新型同種異體骨修復骨缺損動物實驗研究

朱力鳴 焦 昆 劉 偉 李勝利

(1.首都醫科大學實驗動物部,北京 100069)(2. 北京化工大學,北京 100029)

臨床上,因外傷、先天畸形、牙周疾病、開顱手術等各種原因導致的骨缺損十分常見,尤其在骨科、口腔科、神經外科等領域的患者較為集中,上述諸原因造成的大范圍骨缺損是臨床上的一大難題。據統計,我國每年約400萬人需要進行植骨治療[1]。

常見的骨缺損修復方法有自體骨移植、異體骨移植及人工材料等[2]。根據骨移植材料在體內的骨形成特性,理想的植骨移植材料應具有骨生成性、骨誘導性、骨引導性[3]。單純的人工骨材料僅能作為骨引導的支架,缺乏誘導成骨能力,成骨速度慢,效果欠佳,需加入有骨誘導性或骨生成性的移植材料。組織工程學意在將生物材料、細胞以及生物活性分子結合起來,恢復或改善受損或病變組織的生物功能[4]。傳統的骨組織工程是通過將種子細胞接種在支架材料上植入骨缺損處進行修復,但存在種子細胞凋亡、引發免疫炎性反應等缺陷,這將削弱修復效果[5]。人工骨替代材料也具有各自的優勢和缺點,磷酸鈣陶瓷與骨有著相似的化學組成,但其溶解性影響破骨細胞的活性[6],高分子聚合物具有生物活性但機械強度低[7]。異體骨移植存在發生免疫反應、成骨活性差、可能傳播疾病等問題。同種異體骨則可能有效避免異體移植材料的危害,繼而成為當前骨移植材料的重要研究方向。本研究通過動物模型,研究同種異體骨修補骨缺損效果,利用X線觀察實驗動物術后骨的生長愈合情況,借助組織病理學觀察評估該移植材料修補骨缺損的有效性,通過與對照組、空白對照組進行比較,為臨床應用提供實驗數據,以期豐富骨缺損修復的移植材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:成年普通級新西蘭兔,60只,體質量2.2 kg以上,雄性,購自北京富豪實驗動物養殖中心,實驗動物生產許可證號【SCXK(京)2019-0015】,飼養于首都醫科大學實驗動物部,實驗動物使用許可證號【SYXK(京)2018-0003】,實驗動物質量控制及飼養環境均符合國家相關標準規定[8-9]。60只動物隨機分成3組,分別為實驗組、對照組和空白對照組,每組均20只。對于所有實驗組,分別在手術后的第1、4、8和12周時取5只動物,稱體質量、抽血檢測血常規指標及生理生化指標。本實驗項目經首都醫科大學實驗動物福利倫理委員會審查批準,倫理審批號為:AEEI-2022-083。

1.1.2試劑與儀器:同種異體骨(批號:TZG-S1-211124。型號規格:松質骨小塊,DG-SZGXK,0.5 g;皮質骨粒,DG-PZGL-3,0.5 g),由北京桀亞萊福生物技術有限責任公司提供,干燥避光密閉保存,供試品在每次使用前用適量無菌0.9%氯化鈉溶液調和,并在2～3 h內使用完畢。對照品:市售同種骨植入材料。主要儀器:BC-5150全自動血液細胞分析儀(深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司),日立7000型全自動生化分析儀(日立高科技貿易上海有限公司),Strong 204精密微型研磨機(世新精密中國分社)。

1.2 方法

1.2.1動物模型制備方法:將兔稱重,全麻(麻醉劑:舒泰+速眠新,使用劑量分別為:舒泰0.03 mL/(kg·bw),速眠新0.1 mL/(kg·bw),保定,取側臥位,備皮(半徑約3 cm),碘酊消毒,鋪無菌巾。避開皮下血管,切開皮膚、皮下組織及筋膜,切口為2.0 cm,分離肌群,暴露股骨外側面。在股骨近心端之外緣、大轉子下緣1 cm處,用直徑4 mm球頭精密研磨機制備骨缺損,深度以不打穿髓腔、目視隱約可見紅色骨髓為度(防止骨髓腔開放后暴露的髓內干細胞自愈合能力的干擾),此時,骨缺損深度約為1 mm,骨缺損體積約為5.24 mm3。制造骨缺損時予以0.9%沖洗降溫。同樣的方法處理對側股骨。在實驗組和對照組每只兔的左股骨缺損區填充皮質骨粒,右股骨缺損區填充松質骨小塊,輕壓填緊,盡量使材料與孔密合,分層縫合?？瞻捉M動物進行上述同樣手術,不填充任何材料。術后對動物肌注青霉素鈉溶液3 d,劑量為每天80萬單位/只,肌注對乙酰氨基酚注射液3 d,劑量為2.5 mg/(kg·bw)。

1.2.2影像學檢查:在術后1、4、8和12周時進行X線檢測骨缺損區。對各組缺損愈合情況進行評估和影像學評價。

1.2.3病理檢查:包括尸體大體檢驗和器官組織切片的顯微觀察檢驗。

1.2.3.1 尸體檢查:由病理專業人員對研究期間死亡或者被處死的所有動物的尸體進行檢驗。

1.2.3.2 組織病理學檢查:對每組的5只動物行安樂死,切取骨缺損區組織作為標本,10%甲醛常溫固定,標本常規脫鈣、脫水、包埋后行HE染色,分析材料植入后降解、缺損部位的骨形成情況,成骨細胞、炎性細胞浸潤情況等。

1.3 統計學分析

實驗數據使用IBM SPSS Statistics 22軟件對數據進行統計。統計方法為方差分析或雙樣本獨立t檢驗,確定各組實驗結果差異的比較是否有統計學意義。

2 結果

2.1 影像學觀察結果

術后1周X線檢查結果顯示,空白對照組骨缺損明顯。實驗組與對照組影像學結果高度相似,左右側骨缺損明顯,因分別在骨缺損處植入皮質骨粒和松質骨,故缺損處仍顯示較大密度,與空白對照組顯著不同(圖1)。

注:L:左側;R:右側。Note: L:left; R:right.

術后4周,空白對照組,骨缺損較1周時變淺,但仍清晰可見。實驗組骨修復情況與空白對照組差別不太明顯,缺損區可見低密度骨痂,缺損斷端仍較為明顯。對照組骨修復情況亦類似于實驗組,左右側差別同樣不明顯(圖2)。

注:L:左側;R:右側Note: L:left; R:right.

術后8周時,實驗組動物骨修復較4周時有顯著變化,骨痂影密度較高,和正常骨質差別不太大,個別可見斷端。在缺損區周圍尚可見散落填充物顆粒。左右側骨恢復情況區別不明顯。對照組可見缺損,缺損區內可見與正常皮質骨密度不同影像,缺損區周圍仍可見散落之填充物顆粒。上述兩組動物骨修復速度優于空白對照組動物(圖3)。

注:L:左側;R:右側。Note: L:left; R:right.

至術后12周,實驗組動物骨損愈合較佳,骨密質修復完整,圖像顯示骨損區顯影密度與周圍皮質骨相同。實驗組動物樣本左右側骨愈合情況差別不明顯。對照組右側骨愈合情況優于左側骨,與實驗組恢復速度相似?？瞻讓φ战M動物骨損修復情況差于前面兩組動物,個別樣本股骨尚能看到輕度缺損(圖4)。

注:L:左側;R:右側Note: L:left; R:right.

2.2 組織病理學結果

術后1周,解剖取材時肉眼可見,供試品植入物和對照品植入物與原有骨組織尚未有效結合,在取材過程中均可輕易脫離創面,在周圍肌肉組織內,部分動物樣本可見少量散落填充物。3組動物的組織學觀察結果相似,創面殘留菲薄骨質,表面有殘留造模時所致壞死組織及炎性滲出,炎癥不明顯(圖5)。

圖5 術后1周實驗組、對照組及空白對照組骨組織切片(HE,×100)Fig.5 Bone section of experimental group, control group and blank control group 1 week after operation(HE,×100)

術后4周,剖檢時在實驗組和對照組可見植入物與骨組織結合較為緊密,手術區無炎性癥狀。組織學結果顯示,實驗組骨缺損區尚無成型之新生骨組織,可見不連續骨小梁,小梁周邊有大量成骨細胞,同時可見脂肪細胞、新生血管及纖維結締組織。對照組情況相似?？瞻讓φ战M與前面兩組相比,成骨細胞數量、小梁量均偏少。3組動物骨損區內均未見明顯組織壞死和炎性細胞浸潤(圖6)。

圖6 術后4周實驗組、對照組及空白對照組骨組織切片(HE,×100)Fig.6 Bone section of experimental group, control group and blank control group 4 week after operation(HE,×100)

至術后8周,實驗組動物樣本中,供試品吸收較好。顯微鏡下觀察骨小梁更加粗大、密集,但排列尚不規則,新生骨表面成骨細胞密集排列,成骨性肉芽組織浸潤,周邊有較為豐富的毛細血管。對照組與此相似?？瞻讓φ战M與實驗組相比,骨小梁略纖細,成骨性肉芽組織偏少(圖7)。

圖7 術后8周實驗組、對照組及空白對照組骨組織切片(HE,×100)Fig.7 Bone section of experimental group, control group and blank control group 8 week after operation(HE,×100)

術后12周,各組動物新生骨大量形成。相較于空白對照組,實驗組動物樣本的新生骨組織內出現類似骨髓組織。骨小梁的連續性更好,排列更加規則,表面形成致密骨板(圖8)。

圖8 術后12周實驗組、對照組及空白對照組骨組織切片(HE,×100)Fig.8 Bone section of experimental group, control group and blank control group 12 week after operation(HE,×100)

3 討論

本實驗以成年雄性兔為實驗材料,制作骨缺損疾病模型,填充皮質骨?；蛩少|骨小塊以探究骨修復效果。結果表明:動物使用供試品,較使用同類市售產品和不使用填充材料者,生長狀態良好,骨組織修復速度快,愈合效果好。

骨的愈合一般需經歷纖維性骨痂、骨性骨痂及骨痂改建等過程[10]。從實驗結果可以看出,供試品用于實驗動物兔后,經過12周的生長恢復,骨損區結構基本符合正常骨組織的組織結構特點,皮質致密,排列規律[11]。病理學觀察結果表明,供試品能夠刺激間充質細胞分化為成骨細胞,促進成骨細胞產生骨膠纖維和有機骨基質,加速鈣鹽的沉積,推進骨細胞的形成及骨痂成熟,具備理想的植骨材料應兼具骨生成性、骨誘導性及骨引導性之特征,是較為有效的骨移植材料。本研究為增加臨床上骨缺損修復過程中的移植材料奠定了實驗基礎,對植骨材料庫的豐富及擴容提供了研究支撐,但該受試材料的生物力學特性及其他生物學性能,尚需進一步研究探討。