B亞型禽偏肺病毒對黃羽肉雞致病性分析及其滅活疫苗免疫效果評價

孟令宅,陳春麗,于蒙蒙,王占新,王素艷,劉 鵬,何塔娜,郭 茹,陳運通,劉長軍,祁小樂,吳志強,高玉龍*

(1.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所 動物疫病防控全國重點實驗室 禽免疫抑制病創新團隊,哈爾濱 150069;2.溫氏食品集團股份有限公司養禽事業部生產管理室,廣東省畜禽健康養殖與環境控制企業重點實驗室,新興 527439)

禽偏肺病毒(avian metapneumovirus, aMPV)屬于副黏病毒科肺病毒亞科偏肺病毒屬家族的成員,其為有囊膜的不分節段單股負鏈RNA病毒[1-3]。該病毒之前被稱為禽肺病毒,是火雞鼻氣管炎的病原體。aMPV感染雞后,會導致雞腫頭綜合征(swollen head syndrome, SHS)及產蛋量的急劇下降,因其具有傳播性強、亞型種類多、感染宿主多樣性等特點,對我國養禽業發展及公共衛生安全產生了嚴重的影響[4-5]。

aMPV于1978年在南非首次被分離報道,隨后在全世界范圍內廣泛流行,目前,除大洋洲以外的所有家禽飼養區均有分布[6]。aMPV的基因組全長約13.3 kb,包含8個基因,順序為3′-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5′[7]?；贕基因的抗原性差異,aMPV可分為A、B、C和D四種亞型[8]。1998年,沈瑞忠等[9]在國內某肉雞場中首次分離鑒定到一株aMPV;2009年,郭龍宗和曲立新[10]對膠東地區的多個種雞場進行了血清學檢測,結果表明aMPV感染普遍存在,多個雞場血清陽性率可達100%;近年來,該病流行態勢進一步增大,且本地雞中感染占比越來越高[11-12]。2012年,中國東南部的某黃羽肉雞場的雞出現了嚴重的呼吸道癥狀,臨床癥狀包括眼眶腫脹,面部充血、鼻和眼部出現分泌物,經病毒分離鑒定為C亞型aMPV感染[13];此外,肖志宇等[14]對我國四川、福建、江蘇、廣東等多個省份的不同品種雞群進行了調查,結果顯示,目前我國本地雞中的黃羽肉雞、清遠麻雞中aMPV感染率相對較高,且主要流行毒株為B亞型。黃羽肉雞是我國肉雞養殖中的特色品種,在我國肉雞養殖產業中占有重要地位,年出欄量超過了40億羽,曾占到肉雞總出欄量的50%左右,已成為我國居民肉類食品的主要來源之一。然而,由于我國禽病種類繁多,尤其像禽偏肺病毒病等新發疫病,缺乏有效的防控技術手段,導致家禽生產性能下降、死淘率增加。因此,必須加強相應的防控技術研究。本實驗室在2016年從某肉種雞場中首次分離到一株B亞型aMPV LN16株[15],致病性結果顯示該毒株對SPF雞、商品蛋雞、商品肉雞均具有明顯的致病性,然而,目前尚無B亞型aMPV對黃羽肉雞致病性的評價以及現有疫苗對黃羽肉雞保護效果評價的報道。

當前疫苗免疫是預防該病的重要措施[16]。歐洲一些國家主要通過滅活疫苗和弱毒疫苗來預防A亞型和B亞型aMPV的感染[17];美國也已研制出針對C亞型aMPV的弱毒疫苗MN/turkey/1-a/97-P63株[18];本實驗室早期研制出針對B亞型禽偏肺病毒病的滅活疫苗,其對SPF雞、商品蛋雞及商品肉雞均能提供良好的免疫保護效果[19]。目前,我國黃羽肉雞品種繁多,發病情況復雜,也有疑似aMPV引起的腫頭和流鼻涕的臨床癥狀。因此,本研究評價了B亞型aMPV對黃羽肉雞的致病性及滅活疫苗對黃羽肉雞的免疫保護效果,為國內黃羽肉雞B亞型禽偏肺病毒病的防控提供一定的技術支持及理論指導。

1 材料與方法

1.1 細胞、病毒毒株及實驗動物

Vero細胞及B亞型禽偏肺病毒滅活疫苗(LN16-I株)均由本實驗室保存[20];B亞型禽偏肺病毒強毒LN16株(aMPV/B LN16)由本實驗室分離、鑒定并保存;黃羽肉雞(品種為三黃雞,包括公雞與母雞)購自溫氏食品集團股份有限公司江蘇分公司。

1.2 主要試劑

TRIzol、反轉錄試劑BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis Kit、Premix Ex TaqTMMix均購自大連寶生物科技股份有限公司;禽偏肺病毒ELISA抗體檢測試劑盒購自美國IDEXX公司(貨號99-44300)。

1.3 試驗設計

將26只21日齡黃羽肉雞隨機分為2組:免疫組和對照組各13只(aMPV抗體檢測為陰性),其中,免疫組通過胸肌接種0.5 mL滅活疫苗,對照組注射等量的無菌PBS。初次免疫3周后,加強免疫一次,采集初次免疫后1～6周內免疫組與對照組全部雞只的非抗凝血,分離血清。加強免疫3周后,采取滴鼻方式,使用強毒株aMPV/B LN16進行攻毒試驗,攻毒劑量為5 000 TCID50·只-1。觀察并記錄攻毒后1～7 d內各組的臨床癥狀,每日觀察兩次。攻毒后9 d,隨機選擇每組3只雞進行剖殺,采集并固定鼻甲及氣管等組織,進行病理觀察。

1.4 ELISA抗體水平檢測

將采集的免疫組與對照組(每組13只)雞的非抗凝血置于37 ℃溫箱1 h后,再置于4 ℃冰箱存放1 h,使血清充分析出。將分離的血清進行500倍稀釋后,按照ELISA檢測試劑盒說明書測定ELISA抗體效價。

1.5 中和抗體效價的測定

將Vero細胞提前1 d鋪于96孔板。將分離的免疫組與對照組雞的血清(每組13只)置于56 ℃水浴鍋中30 min滅活補體,使用0.22 μm濾器將血清過濾后進行連續2倍梯度稀釋,將稀釋不同倍數的血清與aMPV/B LN16(2 000 TCID50·mL-1)等體積混合后,置于37 ℃培養箱中孵育1 h,期間上下顛倒混勻一次。取100 μL孵育后的混合液接種于長滿的Vero細胞96孔板中,每個樣品6個重復,每日觀察細胞狀態,7 d后統計各孔的病變情況,按照Reed-Muench方法計算中和抗體效價(效價>4 log2為陽性)。

1.6 排毒檢測

采集免疫組與對照組雞(每組13只)攻毒后1～7 d內的腭裂拭子,將腭裂拭子溶于800 μL PBS 離心管中,渦旋震蕩25 s后,取200 μL病毒懸液提取病毒基因組RNA,參考BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis Kit說明書將RNA樣品進行反轉錄,按照本實驗室建立的RT-qPCR檢測方法[19],檢測各組的排毒情況,引物序列見表1。

表1 aMPV/B熒光定量PCR檢測引物Table 1 The detection primers of aMPV/B RT-qPCR

1.7 組織病理學觀察

采集攻毒后第9天免疫組與對照組(每組3只)雞的鼻甲骨及氣管等組織,固定于10%的福爾馬林溶液后進行常規處理,石蠟包埋切片。使用蘇木素和伊紅進行染色后于光學顯微鏡下觀察病理組織學變化,記錄各組的損傷情況。

2 結 果

2.1 ELISA抗體效價檢測

采集初次免疫后1～6周內免疫組與對照組(每組13只)雞的血清,測定血清中的ELISA抗體效價,結果顯示,初次免疫后第2周抗體開始轉陽,第2周與第3周時ELISA平均抗體滴度分別為5.5×103及 3.2×104,抗體陽性率均為100%。加強免疫后,第2周與第3周時ELISA平均抗體滴度分別為4.1×104及4.2×104(圖1),均顯著高于初次免疫3周內的ELISA抗體滴度,空白組ELISA抗體始終為陰性。以上結果表明滅活疫苗免疫后,可以誘導黃羽肉雞產生高水平aMPV特異性抗體。

使用雙向方差分析確定統計學意義,****. P<0.000 1;**.P<0.01Two-way ANOVA was used to determine the statistical significance,****. P<0.000 1;**. P<0.01圖1 免疫后血清中ELISA抗體水平Fig.1 Serum antibody levels after immunization

2.2 中和抗體效價檢測

采集初次免疫后1～6周內免疫組與對照組(每組13只)雞的血清,測定血清中和抗體效價,結果顯示,初次免疫后第2周,中和抗體開始轉陽;第2、3周時平均中和抗體效價分別為3.38 log2和4.86 log2,陽性率分別為40%和100%;加強免疫后的第1、2、3周時平均中和抗體效價分別為5.58 log2、6.69 log2和7.42 log2(表2),均顯著高于初次免疫3周內的中和抗體滴度,陽性率均為100%。以上結果表明滅活疫苗免疫后,可以誘導黃羽肉雞產生高水平的中和抗體。

表2 免疫后血清中和抗體水平Table 2 Serum neutralizing antibody levels of after

2.3 臨床癥狀觀察

攻毒后觀察1～7 d內的臨床癥狀,每日上午下午各觀察一次,結果顯示,B亞型aMPV強毒株LN16攻擊后,未免疫黃羽肉雞第3天開始出現流混濁或黏稠樣鼻涕(圖2)、甩頭等臨床癥狀,一直持續到第7天,發病率為85%(11/13);滅活疫苗免疫組黃羽肉雞均未出現臨床癥狀,發病率為0%。上述結果表明,B亞型aMPV強毒株LN16對黃羽肉雞有明顯的致病性,而滅活疫苗能夠有效預防B亞型aMPV強毒株攻擊所引起的臨床癥狀。

A.攻毒對照組;B.免疫組A. The challenge control group; B. The vaccinated group 圖2 攻毒后臨床癥狀觀察結果Fig.2 The results of clinical symptoms after challenge

2.4 排毒檢測

攻毒后1～7 d,采集免疫組與對照組(每組13只)雞的腭裂拭子,采用RT-qPCR的方法檢測腭裂拭子中的病毒拷貝數。結果顯示,B亞型aMPV強毒株LN16攻擊后,未免疫黃羽肉雞在第3 天達到排毒高峰,排毒量為4.9×106copies·mL-1;第7天排毒量降至最低,排毒量為 2.1×103copies·mL-1。免疫組黃羽肉雞出現輕微排毒,在第3天高峰期時排毒量為2.8×104copies·mL-1,與未免疫組相比下降了約99.43%(圖3)。這些結果表明B亞型aMPV強毒株LN16感染可引起黃羽肉雞高水平的排毒,而滅活疫苗可顯著降低病毒在呼吸道中的復制。

使用雙向方差分析確定統計學意義,****. P<0.000 1;***.P<0.001;**. P<0.01;*. P<0.05; ns. P>0.05Two-way ANOVA was used to determine the statistical significance,****. P<0.000 1;***. P<0.001;**. P<0.01;*. P<0.05; ns. P>0.05圖3 攻毒后排毒情況Fig.3 The virus shedding after challenge

2.5 病理組織學檢測

攻毒后第9天,每組隨機取3只雞進行剖殺,將鼻甲、氣管固定、染色后進行病理組織學觀察,結果顯示,B亞型aMPV強毒株LN16攻擊后,未免疫黃羽肉雞鼻甲黏膜下層可見多發性炎性細胞浸潤,上皮細胞可見多量變性壞死,氣管黏膜固有層可見多量炎性細胞浸潤,滅活疫苗免疫黃羽肉雞均未出現明顯病理損傷(圖4)。以上結果表明B亞型aMPV強毒株LN16對黃羽肉雞具有明顯的致病性,可引起鼻甲和氣管出現明顯的病理損傷,而滅活疫苗可有效預防強毒株攻擊后對機體造成的病理損傷。

A和D. 鼻甲黏膜下層;B和E. 鼻甲黏液腺上皮;C和F. 氣管黏膜固有層A and D. Submucosa of turbinate; B and E. Mucinous glandular epithelium of turbinate; C and F. Lamina propria of tracheal mucosa圖4 攻毒后黃羽肉雞不同器官的病理組織學變化Fig.4 Histopathological changes of different organs in yellow feather broilers after virus challenge

3 討 論

aMPV感染不僅可以引起嚴重的呼吸道癥狀,而且極易與其它病原體發生混合感染,造成感染的禽類癥狀加重及生產性能下降[16-17]。根據流行病學調查結果顯示,目前國內規?；B禽場中aMPV感染陽性率很高,且近年來本地雞感染占比越來越高[21]。然而,關于aMPV對本地雞的致病性及疫苗對本地雞的免疫保護效果等方面的研究相對較少。

本研究以黃羽肉雞為研究對象,首次證明了B亞型aMPV對黃羽肉雞具有明顯的致病性,感染雞可出現流鼻涕、鼻痂等臨床癥狀,發病率為85%。病理組織觀察結果顯示,B亞型aMPV感染可引起黃羽肉雞鼻甲骨黏膜層和氣管固有層的炎性細胞浸潤,大量上皮細胞壞死。本實驗室前期數據表明,B亞型aMPV可感染SPF雞、商品蛋雞及商品肉雞,排毒最高的器官組織為鼻甲骨,排毒高峰期在感染后的第2～3天,排毒峰值分別為1.2×105及3.2×105copies·mL-1[22-24]。在本研究中,未免疫組黃羽肉雞在感染后1～7 d出現排毒,在第3天時達到峰值,為4.9×106copies·mL-1。以上數據說明,B亞型aMPV不僅對SPF雞、商品蛋雞及商品肉雞具有致病性,對黃羽肉雞也具有很強的致病性。此外,根據本研究中的排毒檢測結果,在黃羽肉雞群發病早期采樣,更容易分離到該病毒。

研制安全有效的疫苗可以大大降低該病引起的經濟損失。為滿足臨床實際生產需求,本研究又進一步系統評估了B亞型禽偏肺病毒滅活疫苗(LN16-I株)對黃羽肉雞的免疫保護效果。本實驗室前期數據表明,該滅活疫苗可以誘導SPF雞、商品蛋雞及商品肉雞產生強烈的體液免疫應答,加強免疫后3周,誘導機體產生的ELISA平均抗體效價分別為7.9×104、7.3×104、3.7×104,中和抗體平均效價分別為7.21 log2、7.6 log2、6.5 log2[19-20,25]。本研究中滅活疫苗加強免疫3周后,黃羽肉雞的ELISA抗體平均效價可達4.2×104,中和抗體平均效價可達7.42 log2。這表明滅活疫苗免疫后同樣可以誘導黃羽肉雞產生較強的體液免疫反應。研究表明,高水平的aMPV特異性抗體可以有效抑制病毒在呼吸道的復制,從而減緩臨床病程[26-27]。此外,中和抗體的水平是評價疫苗免疫效力的關鍵指標,中和抗體可以通過阻斷病毒囊膜與宿主細胞受體的相互作用或抑制病毒基因組的釋放來保護宿主細胞免受病原體的侵害[28],因此本研究中高水平的aMPV特異性抗體和中和抗體可能在預防疾病和病毒清除方面發揮主要作用。

預防發病和減少排毒是評價疫苗免疫效力的關鍵指標[29]。本研究中,攻毒對照組黃羽肉雞在攻毒后的1～7 d內出現了嚴重的臨床癥狀和排毒現象,滅活疫苗免疫組未出現臨床癥狀,高峰期排毒量相比攻毒對照組也降低了約99.43%,表明該滅活疫苗不僅可以預防強毒株引起的呼吸道癥狀,還可以顯著降低強毒株攻擊后的排毒水平,有利于控制aMPV在我國雞群中的流行。此外,未免疫組的黃羽肉雞鼻甲及氣管組織在強毒株攻擊后出現了大量的炎性細胞浸潤及上皮細胞的壞死,而免疫組的雞均未出現明顯病理損傷,這表明,該滅活疫苗能夠保護呼吸道黏膜的完整性,盡管免疫雞呼吸道中可以檢測到部分aMPV,但其低水平的復制不能對機體造成明顯損傷。

4 結 論

本研究首次證明B亞型禽偏肺病毒對黃羽肉雞具有明顯的致病性,B亞型禽偏肺病毒滅活疫苗(LN16-I株)免疫后可為黃羽肉雞提供良好的免疫保護,為控制國內aMPV在黃羽肉雞群中的流行提供了一定的理論支持與技術指導。