、caspase-1、TXNIP水平低于PC組和SLD組(P<0.05),見表3和圖2。

表3 各組大鼠視網膜Nrf2、HO-1和NLRP3相關蛋白表達水平相比較

圖2 各組大鼠視網膜Nrf2、HO-1和NLRP3相關蛋白表達水平

3 討論

隨著糖尿病人群的增加和人均預期壽命的延長,糖尿病并發癥發病率和發病人數逐年增加[1]。預計到2030年,全球糖尿病患者總數將從2000年的1.71億增加到3.66億,成為全球健康的主要威脅之一。是糖尿病最常見和最嚴重的并發癥之一,初級階段患者可無明顯癥狀,一旦視覺出現問題,其進程幾乎不可逆轉,是導致失明的常見原因[2]。研究[3]顯示,中國糖尿病人群DR患病率達43%,其中6.3%的患者視力受到威脅,增殖性DR對視力危害尤其嚴重,5年內未經正規治療的DR患者約一半發展為永久視力喪失。幾乎所有的1型糖尿病和超過60%的2型糖尿病在20年后均會發生不同程度的DR,其中發生增殖改變者約為18%,致盲者占20%,近年來隨著糖尿病患者的數量激增,DR發病率快速增長[8]。本研究中組織學結果顯示SFN對DR具有保護作用。

為進一步探討SFN的保護作用機制,本研究首先關注了SFN對炎性通路的影響。DR的特點主要是視網膜微血管進行性損害、血管通透性增加、新生血管形成,其病理改變涉及到代謝酶、炎癥、信號傳導等多種機制變化,多數學者就炎癥反應是糖尿病視網膜病變的重要過程達成共識[9]。本研究結果顯示,M組大鼠視網膜中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18等NLRP3/IL-1β因子表達均顯著升高,組織學檢查顯示視網膜破壞嚴重,結果提示,高糖誘導NLRP3/IL-1β通路表達上調,導致視網膜病變。相關研究結果提示[10],糖尿病大鼠早期即可檢測到血-視網膜屏障破壞,同時檢測到高表達的NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18,沉默NLRP3表達,可降低IL-1β、IL-18等炎性因子和血管通透性。高糖培養的人視網膜微血管內皮細胞中同樣觀察到NLRP3炎癥小體相關成分及細胞凋亡增加,沉默NLRP3可增強培養細胞對高糖的耐受性和減少細胞凋亡[11]。NLRP3和IL-1β在增殖性糖尿病視網膜病變組織中表達顯著升高,且患者玻璃體中IL-1β和IL-18濃度顯著升高[12]。這些研究均提示NLRP3炎癥小體是高糖誘導視網膜細胞病變炎癥及反應的關鍵啟動因子,NLRP3炎癥效應器是DR炎癥進展的重要決定因素。本研究結果與上述研究一致。

本研究結果顯示,M組大鼠視網膜MDA和TXNIP表達水平均顯著高于BC組,SOD水平低于BC組,結果提示高糖誘導的氧化應激失衡和TXNIP表達水平升高是導致NLRP3的重要因素。既往研究[13]顯示,高血糖可誘導ROS產生,高血糖誘導的ROS生成是糖尿病微血管病四種經典致病途徑中常見的事件。而ROS的產生對NLRP3激活至關重要,ROS的產生是NLRP3激活的重要條件,幾乎所有NLRP3激動劑都會導致ROS生成增加,通過ROS敏感的TXNIP蛋白激活NLRP3炎癥小體[14]。高糖誘導的ROS可促使TXNIP從硫氧還蛋白解離,改變TXNIP從硫氧還蛋白阻遏物到NRLP3炎性激動劑的功能,敲除TXNIP基因可抑制NLRP3炎癥小體激活,細胞凋亡[15]。在體外高糖環境下培養的人視網膜血管內皮細胞ROS水平升高,TXNIP表達水平升高,NLRP3炎癥小體被大量激活,抑制ROS生成或沉默TXNIP表達均可阻止炎癥小體組裝,抑制炎癥因子表達[16]。其中MDA是脂質過氧化物的最終產物,可反映ROS的活性。本研究結果進一步提示氧化應激在DR的病因子發揮重要因素。

Nrf2是抑制氧化應激和炎癥反應的轉錄因子,Nrf2信號通路的激活在保護細胞抵抗氧化應激、羰基化合物和人體中的親電劑方面發揮重要作用[17]。研究[18]顯示,高糖狀態下,激活視網膜細胞Nrf2,可減輕氧化應激對視網膜的損害,敲除Nrf2基因可導致抗氧化酶生成減少,炎癥反應增強和視網膜破壞增加。因此有學者[19]建議在DR的早期激活Nrf2是防止氧化應激損傷和DR進展的關鍵。HO-1是一種應激反應酶,在病理條件下維持體內平衡[20]。SFN是異硫氰酸鹽類化合物,具有抗氧化、心血管保護等作用,其本身不具有直接參與抗氧化反應的功能,可通過間接途徑激活Nrf2,誘導產生一系列二相酶和抗氧化酶實現抗氧化作用[21]。研究[22]顯示,SFN在轉錄水平激活Nrf2/HO-1途徑增強人臍靜脈的抗氧化損傷作用。本研究結果顯示,SFN治療可增加Nrf2后Nrf2、HO-1水平升高,TXNIP、NLRP3、caspase-1、ASC、IL-1β、IL-18水平降低,且SHD組改變較SLD組更為明顯,結果提示,SFN可能通過激活Nrf2信號通路,降低氧化應激和TXNIP水平,從而降低NLRP3信號通路的激活,從而對DR產生保護作用。