陰道分泌物常規檢測模式性能評價和復檢規則分析

陸庭嫣 顧丹鳳 王亞虹 葛亞芳 楊海鷗

（上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院檢驗科 上海市胚胎源性疾病重點實驗室，上海 200030）

陰道分泌物顯微鏡鏡檢（白帶常規）是女性細菌性陰道?。╞acterial vaginosis，BV）、外陰陰道假絲酵母菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）、滴蟲性陰道炎（trichomonas vaginitis，TV）和炎癥細胞評估的常規檢驗項目[1]。近年來，隨著檢驗技術自動化和智能化的不斷發展，白帶常規檢測經歷了從人工鏡檢到半自動干化學分析，再到全自動有形成分聯合干化學檢測的發展過程[2-5]，檢測效率逐步提升。然而，干化學酶檢測具有局限性[6-9]，白帶有形成分具有多樣性[10]，為了驗證和了解各種檢測模式對疾病篩查的準確性和敏感性，本研究結合實驗室現有儀器設備，對不同檢測模式的臨床漏診率和實驗室復檢率進行分析，建立優選檢測模式顯微鏡復檢規則，并進行驗證。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2021年2—5月上海交通大學醫學院附屬國際和平婦幼保健院門診患者陰道拭子1 334份，其中1 064份用于建立規則的樣本不限制送檢科室來源和患者年齡，連續隨機納入，每天不超過50份；270份用于規則驗證的樣本主要選自婦科門診、宮頸門診等陰道炎癥患者較多的臨床科室門診，以確保小樣本量情況下BV、VVC、TV的陽性驗證需求。樣本采集部位和方法參照第4版《全國臨床檢驗操作規程》[1]。

1.2 儀器和試劑

重慶天海公司BD500白帶檢測分析儀和配套一次性計數板、清洗液。石家莊博洋生物科技公司陰道炎五聯檢試劑盒。鄭州安圖公司AutowoMO生殖道分泌物干化學檢測儀和配套試劑。日本Olympus公司CX41光學顯微鏡。革蘭染液（珠海貝索公司）。

1.3 方法

采集后的樣本由專人負責處理，取樣后1 h內完成檢測。將儀器檢測后的剩余樣本混勻，用一次性滴管等量滴加2張玻片，1張用于人工鏡檢白細胞計數和線索細胞、菌絲/孢子、滴蟲；1張待自然干燥后用火焰固定，行革蘭染色鏡檢。2種鏡檢分別由1名有經驗的檢驗技師雙盲完成。根據說明書要求進行操作和結果判定。

1.3.1 參考方法

依據國內外相關指南[11-13]推薦的B V、VVC、TV診斷參考方法，本研究將濕片鏡檢聯合革蘭染色鏡檢（簡稱聯合鏡檢）結果作為不同檢測模式性能評估和復檢方案驗證的標準。濕片鏡檢判斷標準依據第4版《全國臨床檢驗操作規程》[1]，革蘭染色鏡檢判斷標準依據Nugent評分標準[14]。以濕片10個高倍鏡視野均值為白細胞計數結果；革蘭染色5～10個視野區域內Nugent評分≥7分為BV陽性；以濕片鏡檢或革蘭染色鏡檢任一方法陽性為真菌菌絲/孢子陽性；滴蟲以濕片鏡檢陽性為標準，但當鏡下活動度減弱疑似不確定時，需補充核酸檢測進行確認，并以核酸檢測結果為準。

1.3.2 檢測模式

模式1：陰道炎五聯檢；模式2：儀器法干化學酶檢測；模式3：儀器法有形成分分析；模式4：儀器法有形成分分析聯合陰道炎五聯檢；模式5：儀器法有形成分聯合儀器法干化學酶檢測。

1.3.3 3類初始復檢方案

目前，我國陰道分泌物自動/半自動檢測系統的顯微鏡復檢方案相關文獻較少，也缺乏相應的規范化文件可供參考。陰道分泌物有形成分和干化學檢測的方法和原理與同為體液學檢驗領域的尿液有形成分和干化學分析極為相似，但又與尿液檢測中細胞的定量分析要求不同：BV、VVC、TV相應病原體在陰道分泌物有形成分中的形態識別和確認是疾病篩查的重要依據?！蛾幍牢⑸鷳B評價的臨床應用專家共識》[15]指出，若形態學檢測與功能學檢測結果不一致，以形態學結果為主要參考指標。本實驗室基于陰道分泌物檢測特性，并參考張時民[16]和吳曉華等[17]對尿液有形成分和干化學分析的基本篩檢規則，設立了3類初始復檢方案。

1）方案1。單獨進行干化學檢測時，BV、VVC、TV任一項目提示陽性時，進入顯微鏡復檢程序。2）方案2。單獨使用圖像式有形成分分析儀時，線索細胞、真菌菌絲/孢子、滴蟲任一有形成分陽性時，進入儀器圖譜審核程序，如圖譜陽性成分形態典型，直接判為陽性，反之判為陰性；若圖譜陽性成分形態不典型或圖像對焦不清晰難以辨別，則進入顯微鏡復檢程序。3）方案3。有形成分分析和干化學酶檢測聯合使用，2種方法陽性結果相符或有形成分分析陽性而干化學酶檢測陰性時，以儀器圖譜有形成分結果為準，陽性形態典型者直接判斷為陽性，錯誤識別者判為陰性，陽性形態非典型或圖像不清晰難以辨別者進入顯微鏡復檢程序。有形成分分析陰性而干化學酶檢測陽性時：查看儀器圖譜“未分類、上皮細胞、白細胞”分類欄是否有未被識別的陽性成分，如有典型的分類錯誤或未識別的陽性成分，則修正結果為陽性，若未發現相應陽性成分，則判為陰性。

1.3.4 顯微鏡復檢程序

1）BV顯微鏡復檢程序。濕片高倍鏡鏡檢發現典型的線索細胞或大量的雜菌成團聚集（革蘭染色可見Nugent評分≥7分的細菌成團聚集的特征，簡稱為BV相關細菌團），可以直接判斷為BV陽性，反之為陰性；若濕片高倍鏡鏡檢不典型或難以辨別線索細胞，則通過Nugengt評分進行二次確認。

2）VVC、TV顯微鏡復檢程序。濕片鏡檢發現典型的真菌菌絲/孢子、滴蟲者，可直接判斷為VVC陽性、TV陽性；未觀察到則為陰性。

1.3.5 不同檢測模式性能評價

以聯合鏡檢結果為標準，評價5種檢測模式的敏感性、特異性、假陽性率、假陰性率和符合率。選擇敏感性、符合率最高的檢測模式對相關疾病進行初篩。

對濕片鏡檢的白細胞計數結果和儀器法有形成分分析的白細胞等級進行一致性評估：儀器法有形成分分析白細胞分級陰性為0級，+為1級，++為2級，+++為3級；濕片鏡檢白細胞計數0～5個/高倍鏡視野為0級、5～15個/高倍鏡視野為1級、15～30個/高倍鏡視野為2級、≥30個/高倍鏡視野為3級。

1.3.6 優選檢測模式復檢規則的建立和驗證

在初始復檢規則的基礎上，再對優選檢測模式的假陰性結果進行分析，利用有形成分與干化學項目的對應關系，調整復檢規則。在復檢量可接受的情況下，加大儀器陽性報警提示，以降低假陰性漏檢的概率，從而建立優選檢測模式的復檢規則。再根據國內外通用的復檢規則評估指標[18-21]評估優選檢測模式復檢規則的真陽性率、假陽性率、真陰性率、假陰性率（漏診率）和復檢率，驗證復檢規則的臨床適用性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，計數資料以例或率表示，比較采用配對四格表χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 聯合鏡檢結果

聯合鏡檢結果顯示，用于建立復檢規則的1 064份樣本中，線索細胞/Nugent評分≥7分的BV陽性率為18.80%（200/1 064），真菌菌絲/孢子陽性率為14.10%（150/1 064），滴蟲陽性率為1.03%（11/1 064），BV+TV陽性率為0.38%（4/1 064），BV+VVC陽性率為2.82%（30/1 064）?？傟栃月蕿?0.83%（328/1 064）。

2.2 儀器法有形成分分析和濕片鏡檢的一致性

儀器法有形成分分析與濕片鏡檢結果一致的樣本有672例，一致率為63.16%（672/1 064），Kappa值=0.474。Kendall相關分析結果顯示兩者呈正相關（r=0.738，P＜0.005），Wilcoxon符號秩和檢驗結果顯示白細胞分級差異有統計學意義（P＜0.001）。儀器法有形成分分析白細胞分級較濕片鏡檢平均高1級。見表1。

表1 儀器法有形成分分析和濕片鏡檢結果一致性分析 份

2.3 5種檢測模式篩查BV、VVC、TV的性能評估結果

2.3.1 5種檢測模式與聯合鏡檢結果的一致性

5種檢測模式中，檢測結果與聯合鏡檢檢測結果一致性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學酶檢測，最低的是單獨陰道炎五聯檢。見表2。

表2 5種檢測模式與參考方法的符合情況

2.3.2 5種檢測模式篩查BV、VVC、TV的性能比較

5種檢測模式篩查BV、VVC的敏感性、特異性差異有統計學意義（P＜0.001）。篩查BV敏感性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學酶檢測，最低的是陰道炎五聯檢；篩查VVC敏感性最高的是儀器法有形成分分析+儀器法干化學酶檢測，2種單獨干化學檢測模式（陰道炎五聯檢和儀器法干化學酶檢測）敏感性均較低；5種檢測模式篩查TV的敏感性、特異性均較高，差異無統計學意義（P=0.926）。見表3。

表3 5種檢測模式篩查BV、VVC、TV的性能和總符合率 %

2.3.3 最優檢測模式的確定和性能驗證

以敏感性和總符合率最高的儀器法有形成分分析+儀器法干化學酶檢測模式為最優方法，在初始復檢規則的基礎上分析該模式篩查3種疾病的真陽性率、假陽性率、真陰性率、假陰性率（漏診率）、符合率和復檢率，結果見表4。

表4 最優檢測模式的檢測性能

2.4 最優檢測模式假陰性結果分析及其初始復檢規則的調整

漏檢BV的88份樣本中，有16份儀器法有形成分分析未檢出線索細胞；儀器法干化學酶檢測脯氨酸氨基肽酶（±），但無報警提示；1份唾液酸苷酶弱陽性樣本有報警提示，但圖譜審核陰性。為降低BV漏檢率，補充了1條復檢規則，見表5規則4。63份漏檢VVC的樣本中，有12份儀器法干化學酶檢測乙酰氨基葡萄糖苷酶（+）或（±）、葡萄糖苷酶和凝固酶同時（+）或（±），且提示VVC或TV陽性報警，但儀器法有形成分分析均未檢出真菌菌絲/孢子、滴蟲，儀器圖譜審核也未發現陽性成分。為降低VVC漏檢率，補充了1條復檢規則，見表5規則5。

表5 最優檢測方法復檢規則

2.5 復檢規則驗證

270份樣本驗證結果提示，有67份需復檢，其中9份需行革蘭染色復檢BV，總復檢率為24.81%（67/270），假陰性率較初始規則低。復檢規則驗證結果見表6。

3 討論

傳統的濕片鏡檢白帶常規是篩查女性下生殖道感染性疾?。˙V、VVC、TV）和炎癥評估最簡單、經濟的方法。但當樣本量增多、操作人員的閱片壓力增大時，閱片經驗會對檢測結果造成影響。為解決這一問題，適用于大樣本量的各類半自動/全自動分析系統越來越多地應用于臨床。

圖像識別式白帶有形成分分析儀采用光鏡高倍（40×10）分辨率形態學檢查原理，通過計算機軟件對圖像進行圖形比對，識別各類有形成分，并分類、計數[22]。然而，白帶成分的多樣性、復雜性，以及高倍鏡下細胞、菌群識別能力的局限性，會導致某些成分的漏判或誤判。

陰道分泌物干化學分析儀基本均可測定陰道酸堿度、評估乳酸桿菌功能、檢測微生物代謝產物。對于BV、VVC、TV的判斷主要是測定其相對應的陰道微生物代謝產物和酶的活性[23]，但是某些標記的酶多種微生物均能產生，如氨基葡萄糖苷酶在滴蟲和白念珠菌中均存在，只能依據pH值來區分[24]。但pH值的檢測結果往往又受到陰道沖洗、陰道給藥、經期、試紙質量、標本放置時間等較多因素的影響[25]，可能會導致錯誤的陽性提示。

本研究設計了5種白帶常規檢測模式，基本涵蓋了臨床實驗室常用的陰道分泌物自動/半自動分析模式。通過參考方法的評估，最終證實儀器法有形成分分析+儀器法干化學酶檢測模式篩查BV、VVC、TV的敏感性和符合率優于單獨的干化學檢測或單獨的有形成分分析，通過建立聯合檢測模式復檢規則，可進一步降低假陰性率。聯合檢測的優勢在于儀器有形成分的自動識別和分類大大減輕了人工鏡檢的視覺疲勞和操作人員的主觀性識別差異，掃描成像的各成分形態圖譜可自動分類并進行溯源回顧，有助于對陽性結果的確認審核；而搭配了干化學酶法的相對應項目陽性報警又能彌補儀器有形成分識別分類錯誤或漏檢的可能。但是儀器法干化學酶檢測的檢測能力可能會因試劑品牌有較大差異，且不同檢測原理的有形成分分析儀間形態識別能力也可能會存在差異。不同實驗室使用不同的儀器、試劑和檢測方法時，應依據可行標準評估不同儀器特性和不同檢測方法的敏感性、特異性，制定個性化的復檢規則，盡可能降低臨床漏診率。

值得強調的是，參考方法對于不同檢測方法敏感性、特異性的評估是至關重要的，不能簡單地參照尿液檢測儀器評估的方法，僅僅以濕片鏡檢結果做為參考。2018年，BV診斷歐洲指南[11]指出：革蘭染色鏡檢是診斷BV的參考方法，雖然Amsel臨床標準中濕片高倍顯微鏡下的線索細胞與革蘭染色結果密切相關，但其敏感性低于革蘭染色鏡檢，因而僅以濕片鏡檢為參考會造成BV的漏檢。對于VVC的診斷，2018年歐洲指南[11]和2012年我國VVC診治指南[12]均指出：陰道分泌物濕片和革蘭染色鏡檢檢出芽生孢子、菌絲或假菌絲都可診斷VVC，且革蘭染色鏡檢敏感性略高于濕片鏡檢，基于此，本研究以聯合鏡檢中任一種方法陽性為陽性標準，結果顯示，濕片鏡檢與革蘭染色鏡檢篩查BV的敏感性、特異性差異均有統計學意義（P＜0.001），篩查VVC僅敏感性差異有統計學意義（P=0.031），進一步驗證了本研究參考方法選擇依據的正確。對于TV的診斷，2018年歐洲指南[11]和2020年美國婦產科醫師學會指南[13]均指出：顯微鏡檢查陰道分泌物懸液觀察陰道毛滴蟲是當前最常用來診斷TV的方法，但敏感性只有45%～60%，推薦通過核酸檢測診斷TV?；诖?，本研究確認將2種鏡檢方式的結果聯合判斷可保證參考方法的準確性，且必要時補充核酸檢測確認TV。

參考方法的驗證為選擇BV、VVC、TV的顯微鏡復檢方式提供了依據。BV的顯微鏡復檢僅單純依靠濕片高倍鏡檢難以準確識別線索細胞，因為有些細菌，如大量的陽性球菌或陽性桿菌也會有上皮細胞的黏附現象，只有革蘭染色油鏡觀察才能避免線索細胞假陽性，故本研究確立了BV的顯微鏡復檢方式為：濕片高倍鏡下難以鑒別時，行革蘭染色二次確認。本研究發現，雖然革蘭染色后，識別真菌菌絲孢子較濕片更容易區分VVC，敏感性也略高于濕片鏡檢，但2種鏡檢方式的特異性差異無統計學意義。為了使復檢規則更適用于實際操作，本研究設定了VVC、TV的顯微鏡復檢只需要濕片低倍鏡或高倍鏡識別確認即可。

本研究中，儀器法有形成分分析的白細胞分級較濕片鏡檢平均高1級，常見原因為：1）基底層小圓上皮細胞在人工鏡檢時較容易被區分，但儀器計數時因其大小與白細胞相近，可能被誤判為白細胞；2）某些BV陽性的樣本中雜菌黏附成團的BV相關細菌團易被儀器誤判為白細胞。提示在儀器法有形成分分析白細胞計數等級與白細胞脂酶等級相差較大時，需通過圖譜確認或顯微鏡復檢確認。

綜上所述，現有儀器法干化學酶檢測聯合儀器法有形成分分析可以有效提升BV、VVC、TV檢測敏感性、降低復檢率。聯合鏡檢更適用于BV、VVC、TV的復檢確認。