Spondin-2 在肝細胞癌組織中的表達及對預后的預測價值

胡亞朋 袁春鑾

肝細胞癌（HCC）具有發病率和病死率均較高的特點，給患者的生命安全帶來嚴重威脅[1]。近年來，肝移植術、肝切除術等外科手術快速發展，已被廣泛應用于治療HCC 患者；然而，術后復發率較高仍是臨床面臨的問題，且轉移性HCC 和進展期HCC 患者的5年生存率均較低[2-3]。研究表明，脊椎蛋白-2（Spondin-2）參與了前列腺癌、HCC、卵巢癌等多種惡性腫瘤的發生和進展過程，其與腫瘤細胞的增殖、浸潤及遷移等密切相關[4-6]。研究報道，下調Spondin-2 表達能夠抑制HCC 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，提示Spondin-2 在HCC的病程中起著調控作用[7]。目前關于HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者臨床病理特征及預后關系的報道較少，本研究對此進行了探討，以期為HCC 患者的預后預測提供參考依據，并為HCC 提供新的治療靶點。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2019年5月至2020年1月連云港市第一人民醫院收治的89 例HCC 患者作為研究對象，其中男性47 例，女性42 例，年齡23～77 歲，平均年齡為（54.19±6.28）歲。納入標準：（1）符合《原發性肝癌規范化病理診斷指南（2015年版）》[8]中HCC 的診斷標準，且均經病理檢查確診；（2）接受HCC 根治術；（3）既往未接受放射治療、化學治療和介入治療等其他治療；（4）Child-Pugh 分級為A 級或B 級；（5）均簽署知情同意書。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）有遠處轉移；（3）有肝、腎等重要臟器功能障礙；（4）合并血液系統疾??；（5）合并精神疾??；（6）妊娠期或哺乳期女性；（7）合并自身免疫病。剔除標準：（1）失訪者；（2）治療期間死亡者；（3）依從性較差者。本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準（批件號20190425）。

1.2 資料收集

入組患者均接受HCC 根治術，術后切取HCC 組織和癌旁組織（距離腫瘤組織邊緣5～8 cm），取材后即刻送至病理科檢測。收集入組患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移情況、Child-Pugh 分級、腫瘤數目、腫瘤包膜完整性、TNM 分期和微血管侵犯情況等。術前采集患者靜脈血4 mL，3 500 r/min 離心10 min（離心半徑6 cm），采集上清液，采用放射免疫法檢測血清甲胎蛋白（AFP）水平，采用免疫比濁法檢測血清總膽紅素（TBil）水平，試劑盒均購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 Spondin-2 的表達水平檢測

采用免疫組織化學法檢測入組患者HCC 組織和癌旁組織中Spondin-2 的表達水平。組織標本經石蠟包埋、切片，隨后滅活、微波抗原修復，用PBS 溶液沖洗2～3 次，加入抗Spondin-2 一抗（購自武漢友聯特生物技術有限公司），4 ℃孵育過夜，用PBS 溶液沖洗2～3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗[購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，孵育15 min，用PBS 溶液沖洗2～3 次，使用DAB顯色液（購自北京雷根生物技術有限公司）顯色，用自來水沖洗2～3 次，蘇木精復染，脫水封片。陽性細胞染色等級評分標準：棕黃色記3 分，黃色記2 分，淺黃色記1 分，邊緣無染色記0 分。陽性細胞占比評分標準：＞75%記4 分，51%～75%記3 分，26%～50% 記2 分，5%～25% 記1 分，＜5%記0 分?？傇u分＝陽性細胞染色等級評分×陽性細胞占比評分，總評分為0 分判定為Spondin-2 陰性表達，＞0 分判定為Spondin-2 陽性表達。

1.4 隨訪

采用電話、門診復查等方式對89 例HCC 患者進行為期3年的隨訪。隨訪起始時間為術后，每3個月隨訪1 次，當至少有2 種影像學檢查結果顯示HCC 的典型影像學特征——“快進快出”時判定為復發，隨訪截至2023年1月31 日或患者復發，記錄HCC 患者的無瘤生存情況。

1.5 統計學方法

應用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析。計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，以log-rank 檢驗分析HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者無瘤生存率的關系。采用Cox 比例風險回歸模型分析影響HCC 患者復發的因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HCC 組織與癌旁組織中Spondin-2 的表達水平比較

HCC 組織中Spondin-2 的陽性表達率為82.02%（73/89），顯著高于癌旁組織（51.69%，46/89），2組的差異有統計學意義（χ2＝18.482，P＜0.001）。

2.2 HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者臨床病理特征的關系

由表1 可知，低分化、腫瘤包膜不完整、TNM 分期Ⅲ期、有微血管侵犯者的HCC 組織中Spondin-2 的陽性表達率分別高于中高分化、腫瘤包膜完整、TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期、無微血管侵犯者，組間的差異均有統計學意義（P均＜0.05）。

表1 HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者臨床病理特征的關系

2.3 HCC 患者術后復發的影響因素分析

隨訪結果顯示，89 例HCC 患者中有7 例失訪（其中2 例為Spondin-2 陰性表達，5 例為Spondin-2陽性表達），其余82 例患者中有43 例 （52.44%）復發，39 例（47.56%）未復發。

單因素Cox 回歸模型分析結果顯示，分化程度、腫瘤包膜完整性、TNM 分期、微血管侵犯和Spondin-2 均是影響HCC 患者術后復發的重要因素（P均＜0.05）。以單因素分析中差異有統計學意義的項目，包括分化程度（中高分化＝0，低分化＝1）、腫瘤包膜完整性（完整＝0，不完整＝1）、TNM 分期（Ⅰ～Ⅱ期＝0，Ⅲ期＝1）、微血管侵犯（無＝0，有＝1）、Spondin-2（陽性表達＝1，陰性表達＝0）作為自變量，以HCC 患者的預后復發情況（未復發＝0，復發＝1）作為因變量，納入多因素Cox 回歸模型分析，結果顯示分化程度、腫瘤包膜完整性、TNM 分期、微血管侵犯和Spondin-2 均是影響HCC患者術后復發的獨立危險因素（P均＜0.05）。見表2。

表2 影響HCC 患者復發的單因素和多因素Cox 回歸模型分析

2.4 HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者無瘤生存率的關系

隨訪結果顯示，82 例患者中有39 例（47.56%，39/82）無瘤生存，在14 例Spondin-2 陰性表達者中有12 例無瘤生存，在68 例Spondin-2 陽性表達者中有27 例無瘤生存。Kaplan-Meier 生存曲線分析結果顯示，Spondin-2 陽性表達者的無瘤生存率（39.71%，27/68）低于Spondin-2 陰性表達者（85.71%，12/14），2組的差異有統計學意義（log-rankχ2＝5.355，P＝0.021）。見圖1。

圖1 HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者無瘤生存率的關系

3 討論

HCC 細胞的增殖情況能夠反映HCC 的生物學特征，且與HCC 根治術的治療效果密切相關。Spondin-2 是分泌性細胞外基質蛋白F-spondin 家族成員，與神經元的發育、激發自身免疫反應等多種生物學過程密切相關[9]。研究表明，Spondin-2 在胃癌的發生和進展過程中起促癌作用，可作為胃癌診斷的生物標志物[10]。本研究通過免疫組織化學法檢測HCC 組織和癌旁組織中Spondin-2 的表達情況，并分析HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者臨床病理特征及無瘤生存率的關系，以期為HCC的治療提供新的思路。

研究表明，與AFP＜400 μg/L 的HCC 患者相比，AFP≥400 μg/L 患者的生存率較低；與TBil＜18 μmol/L 的HCC 患者相比，TBil≥18 μmol/L 患者的肝功能較差[11-12]。因此，本研究中AFP、TBil 分別以400 μg/L、18 μmol/L 為界對患者進行分組。本研究結果顯示，HCC 組織中Spondin-2 的陽性表達率顯著高于癌旁組織，且低分化、腫瘤包膜不完整、TNM 分期Ⅲ期、有微血管侵犯患者的HCC 組織中Spondin-2 的陽性表達率分別高于中高分化、腫瘤包膜完整、TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期及無微血管侵犯者。這提示HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者的腫瘤分化程度、腫瘤包膜完整性、TNM 分期、有無微血管侵犯等臨床病理特征均密切相關。腫瘤的發生和進展是由腫瘤細胞與細胞外基質、腫瘤相關基質細胞、細胞外基質降解酶、細胞因子等腫瘤微環境的相互作用所引起的，其中細胞外基質是腫瘤細胞與微環境相互作用的基礎，細胞外基質成分的分布、降解與合成在腫瘤的血管生成及腫瘤細胞的遷移和增殖中發揮著重要作用[13-14]。目前，以細胞外基質作為藥物靶點來開發新型藥物已逐漸成為臨床研究的熱點。Spondin-2 包含331 個氨基酸殘基，其相對分子質量約為36 000，該蛋白可與細胞外基質結合，介導細胞外基質與細胞間的相互作用，其與適應性免疫反應及固有免疫反應關系密切[15]。研究報道，在甲狀腺激素的正向調控下，Spondin-2 參與了胃癌細胞的侵襲和遷移等多種生物學過程[16-17]；此外，Spondin-2 可通過與海馬神經元的受體結合而促進胚胎海馬神經元的黏附和生長[18]。

本研究結果顯示，腫瘤包膜完整性、分化程度、微血管侵犯、TNM 分期和Spondin-2 均是影響HCC 患者術后復發的獨立危險因素。既往研究報道，肺腺癌組織中Spondin-2 呈高表達，其表達水平與腫瘤分化程度密切相關，且能夠預測患者的無瘤生存情況[19]。本研究的生存分析結果顯示，Spondin-2 陽性表達者的無瘤生存率低于Spondin-2陰性表達者，提示HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者預后密切相關，且HCC 組織中Spondin-2 陽性表達表明患者術后復發風險較高。

綜上所述，HCC 組織中Spondin-2 的表達與患者臨床病理特征及預后密切相關，且Spondin-2 陽性表達者的預后不良風險較高。本研究存在一定的不足之處，如本研究未對HCC 患者的病因進行分類分析，且未探討Spondin-2 的表達對預后的預測價值，其最佳截斷值、診斷效能等尚未明確，后續可進行多中心研究進一步探討。