血清miR-150-5p 和LTBP-2 檢測在急性腦梗死患者病情評估中的價值

薛亞澤 何 勁 唐紹軍

（義烏復元私立醫院神經內科，浙江 金華 322000）

急性腦梗死（acute cerebral infarction，ACI）是腦組織血液供應不足引起的局部缺血和缺氧所導致的一系列神經功能障礙癥狀，其致殘和致死率較高[1]。目前，ACI常用的診斷方法為電子計算機斷層掃描（computed tomography，CT）和磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI），但對于早期有缺血病灶和體內有金屬支架的患者存在一定的局限性，因此有必要尋找更有效的檢測指標。另外，ACI的病情復雜多變，臨床亟需可有效監測病情嚴重程度的指標[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）可通過結合mRNA的3'-非翻譯區來參與調控靶基因的表達，其在血清等體液中以穩定形式存在，因此可通過檢測其表達來評估機體的生理病理狀態。有研究結果顯示，老年急性缺血性腦卒中患者血清miR-150-5p水平異常降低，且與神經功能缺損程度有關[3-4]。潛伏轉化生長因子結合蛋白（latent transforming growth factor-beta binding protein，LTBP）2作為LTBP家族成員之一，在機體動脈損傷、彈性纖維凝聚和細胞黏附中具有重要作用。有研究結果顯示，冠心病患者血清LTBP2水平顯著升高，可能參與了冠心病的發生[5]。冠心病具有和ACI相似的發病機制，均是由血流受阻造成細胞缺血、缺氧，最終導致組織器官壞死。LTBP2與ACI發生的關系尚未見報道。因此，本研究擬探討ACI患者血清miR-150-5p和LTBP2水平與ACI病情嚴重程度的關系，以期為ACI的臨床監測提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年5月—2021年2月義烏復元私立醫院確診的ACI患者121例（ACI組），其中男67例、女54例，年齡（62.01±7.36）歲。納入標準：1）符合ACI臨床診斷標準[6]；2）經CT或MRI確診；3）初次發病。排除標準：1）有惡性腫瘤史；2）合并意識障礙；3）近期進行過手術或有創傷史。根據ACI患者發病48～72 h內的腦梗死體積，分為小梗死（梗死體積≤4 cm3）組（38例）、中梗死（梗死體積為＞4～≤10 cm3）組（43例）、大梗死（梗死體積＞10 cm3）組（40例）；采用美國國立衛生研究院卒中量表（the National Institute of Health Stroke Scale，NIHSS）[7]評估ACI患者神經功能缺損程度，將ACI患者分為輕度（NIHSS評分＜5分）組（40例）、中度（NIHSS評分5～20分）組（42例）、重度（NIHSS評分＞20分）組（39例）。選取同期義烏復元私立醫院體檢健康者128名（正常對照組），其中男70名、女58名，年齡（60.27±8.49）歲。納入標準：無基礎疾病，體格檢查和相關實驗室檢測提示身體健康。2個組之間年齡、性別差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經義烏復元私立醫院倫理委員會批準（2021042912），所有研究對象及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器

反轉錄試劑盒（貨號638314）購自上海百賽生物技術股份有限公司。熒光定量PCR試劑盒（貨號T427S/L）購自廣州英贊生物科技有限公司?？俁NA提取試劑盒（貨號AR1200-50T）購自上海吉至生化科技有限公司。Lepgen-96實時熒光定量PCR儀購自北京樂普診斷科股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 一般資料收集和樣本采集

收集所有研究對象的一般資料，包括年齡、性別、體重指數（body mass index，BMI）、飲酒史、吸煙史、高血壓史。采集ACI患者入院6 h內和正常對照組體檢當日清晨空腹靜脈血5 mL，1 007×g離心15 min，分離血清，-80 ℃保存待測。

1.3.2 血清miR-150-5p及LTBP-2 mRNA檢測

采用總RNA提取試劑盒提取血清樣本中的總RNA，采用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量聚合酶鏈反應。引物由深圳華大基因公司設計、合成，引物序列見表1。分別以U6和β-actin作為miR-150-5p和LTBP-2的內參。反應條件：95 ℃預變性15 min；95 ℃變性15 s，65 ℃退火延伸45 s，40個循環。反應體系：cDNA（50 ng/μL）2 μL，SYBR Green Master Mix（2×）10 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，加ddH2O至20 μL。采用2-ΔΔCt法計算miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量。

表1 引物序列

1.3.3 Targetscan網站預測

采用Targetscan在線軟件（http：//www.targetscan.org/vert_72/）預測miR-150-5p與LTBP-2之間的結合位點。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。呈正態分布的計量資料以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。采用Pearson相關分析評估ACI患者miR-150-5p與LTBP-2的相關性。采用Logistic回歸分析評估ACI發生的影響因素。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ACI組與正常對照組一般資料比較

ACI 組與正常對照組BMI、飲酒史、吸煙史、高血壓史差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 ACI組與正常對照組一般資料比較

2.2 ACI組與正常對照組血清miR-150-5p和LTBP-2相對表達量比較

與正常對照組比較，ACI組血清miR-150-5p相對表達量顯著降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相對表達量顯著升高（P＜0.001）。見表3。

表3 ACI組與正常對照組血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量比較

2.3 不同梗死體積ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量比較

小梗死組、中梗死組和大梗死組血清miR-150-5p相對表達量依次降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相對表達量依次升高（P＜0.001）。見表4。

表4 不同梗死體積ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量比較

2.4 不同NIHSS評分ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量比較

輕度組、中度組和重度組血清miR-150-5p相對表達量依次降低（P＜0.001），LTBP-2 mRNA相對表達量依次升高（P＜0.001）。見表5。

表5 不同NIHSS評分ACI患者血清miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量比較

2.5 ACI患者血清miR-150-5p與LTBP-2的相關性

Targetscan網站預測結果顯示：miR-150-5p和LTBP-2之間存在結合位點，見圖1。LTBP-2是miR-150-5p潛在的靶基因。

圖1 miR-150-5p與LTBP-2的結合位點

Pearson相關分析結果顯示，ACI組血清miR-150-5p表達與LTBP-2表達呈負相關（r=-0.346，P＜0.001）。見圖2。

圖2 ACI患者血清miR-150-5p與LTBP-2 mRNA表達的相關性

2.6 ACI發生的危險因素分析

將是否發生ACI作為因變量（未發生=0，發生=1），miR-150-5p和LTBP-2 mRNA相對表達量作為自變量（賦值均為實測值）。多因素Logistic回歸分析結果顯示，miR-150-5p表達降低、LTBP-2 mRNA表達升高是ACI發生的危險因素[比值比（odds ratio，OR）值分別為0.563、1.698，95%可信區間（confidence interval，CI）分別為0.445～0.712、1.342～2.148]。見表6。

表6 ACI發生的危險因素分析

3 討論

動物實驗結果顯示，促進血管生成有助于恢復血液供應，促進大腦恢復，改善小鼠腦缺血情況[8-9]。miR-150-5p是一個相對保守的miRNA，在調節血管生成中具有重要作用。有研究發現，中風模型大鼠腦組織和血清中miR-150相對表達量異常降低[10]。大鼠骨髓來源的內皮祖細胞可分化成血管內皮細胞，并分泌多種促血管生成因子，以此促進缺血組織中血管新生，miR-150過表達可提高內皮祖細胞的成管能力，除此之外，內皮祖細胞遷移至深靜脈血栓中還可促進血栓再通，而miR-150高表達能顯著提高細胞的遷移能力[11]。還有研究發現，缺血性腦卒中患者外周血miR-150-5p相對表達量顯著低于正常對照組（P＜0.001），與缺血性腦卒中的發生密切相關[12]。本研究結果顯示，ACI組血清miR-150-5p相對表達量顯著低于正常對照組（P＜0.001），且隨梗死體積和NIHSS評分的增加而降低（P＜0.001），表明miR-150-5p參與了ACI的發生，并隨疾病嚴重程度增加而顯著降低，有作為ACI監測指標的潛能，連續監測或可用于判斷疾病進展程度。

LTBP-2作為細胞外基質糖蛋白，在心臟、大腦中均有表達，其在血管內皮損傷和彈性纖維凝聚等方面具有重要作用[13]。冠心病患者血清LTBP-2相對表達量隨疾病嚴重程度加重而升高[14-15]。冠心病和ACI作為心腦血管疾病中的兩大主要疾病，均是由細胞缺血、缺氧造成組織壞死所導致的，因此本研究檢測了ACI患者血清LTBP-2的表達情況。本研究結果顯示，相較于正常對照組，ACI組血清LTBP-2相對表達量顯著升高（P＜0.001），并隨梗死體積和NIHSS評分的增加而升高（P＜0.001）。表明LTBP-2同樣參與了ACI的發生、發展，其相對表達量與疾病嚴重程度密切相關，這為ACI的發生和治療的機制研究提供了一個新的研究方向。

本研究通過靶基因預測發現LTBP-2是miR-150-5p潛在的靶基因，兩者呈顯著負相關（r=-0.346，P＜0.001）。提示miR-150-5p與LTBP-2可能共同參與了ACI的發生。因此，miR-150-5p參與ACI的發生可能與調控LTBP-2表達有關。本研究多因素Logisitc回歸分析結果顯示，miR-150-5p低表達和LTBP-2高表達均是ACI發生的危險因素（OR值分別為0.563、1.698，95%CI分別為0.445～0.712、1.342～2.148）。提示miR-150-5p和LTBP-2與ACI的發生密切相關，因此，miR-150-5p和LTBP-2或可作為ACI臨床監測指標。

綜上所述，ACI患者血清miR-150-5p呈低表達，LTBP-2呈高表達，二者與疾病嚴重程度密切相關，或可作為ACI病情監測的參考指標。本研究為尋找ACI臨床監測指標提供了一個新的方向，但還需對ACI患者進行隨訪，觀察患者預后和轉歸情況，以期為ACI患者的預后評估提供更全面的參考。