微生物菌劑與大蒜油配施對銀葉病蘋果葉片生理特性及果實品質的影響

陳 悅, 張秀英, 張 丹, 鄧代清, 李玉涵, 程安富, 黃先敏, 馬仲煉, 楊德粉, 全 勇*

(1.昭通學院,云南 昭通 657000;2.昭通市蘋果產業發展中心,云南 昭通 657000)

蘋果銀葉病報道始見于20世紀50年代,是一種能導致蘋果等果樹快速死亡的毀滅性病害,不僅危害蘋果,也危害梨、桃、李等果樹[1]。此病在我國大部分果區都有發生。從2008年開始,在云南昭通銀葉病逐漸成為了影響蘋果生產的主要病害。該病害由真菌引起,病原微生物為Stereumpurpureum(Pers.)Fr.,屬擔子菌亞門韌革菌屬[2]。病原菌在果樹莖干和根的木質部、髓部產生大量的毒素,毒素隨著樹體內的物質運輸傳至整株果樹,對果樹造成嚴重的傷害,甚至導致其死亡。蘋果樹染病后,首先是木質部變為褐色,有腥味,隨著毒素的傳播,果樹葉片也開始出現癥狀,表現為變黃變脆,葉片的上表皮和葉肉中的柵欄組織之間分離,并充滿了空氣,使得葉片在陽光照射下呈現銀白色[3]。發病較輕的果樹樹勢衰弱,發芽遲緩,葉片較小,結果能力逐漸降低;重病樹根系逐漸腐爛死亡,最后整株枯死。病樹枯死后,在枝干表面可產生邊緣卷曲的覆瓦狀淡紫色病菌結構[4]。掌握防治此病害的有效辦法對建立健康果園具有重要意義。

前人對蘋果銀葉病的研究多集中在防治技術上,如利用打孔注藥、樹盤灌根治療[5],不同藥劑不同方式防治效果不盡相同[6-9]。但對蘋果銀葉病生理癥狀逆轉緩解方面報道較少,Grinbergs D等[10]研究比較健康植物、感病植物和恢復植物的生理、內生微生物群落、內生植物對抗性等方面的差異和防御基因表達,證明銀葉病癥狀的逆轉與內生微生物群的變化有關。葉片是進行光合作用的重要器官、果實品質是光合作用產物累積的間接表現,本研究以患銀葉病蘋果樹為材料,采用微生物菌劑與大蒜油配施對患病樹葉片生理特性及果實品質變化進行研究,通過觀察葉片解剖學特征,測定葉片生理生化物質和果實品質指標,探究微生物菌劑與大蒜油配施對患病葉片生理特性逆轉和果實品質的影響,為本病的防治提供理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 地點及材料

試驗于2020—2021年進行,地點位于昭通市昭陽區永豐鎮(103.6oE,27.23oN),平均海拔在2 000 m。年平均氣溫 11.8 ℃,≥10 ℃的年平均活動積溫3 723.7 ℃,年平均降水量 699.6 mm,日照時數1 843.4 h,無霜期221 d[11]。經云南三標農林科技有限公司檢驗,供試果園內的土壤基本數據為:pH值5.2,有機質含量19.6 g/kg,水解性氮(N)含量97 mg/kg,有效磷(P)含量94.9 mg/kg,速效鉀(K)含量428 mg/kg。供試果樹為患銀葉病紅富士蘋果樹,株行距3 m×4 m,行向為東西朝向。

1.2 供試肥料

大蒜油:漯河鑫禾生物科技有限公司生產。

微生物菌劑(果根保):劉氏果業集團公司生產,25 kg/袋。主要成分為巨大芽孢桿菌、膠凍樣芽孢桿菌,增效成分(礦物有機菌):鉀≥5.0 g/kg,鋅≥0.20 g/kg,硼≥0.50 g/kg,鉬≥0.20 g/kg,鈣≥30.0 g/kg,鎂≥20.0 g/kg,硫≥30.0 g/kg,氮≥3.0 g/kg,磷≥6.0 g/kg,有機質≥20.0 g/kg,活性菌0.20億/g;微量及有益元素(錳+銅+硅+鎳+鍶+硒+鈦+鋰+鍺+碘+鋁+鈷+鋇+釔+釤+釹+銪+鈥+鉺+銩+鐠+鈧+鑭)68.0 g/kg。

1.3 試驗處理

選取患有銀葉病蘋果樹18株,每3株作為一個處理小區,另選3株未患病蘋果樹作為對照,共設7個處理。處理如下:CK:健康樹+清水;L1:患病樹+清水;L2:患病樹+微生物菌劑2.5 kg/株;L3:患病樹+微生物菌劑2.5 kg /株+大蒜油50 mL/株;L4:患病樹+微生物菌劑2.5 kg/株+大蒜油150 mL/株;L5:患病樹+微生物菌劑2.5 kg/株+大蒜油250 mL/棵;L6:患病樹+微生物菌劑2.5 kg/株+大蒜油350 mL/株。

連續處理2年,于2020年3月25日和2021年的3月25日、6月25日,在蘋果園地面上順著果樹根系挖6條呈放射狀分布的支溝,溝深20 cm,溝長130 cm,溝寬25 cm,將大蒜油(大蒜油使用前需進行稀釋處理,配制成有效成分為0.05%、0.15%、0.25%、0.35%的大蒜油,即50 mL、150 mL、250 mL、350 mL的大蒜油加入清水定容到100 L[12],每一支溝約施入33.33 L油水混合物)和微生物菌劑交替施入每一條支溝。施肥、除草、修剪、病蟲害防治及疏花疏果等田間管理措施與當地果農保持一致。

1.4 試驗方法

每個指標測定重復3次。

1.4.1 葉片生理指標測定

2021年8月選取1年生枝條上從基部數第8～9片,避開主脈和葉片邊緣部位進行測定。1年生蘋果枝條葉片顏色通過表觀對比;葉片解剖結構做徒手切片并用CX40M生物顯微鏡觀察;采用YMJ-A葉面積儀測定蘋果葉片葉型的基本數據,包括葉面積、葉周長、大葉寬、大葉長、長寬比。采用手持式葉綠素測定儀測定葉片中葉綠素含量。參照蔡永萍[13]的測定方法,用考馬斯亮藍法測定葉片中可溶性糖質量分數,蒽酮比色法測定葉片中可溶性蛋白含量,硫代巴比妥酸法測定葉片中丙二醛含量。

1.4.2 蘋果品質的測定

取樣時間為2021年10月蘋果成熟期,取樣時在樹冠中上部沿東、南、西、北4個方向隨機摘取1個蘋果,每株果樹摘4個蘋果,每個處理共摘12個蘋果進行品質測定。采集的樣品保存于4 ℃冰箱,在1周內完成測量,求其平均值作為最終的測定結果。參照曹建康[14]的試驗方法,采用硬度計測定蘋果果實硬度、2,6-二氯酚靛酚滴定法測定果實中抗壞血酸含量、手持式糖度計測定可溶性固形物質量分數、氫氧化鈉溶液滴定法測定果實中可滴定酸質量分數、蒽酮試劑法測定蘋果中可溶性糖質量分數。

1.5 數據分析

利用WPS Excel 2016統計軟件、SPSS程序軟件(IBM SPSS statistics 26)進行數據計算與統計分析,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同處理1年生蘋果枝條葉片表觀對比分析

與CK對比,處理L1、L2表現1年生枝條葉片均呈銀灰色,處理L3和L4葉片逐漸變綠狀態有所緩解,L5和L6緩解效果較好,葉片翠綠色富有光澤。

由圖1可以看出,正常葉上表皮細胞致密排列,病葉上表皮細胞疏松排列,柵欄組織和葉肉細胞不通透,難以看到細胞之間的界限,可能與蘋果銀葉病的病原菌在果樹莖干和根的木質部、髓部產生大量的毒素運輸至葉片有關。與CK相比,用微生物菌劑和大蒜油處理后,L1、L2柵欄組織和葉肉細胞不通透,難以看到細胞之間的界限;L3和L4可看清柵欄組織和葉肉細胞間間隙;L5和L6可看清柵欄組織和葉肉細胞間間隙,表皮細胞致密排列,葉肉細胞通透清晰,呈綠色。

圖1 蘋果葉片縱切面(200x)

2.2 蘋果葉片生理指標

2.2.1 不同處理的蘋果葉片葉型差異分析

1)葉面積。由表1可知,處理L6(56.250 cm2)葉面積與CK(58.633 cm2)之間差異不顯著,二者均顯著高于處理L1(41.128 cm2)、L2(40.394 cm2)、L3(43.598 cm2)、L4(48.880 cm2)、L5(56.144 cm2);處理L4、L5葉面積顯著高于處理L1、L2;處理L1、L2、L3、L4、L5葉片葉面積比CK葉片葉面積分別減少29.86%、31.11%、25.64%、16.63%、4.25%,差異達顯著水平。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后葉面積減少,通過微生物菌劑與大蒜油配施可使葉片葉面積增加,以L6處理恢復效果最好。

表1 不同處理蘋果葉片差異

2)葉周長。由表1可知,處理L5葉周長(34.580 cm)與CK(35.173 cm)差異不顯著,顯著高于其他處理;處理L1(26.695 cm)、L2(24.960 cm)、L3(28.416 cm)、L4(28.808 cm)、L6(31.036 cm)均顯著低于CK,分別減少24.10%、29.04%、19.21%、18.10%、11.76%;處理L6顯著高于處理L1、L2。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后葉周長減少,通過微生物菌劑與大蒜油配施可使葉周長增加,以L5處理恢復效果最好。

3)大葉長。由表1可知,處理L5(12.170 cm)、L6(10.708 cm)大葉長與CK(10.670 cm)差異不顯著,顯著高于處理L1(8.804 cm)、L2(9.292 cm)、L3(9.488 cm);處理L5顯著高于除L6之外其他處理;且所有處理均顯著高于處理L1,處理L1葉片大葉長比CK減少17.49%,差異顯著。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后大葉長減少,通過微生物菌劑與大蒜油配施可使大葉長增加,以L5處理效果最好。

4)大葉寬。由表1可知,處理L5(7.634 cm)、L6(7.748 cm)大葉寬顯著高于處理L1(6.178 cm)、L2(6.230 cm)、L3(6.814 cm);處理L1葉片大葉寬比CK減少31.51%,差異顯著。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后大葉長減少,通過微生物菌劑與大蒜油配施可使大葉長增加,以L5、L6處理效果最好。

綜合表1可知,蘋果樹感染銀葉病后葉片葉面積、葉周長、大葉長和大葉寬均顯著減少,通過微生物菌劑與大蒜油配施后使葉面積、葉周長、大葉長和大葉寬均增加。

2.2.2 不同處理的蘋果葉片生理特性特征差異分析

葉綠素:植物體內的葉綠素參與光合作用。由表2可知,CK葉綠素含量(54.971)顯著高于處理L1(46.572)、L2(48.786)、L3(49.786)、L4(50.153)、L5(52.356)、L6(52.811),分別高出15.28%、11.25%、9.43%、8.76%、4.76%、3.93%;處理L5、L6葉綠素含量顯著高于其他處理,提高4.21%%～11.81%。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后葉綠素含量降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可提高葉片葉綠素的含量,以L6處理效果最好。

表2 不同處理的蘋果葉片生理特性特征差異

可溶性蛋白:植物體內的可溶性蛋白質大部分是參與各種代謝的酶類。由表2可知,處理L1(9.783 mg/g)、L2(10.480 mg/g)葉片可溶性蛋白含量顯著低于CK(12.443 mg/g),分別降低21.38%、15.78%;處理L4(13.040 mg/g)、L5(13.947 mg/g)、L6(13.280 mg/g)可溶性蛋白含量顯著高于處理L1、L2;處理L5顯著高于CK,可溶性蛋白含量提高了10.78%。處理L2和L1之間無顯著差異,處理L3、L4、L5、L6和L1之間差異顯著,提高7.12%～29.86%。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后可溶性蛋白質含量降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可提高葉片蛋白質含量,以L5處理效果最好。

可溶性糖:糖類物質提供了合成抗逆物質的碳源。由表2可知,CK葉片可溶性糖質量分數(5.465%)顯著高于其他處理,蘋果樹患銀葉病后葉片可溶性糖質量分數降低14.78%～23.77%;施用微生物菌劑與大蒜油后,葉片中可溶性糖質量分數有多提高,處理L5(4.657%)顯著高于L1(4.166%),提高11.79%;其余處理之間無顯著性差異。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后可溶性糖質量分數降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可提高葉片可溶性糖質量分數,以L5處理效果最好。

丙二醛:丙二醛含量的高低直接反映出植物受到脅迫的程度高低,丙二醛含量越高說明植物的受傷程度越嚴重。由表2可知,處理L1丙二醛含量(68.057 nmol/g)顯著高于CK(21.740 nmol/g),提高213.05%;施用微生物菌劑與大蒜油后,丙二醛含量顯著降低,降低范圍在25.31%～46.36%;處理L5(36.933 nmol/g)、L6(36.507 nmol/g)丙二醛含量顯著低于其他處理,但兩者之間差異不顯著。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后丙二醛含量上升,通過微生物菌劑與大蒜油配施可降低丙二醛含量,以L5、L6處理效果較好。

綜合表2可知,蘋果樹感染銀葉病后葉片葉綠素、可溶性蛋白質和可溶性糖質量分數均顯著降低,丙二醛含量升高。通過微生物菌劑與大蒜油配施后葉片葉綠素、可溶性蛋白質和可溶性糖質量分數均顯著增加,丙二醛含量顯著降低,且處理L5效果最好。

2.3 不同處理的蘋果果實品質分析

硬度:由表3可知,處理L1果實硬度(8.323 kg/cm2)比CK果實硬度(12.827 kg/cm2)降低35.11%,差異顯著;處理L2(9.913 kg/cm2)、L3(10.157 kg/cm2)、L4(11.200 kg/cm2)、L5(11.720 kg/cm2)、L6(11.093 kg/cm2)與CK果實硬度之間差異顯著,降低8.63%～22.72%,其中L5果實硬度降低最少,降低8.63%。處理L2、L3、L4、L5、L6和L1之間差異顯著,果實硬度大小為L5>L4>L6>L3>L2>L1。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后果實硬度降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可提高果實硬度,以L5處理效果最好。

表3 不同處理的蘋果果實品質的比較

可溶性固形物:由表3可知,處理L1果實可溶性固形物質量分數(16.400%)比CK(18.600%)降低11.83%,差異顯著;處理L2(16.968%)、L3(16.400%)、L4(17.467)、L6(17.800%)與CK果實可溶性固形物之間差異顯著,降低3.05%～11.83%;L5與CK果實可溶性固形物之間差異不顯著,僅降低3.05%;處理L4、L5、L6和其他處理之間差異顯著;其他處理間差異不顯著。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后果實可溶性固形物質量分數降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可提高果實可溶性固形物質量分數,以L5處理效果最好。

抗壞血酸:由表3可知,處理L1果實抗壞血酸含量(7.292 mg/100 g)比CK(12.293 mg/100 g)降低40.64%,差異顯著;處理L2(7.353 mg/100 g)、L3(8.403 mg/100 g)、L4(9.627 mg/100 g)、L5(10.863 mg/100 g)、L6(10.740 mg/100 g)與CK果實抗壞血酸之間差異顯著,降低11.63%～40.10%;L5與CK果實抗壞血酸之間差異最小,降低11.63%。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后果實抗壞血酸含量降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可提高果實抗壞血酸含量。

可滴定酸:由表3可知,處理L1果實可滴定酸質量分數(0.396%)比CK(0.238%)增加66.39%,差異顯著;處理L2、L3、L4、L5和L6與CK果實可滴定酸之間差異顯著,增加21.43%～63.45%,其中L2和L1,L3和L4之間無顯著性差異,L5可滴定酸增加最少,增加21.43%。果實可滴定酸質量分數:L1>L2>L3>L4>L6>L5。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后果實可滴定酸質量分數會增加,通過微生物菌劑與大蒜油配施可降低可滴定酸的質量分數。

可溶性糖:由表3可知,處理L1果實可溶性糖質量分數(13.523%)比CK(16.190%)降低16.47%,差異顯著;處理L2、L3和L4與CK果實可溶性糖質量分數之間差異顯著,降低8.8%～16.70%;L2、L3和L1,L5和L6之間無顯著性差異,L5可溶性糖降低最少,降低0.88%。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后果實可溶性糖質量分數降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可增加可溶性糖的質量分數,以L5處理效果較好。

固酸比和糖酸比:由表3可知,果實固酸比和糖酸比處理L1比CK分別降低47.17%和50.05%,差異顯著;處理L2、L3、L4、L5、L6與CK果實固酸比差異顯著,降低19.81%～44.35%,其中L5和L6之間無顯著性差異,L5固酸比降低最少,降低19.81%;處理L2、L3、L4、L5、L6與CK果實糖酸比差異顯著,降低18.35%～49.32%,其中L2和L1,L3和L4之間無顯著性差異,L5糖酸比降低最少,降低18.35%。由此可見,蘋果樹感染銀葉病后果實固酸比和糖酸比均降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可增加果實固酸比和糖酸比,以L5處理效果較好。

綜合表3可知,蘋果樹感染銀葉病后果實硬度、可溶性固形物質量分數、抗壞血酸含量、固酸比、糖酸比均顯著降低,可滴定酸質量分數增加。通過微生物菌劑與大蒜油配施,提高了蘋果果實硬度、可溶性固形物質量分數、抗壞血酸含量、固酸比、糖酸比,降低了可滴定酸質量分數,且L5效果較好。

3 討論

本研究發現微生物菌劑與大蒜油配用對患有銀葉病的果樹葉片有較好的恢復緩和效果,一定程度上提高果實品質。通過觀察蘋果樹1年生枝條葉片形態特征和葉片解剖學特征發現:患銀葉病果樹葉片褪綠,在陽光下呈銀灰色,這與張慧杰[15]、BurgerY[16]對西葫蘆銀葉病葉片的研究結論相同,還觀察到蘋果銀葉病葉片的葉肉細胞呈墨綠色,這可能是由于葉肉組織厚度隨著病害程度的加深而變厚[17],導致細胞間的界限不明顯,通過微生物菌劑與大蒜油配施這一現象有所緩解,葉片表觀顏色和解剖學特性與正常葉片差別不大。

果樹葉型對營養物質的積累有著至關重要的作用,蘋果患銀葉病后,葉面積、葉周長、大葉長和大葉寬顯著減小,只添加微生物菌劑對其影響無顯著性差異,通過大蒜油與微生物菌劑配施可有效增加葉片葉面積、葉周長、大葉長和大葉寬。葉片SPAD值可以反映植物葉片中葉綠素含量的相對大小,對葉片的生長具有重要的作用,能夠直接反應葉片的健康狀況,是用來評價植物長勢的有效手段[18]。本研究中患病葉片葉綠素含量降低,通過微生物菌劑與大蒜油配施可提高葉片葉綠素的含量。葉片患銀葉病后蛋白質代謝紊亂主要表現在可溶性蛋白含量降低,本研究中患病葉片可溶性蛋白質含量降低,與郝樹芹[17]、張立瑩[19]研究結果一致?；疾『笊泶x失調也加劇糖類物質的消耗,植株發生銀葉病后葉片光合速率降低從而導致光合產物減少當消耗大于產出時糖含量降低,本研究患病葉片可溶性糖質量分數降低,與Burger[16]、D.R[20]研究結果一致。蘋果樹在逆境環境下會產生大量的丙二醛,丙二醛的過多積累能導致細胞死亡,可直接反映植物遭受傷害的程度,本研究中患病葉片丙二醛含量升高,與王彩霞等人[21]研究結果一致。通過微生物菌劑與大蒜油配施增加葉片可溶性蛋白和可溶性糖質量分數,降低丙二醛含量。

蘋果果實內在品質是其商品性優劣的重要標志,果實硬度、可溶性固形物、抗壞血酸、可滴定酸、可溶性糖、固酸比、糖酸比均是評價果實品質的重要指標[22]。本研究中通過微生物菌劑和大蒜油配施可改善患病蘋果樹果實內在品質。

微生物菌劑已被廣泛應用在治療植物有關病原真菌上。Weindling[23]的研究表明木霉菌對植物的病原真菌有著良好的拮抗效果,多年來國外研究者對木霉菌劑的研制做了很多的研究。研究發現,巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)BM1、貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis) RC218均能夠明顯減小小麥赤霉病的發生,還能抑制病原菌毒素的合成[24-25]。大蒜油對病原真菌也有一定的治療作用。王小青等[9]在患銀葉病蘋果樹體打孔法注入營養液與多菌靈,同時樹體打孔注入大蒜油可以治療蘋果銀葉病。但本研究中未單獨研究大蒜油對患銀葉病蘋果樹葉片生理特性及果實品質的影響,單獨使用微生物菌劑時其對患病葉片生理狀態恢復及提高果實品質方面不如添加了大蒜油處理效果,隨著大蒜油濃度的增加其作用效果也在增加,說明大蒜油在恢復緩解患病樹體方面起到了一定的作用,有待下一步繼續加強研究。

4 結論

微生物菌劑與大蒜油配用后通過觀察1年生枝條葉片表觀和縱切面、測定蘋果葉片生理特征差異和果實品質分析發現,微生物菌劑與大蒜油配施對銀葉病蘋果葉片生理特性及果實品質影響較大,配施微生物菌劑2.5 kg /株+大蒜油250 mL /株(處理L5)效果最好。