基于β-環糊精修飾的碳量子點對D, L-色氨酸的識別和L-色氨酸定量分析

王昆, 鄭慧娟, 汪燦, 劉愛林, 雷云

作為人體的必需氨基酸,色氨酸(tryptophan,Trp)及其代謝產物5-羥色胺、煙酸等廣泛參與人體的蛋白合成和新陳代謝中,對情緒、生理節律、細胞生長發育及免疫功能均起到重要的調控作用[1]。研究[2-3]表明,Trp及其代謝產物可通過影響免疫系統,對炎癥性腸病進行調節,同時也與結直腸癌的發生密切相關。Trp代謝紊亂可引起免疫細胞的功能障礙甚至凋亡,促進免疫抑制微環境形成,從而影響抗腫瘤藥物免疫檢查點抑制劑的療效[4]。此外,新型冠狀病毒感染者預后可能因Trp吸收和代謝的改變產生長期疲勞、頭疼等癥狀[5]。

與大部分必需氨基酸相同,Trp具有手性中心,存在D型(D-Trp)和L型(L-Trp)對映體,兩者在藥理和生化方面差異顯著。L-Trp作為血清素的前體,其攝入量與睡眠質量[6]、抑郁和焦慮情緒等密切相關[7]。此外,L-Trp還可協同Ca2+激活人類鈣離子感應受體(calcium-sensing receptor,CaSR),有助于CaSR新型藥物的開發利用[8]。而D-Trp作為非天然蛋白質氨基酸,不具備L-Trp的生理功能[9]。因此,進行D,L-Trp的手性識別和定量分析,對疾病的診斷、單一對映體藥物的雜質檢測和藥代動力學研究,以及對映體識別方法的研究與評價等均具有重要意義。目前,已發展成熟的Trp對映體手性識別方法主要有液相色譜法[10]和氣相色譜法[11]等。隨著現代科學技術的發展,熒光檢測技術因具有靈敏度高、響應快、選擇性好和操作簡單等優點,已逐漸成為手性識別研究的重要方法之一。

碳量子點(carbon quantum dots,CQDs)是一種零維碳基熒光材料,具有良好的光學性質,且具有水溶性好、毒性低、成本低和生物相容性好等諸多優點[12-14],現已廣泛應用于生物傳感[15]、藥物傳遞[16-17]、藥物分析[18-19]、病毒檢測[20]和生物成像[21]等生物醫藥領域。環糊精(cyclodextrin,CD)是一種由葡萄糖單元組成的中空圓筒立體環狀低聚糖,具有親水的外部空腔和疏水的內部空腔,可對有機分子進行識別和選擇,其中的β-環糊精(β-cyclodextrin,β-CD)因空腔適中易發生包合作用、造價低、易獲取和成膜能力強,已被應用于D,L-Trp對映體的手性識別[22-23]。目前已有利用β-CD對D,L-Trp 對映體手性識別進行熒光分析的報道,其原理主要是因為D,L-Trp的構型不同,在與β-CD發生包合作用后,其對應的包合物的熒光強度也不同,從而實現手性識別,但這種識別能力易受共存對映體的干擾。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 熒光分光光度計(F-4600型,日本日立公司);紫外-可見分光光度計(UV-2450型,日本島津公司);紅外光譜儀[Nicolet 380,馭锘實業(上海)有限公司];X射線電子能譜儀(ESCALAB 250Xi型,美國賽默飛世爾科技有限公司);微孔濾膜(德國MEMBERNA公司);即用型透析袋(截留分子質量為1 ku,美國Spectrum技術公司);超濾離心管(截留分子質量為3 ku,美國Millipore公司)。

碳纖維、HNO3、NaOH、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、硫酸奎寧、H3PO4、D,L-Trp、乙二胺-β-CD(NH2C2H4NH-β-CD)均購置于阿拉丁化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1β-CD/CQDs復合物的合成 將碳纖維剪成細碎狀,取0.30 g分散于7.50 mol/L的硝酸中,140 ℃恒定溫度下油浴加熱48 h,冷卻后調節 pH值至中性,并用0.22 μm濾膜除去大顆粒雜質后,用透析袋透析24 h,再用超濾離心管離心(10 000 r/min,30 min),收集分子質量<3 ku的部分,冷凍干燥,得固體CQDs待用。取一定量的CQDs溶于PBS緩沖液中(pH值5.0)制備CQDs溶液待用。取4 mg EDC和1 mg NHS 溶于1 mL CQDs溶液,攪拌30 min后,將pH值調節至中性,加入5 mg NH2C2H4NH-β-CD,反應12 h,得到β-CD/CQDs復合物溶液,過濾(0.22 μm),透析(截留分子質量為1 ku,24 h)除去EDC、NHS,以及未反應完成的NH2C2H4NH-β-CD等小分子物質。

1.2.2 熒光量子產率(quantum yield,QY)的測定 配制適當濃度的硫酸奎寧標準溶液和待測物質,使其在特定的激發波長(350 nm)下吸光度值相等,比較在該激發波長下的熒光積分強度,可測得待測物質的QY。為減少誤差,取吸光度值在0～0.1范圍內的5個濃度值,掃描熒光光譜得到不同濃度的熒光積分強度。以吸光度值為橫坐標、熒光積分強度為縱坐標作線性關系圖,得到一條直線,該直線的斜率記為f,并用公式計算出待測物質的QY。其中ΦST和ΦX分別為硫酸奎寧和待測物質的QY,ηST和ηX分別代表硫酸奎寧和待測物質的折射率,fST和fX分別代表硫酸奎寧和待測物質對應直線斜率。

ΦX=ΦST×(fX/fST)×(ηX2/ηST2)

形式主義的根源，是名利思想和懶惰作風作怪。自私主義滋生功利主義，功利主義滋生形式主義。無論是不符合實際的政績工程，還是不負責任的工作作風，都是私心和私欲在膨脹。只顧個人前途，只為上級高興，只圖自己舒服，不顧長遠利益，不講實際效果，不管群眾疾苦。

(1)

1.2.3β-CD/CQDs復合物對D,L-Trp對映體的識別性能 取100 μL 10 μmol/L的D(或L)-Trp與100 μL 0.10 g/L的β-CD/CQDs復合物溶液于棕色EP管中,混勻后置于恒溫水浴反應14 h,測定其熒光光譜。

1.2.4β-CD/CQDs復合物對L-Trp的熒光定量分析 配制2～42 μmol/L不同濃度的L-Trp溶液。各取不同濃度的L-Trp溶液100 μL分別與100 μL 0.20 g/L的β-CD/CQDs復合物溶液混合,于40 ℃恒溫水浴反應14 h后,測量其熒光光譜。

2 結 果

2.1β-CD/CQDs復合物的表征

2.1.1 紫外-可見吸收與熒光光譜表征 CQDs及β-CD/CQDs復合物的紫外-可見吸收光譜見圖1A,可見CQDs在295 nm和361 nm有明顯的吸收峰,而β-CD/CQDs復合物在361 nm的吸收峰變弱,出現了1個336 nm肩峰。在CQDs及β-CD/CQDs復合物的熒光光譜中(圖1B),CQDs發射光譜出現在454 nm,β-CD/CQDs復合物的發射光譜則出現在427 nm。

CQDs：碳量子點;β-CD：β-環糊精。A：紫外-可見吸收光譜;B：熒光光譜。

2.1.2 形貌與表面結構表征 利用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)表征CQDs和β-CD/CQDs復合物的形貌,顯示2種納米材料均為類球形,經Nano Measurer計算得平均粒徑分別為(3.1±0.1)、(3.2±0.1)nm,晶格常數均為0.23 nm(圖2A、B)。

CQDs：碳量子點;β-CD：β-環糊精;TEM：透射電子顯微鏡;FTIR：紅外光譜;σ：波數。A：CQDs的TEM圖;B：β-CD/CQDs的TEM圖;C：β-CD,CQDs和β-CD/CQDs的FTIR圖。

通過紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)表征β-CD/CQDs復合物的表面官能團,β-CD、CQDs和β-CD/CQDs的FTIR譜圖見圖2C?？梢奀QDs在～3 430 cm-1處有強的 —OH 伸縮振動,在～2 849 cm-1處有較窄的C—H伸縮振動,～1 628 cm-1處的吸收峰對應C=O的伸縮振動,～1 090 cm-1處存在C—O—C伸縮振動峰,～878 cm-1處的吸收峰為C—H鍵的面外彎曲振動。β-CD/CQDs復合物的FTIR中CQDs的特征峰不明顯,而在2 000～1 000 cm-1出現了β-CD的特征峰。

用X射線電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)表征CQDs與β-CD/CQDs復合物的元素分布情況。圖3A為CQDs的XPS圖,顯示在284.80、401.60、531.40 eV處存在3個峰,分別對應C1s、N1s、O1s的特征峰。圖3B為CQDs 的C1s高分辨XPS譜,可擬合拆分為C—C/C=C(284.70 eV)、C—O(287.00 eV)和 O—C=O(288.50 eV)3個峰。圖3C為β-CD/CQDs復合物的XPS表征圖,表明該復合物主要由C、O和N元素組成,與CQDs比較,β-CD/CQDs復合物中的C1s XPS 譜中出現了C—N官能團。

CQDs：碳量子點;β-CD：β-環糊精;XPS：X射線電子能譜;E：結合能。A：CQDs XPS全譜;B：CQDs中C1s XPS譜圖;C：β-CD/CQDs XPS全譜;D：β-CD/CQDs中C1s XPS譜圖。

2.2β-CD/CQDs 復合物對D,L-Trp對映體的手性識別 由D,L-Trp的熒光光譜圖(圖4A)可知,D,L-Trp的最佳激發波長和發射波長分別為280、353 nm,故實驗選用激發波長為280 nm,分別測定L-Trp、D-Trp與β-CD/CQDs復合物反應后的熒光光譜(圖4B、C)。如圖4B所示,L-Trp與β-CD/CQDs 復合物發生包合作用后,其反應體系在400 nm 產生熒光發射峰,較單獨的L-Trp(353 nm)紅移且熒光強度下降,而其對映體D-Trp發生包合反應后,其反應體系的熒光發射峰位置和強度都未產生明顯變化(圖4C)。

Trp：色氨酸;CQDs：碳量子點;β-CD：β-環糊精。A：D, L-Trp的激發光譜與熒光光譜;B：L-Trp、β-CD/CQDs 復合物以及兩者反應后的熒光光譜(λex=280 nm);C：D-Trp、β-CD/CQDs復合物以及兩者反應后的熒光光譜(λex=280 nm)。

2.3β-CD/CQDs 復合物合成條件優化

2.3.1 NH2C2H4NH-β-CD與CQDs的質量比 實驗通過EDC-NHS偶聯反應將NH2C2H4NH-β-CD通過酰胺鍵修飾到CQDs表面,NH2C2H4NH-β-CD與CQDs的質量比會影響β-CD/CQDs復合物的QY。如圖5A所示,β-CD/CQDs復合物的QY隨NH2C2H4NH-β-CD和CQDs的質量比增大而增大,當NH2C2H4NH-β-CD與CQDs的質量比達到3∶1 時,β-CD/CQDs復合物的QY明顯上升,之后隨著二者的質量比繼續增大,QY無明顯升高。

CQDs：碳量子點;β-CD：β-環糊精。A：不同NH2C2H4NH-β-CD與CQDs質量比合成的β-CD/CQDs復合物的QY(λex=350 nm);B：不同反應溫度合成的β-CD/CQDs復合物的QY(λex=350 nm)。

2.3.2 偶聯反應溫度 實驗考察了4、25、30、35、40 ℃等不同偶聯反應溫度下合成的β-CD/CQDs復合物的QY。由圖5B可知,隨著反應溫度的升高,β-CD/CQDs復合物的QY反而降低,在4 ℃下偶聯反應效率最高。

2.4β-CD/CQDs復合物對D,L-Trp手性識別條件優化

2.4.1 包合反應溫度 為探究包合反應溫度對β-CD/CQDs 復合物對手性藥物識別性能的影響,研究在25、30、35、40、45 ℃下β-CD/CQDs復合物對D,L-Trp的手性包合作用。從圖6A可見,在相同反應時間(14 h)內,隨著反應溫度的升高,β-CD/CQDs復合物與L-Trp反應后的熒光光譜中,L-Trp的熒光發射峰逐漸減小,且在395 nm附近產生1個熒光發射峰,當溫度上升至40 ℃時,L-Trp的熒光發射峰完全消失。然而,D-Trp與β-CD/CQDs復合物的反應體系的熒光發射峰的位置和強度并未隨著溫度的改變而發生明顯變化(圖6B)。而當溫度達45 ℃時,β-CD/CQDs復合物與不同構型Trp的熒光光譜未見明顯差異。

Trp：色氨酸;CQDs：碳量子點;β-CD：β-環糊精。A、B：分別為在不同溫度下L-Trp或D-Trp與β-CD/CQDs復合物反應后的熒光光譜(λex=280 nm);C、D：分別為在不同pH值條件下L-Trp或D-Trp與β-CD/CQDs復合物反應后的熒光光譜(λex=280 nm)。

2.4.2 包合反應的pH值 為探究在β-CD/CQDs復合物與D,L-Trp的包合反應體系中,pH值對熒光強度的影響,實驗分別考察了在pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和8.0的條件下,β-CD/CQDs 復合物分別對L-Trp和D-Trp手性包合作用。對比圖6C和6D,發現pH值為5.5或6.0時,熒光發射峰的位置和強度差異最顯著,而在其他pH值條件下,與L-Trp或D-Trp包合反應后的熒光光譜圖非常相似。

2.5β-CD/CQDs復合物對L-Trp的熒光定量檢測β-CD/CQDs復合物能有效識別D,L-Trp對映體,且L-Trp能使β-CD/CQDs復合物的熒光強度發生改變。在最優的實驗條件下,建立基于β-CD/CQDs 的L-Trp熒光定量新方法。隨著L-Trp 的濃度從6 μmol/L增加至38 μmol/L時,熒光強度逐漸增大(圖7A),L-Trp濃度繼續增至42 μmol/L,熒光強度幾乎不變。從圖7B可知。L-Trp 的濃度在6～38 μmol/L范圍內,熒光強度(Y)與L-Trp 的濃度(X)之間具有良好的線性關系。

Trp：色氨酸;CQDs：碳量子點;β-CD：β-環糊精。A：熒光光譜;B：標準曲線。

Y=28.38X-59.34

(r=0.998,檢測限為0.94 μmol/L)

(2)

3 討 論

作為人體必需氨基酸,具有手性中心的Trp存在D-Trp和L-Trp對映體,二者在藥理活性方面具有顯著差異,而這直接影響到Trp的臨床療效。因此,實現對D-Trp和L-Trp的識別和定量檢測具有重要的臨床意義。CQDs因具有良好的光學性能,且易溶于水、生物毒性低、生物相容性好、表面具有豐富的易于功能化修飾的羧基,而被廣泛應用于生物傳感、藥物運輸、細胞標記等醫藥生物領域。該研究利用CQDs表面豐富的羧基,通過 EDC-NHS 試劑將其活化,從而將乙二胺-β-CD共價偶聯修飾到CQDs表面,成功制備了β-CD/CQDs復合物,據此構建了一個手性識別熒光傳感器。利用紫外-可見吸收光譜、熒光光譜、FTIR及XPS對CQDs及β-CD/CQDs 復合物的光學性能、表面官能團和元素組成進行表征。此外,還通過測定QY,考察了不同配比以及不同溫度對合成β-CD/CQDs 復合物的影響。實驗基于β-CD對不同手性藥物的不同包合效果,通過熒光光譜實現了對D,L-Trp 的識別和對L-Trp的定量分析。

從β-CD/CQDs復合物的紫外-可見吸收與熒光光譜表征結果可以看出,CQDs在295、361 nm的明顯吸收峰是由于CQDs中的C=O鍵發生了n→π*躍遷,而β-CD/CQDs復合物在295、336 nm 出現的吸收峰,說明β-CD/CQDs復合物在336 nm較CQDs在361 nm吸收峰藍移了25 nm。在圖1B的熒光光譜中,β-CD/CQDs復合物的發射光譜(427 nm)較CQDs發射光譜(454 nm)也出現了27 nm 的藍移,該現象與紫外吸收光譜圖結果一致,表明CQDs表面的 —COOH和 NH2C2H4NH-β-CD 中的 —NH2發生了共價結合,使得共軛效應減弱。

從CQDs及β-CD/CQDs復合物的TEM圖可以觀察到,2種納米材料微觀上的形貌均為單分散的類球形,碳點表面經β-CD 功能化修飾前后,顆粒大小未發生明顯變化。

從β-CD、CQDs和β-CD/CQDs的FTIR可知,相較CQDs的FTIR中官能團表現明顯的特征峰,β-CD/CQDs復合物的FTIR中CQDs的特征峰則不明顯,而在2 000～1 000 cm-1出現了β-CD的特征峰?？梢姦?CD已成功修飾到CQDs表面,從而使β-CD/CQDs表面表現出β-CD中官能團的特征峰。

通過比較CQDs和β-CD/CQDs的XPS表征圖可知,β-CD/CQDs復合物的C、O和N的百分比分別為62.21%、34.40%和3.39%,乙二胺-β-CD偶聯修飾于CQDs表面后,各元素分配比例有所變化,C1s XPS譜中出現了C—N官能團(287.95 eV),以上結果表明β-CD已成功修飾到CQDs表面。

通過比較L-Trp、D-Trp和β-CD/CQDs復合物反應后的熒光光譜發現,包合作用發生后,反應體系的熒光發射峰較L-Trp發生紅移且熒光強度變弱,而其對映體D-Trp與β-CD/CQDs復合物反應后,反應體系的熒光發射峰位置和強度與D-Trp相比,均未發生明顯變化。這是由于β-CD獨特的空腔結構表現出對D-Trp對映體顯著的手性包合差異[24],L-Trp可進入β-CD/CQD復合物表面CD的疏水腔體中,從而與β-CD/CQD形成新的包合物,其熒光發射峰的位置和強度都發生了顯著變化,而D-Trp由于CD的立體選擇性未能進入β-CD/CQD表面的CD腔體中,因此,反應后熒光光譜未發生明顯變化。由以上結果可知,由于CD手性空腔的立體作用,β-CD/CQD復合物與D,L-Trp對映體的包合常數不同,與D-Trp相比,β-CD/CQD與L-Trp之間的相互作用更強,表現出優良的Trp對映體手性識別能力。

QY是熒光物質的重要發光參數。從圖5A可以看出,β-CD/CQDs復合物的QY隨NH2C2H4NH-β-CD與CQDs的質量比的增大而增大,當質量比達到 3∶1 后,QY不再增強,表明反應達到飽和。因此,實驗選取NH2C2H4NH-β-CD與CQDs的質量比為3∶1。此外,偶聯反應溫度是影響偶聯效率的重要因素。從圖5B可以看出,4 ℃下偶聯反應效率最高,所制備的β-CD/CQDs復合物的QY達到最大值。因此,實驗選擇4 ℃為偶聯反應溫度。

此外,實驗還優化了β-CD/CQDs復合物對D,L-Trp 手性識別的包合反應溫度和pH值。從圖6A可見,在相同時間內,隨著溫度的升高,包合反應程度不斷加劇,L-Trp的熒光發射峰逐漸減小,同時因為L-Trp與β-CD/CQDs復合物發生熒光能量共振轉移,包合產物在395 nm處附近出現1個熒光發射峰,當溫度達40 ℃時,L-Trp的熒光發射峰完全消失,此時β-CD/CQDs與L-Trp的包合作用最強。而圖6B中D-Trp與β-CD/CQDs復合物的反應體系中,熒光發射峰的位置和強度并未隨溫度的改變而發生明顯變化。由此可見,β-CD/CQDs復合物對D,L-Trp表現出顯著的包合差異。而當溫度達45 ℃時,β-CD/CQDs復合物與L-Trp的包合作用驟減,對D,L-Trp未呈現手性包合差異。因此,40 ℃下,β-CD/CQDs復合物對D,L-Trp手性識別能力最強。對比圖6C和6D,可發現β-CD/CQDs復合物與D,L-Trp包合反應體系中pH值對熒光強度的影響,pH值為5.5或6.0時,反應體系的熒光發射峰的位置和強度差異最顯著,而在其他pH值的條件下,包合反應后的L-Trp和D-Trp的熒光光譜圖無明顯差異。由此可見,在pH值為5.5或6.0的體系中,β-CD/CQDs 復合物對D,L-Trp 手性識別能力最強。在上述最佳實驗條件下,β-CD/CQDs復合物能有效識別D,L-Trp對映體,且L-Trp能使β-CD/CQDs復合物的熒光強度發生改變?；讦?CD 修飾CQDs的手性藥物識別熒光傳感器能夠實現對D,L-Trp的識別,以及對L-Trp 的定量分析,在 6～38 μmol/L 范圍內,L-Trp 的濃度與檢測熒光強度之間具有良好的線性關系,檢測限為0.94 μmol/L。從而建立了基于β-CD/CQDs 的L-Trp熒光定量新方法。

通過與部分既往文獻報道的不同Trp測定方法得出的線性范圍和檢出限結果進行比較[25-29],發現本研究方法對L-Trp的定量檢測具有較寬的線性范圍和更低的檢出限。此外,相較于其他檢測方法,本研究通過引入β-CD/CQDs復合物,實現對D,L-Trp 的識別,以及對L-Trp的定量分析。該方法操作簡單、特異性好,避免使用昂貴的大型儀器,更具普及前景,為手性藥物識別提供了一種新的途徑和思路。