基于CRISPR/Cas9基因編輯技術構建PD-L1-GFP報告基因HT29細胞株

謝鈺珍，覃鴻妮，2，吳凡，孫曙光，孟麗君

(1. 蘇州工業園區服務外包職業學院 生物科技學院，江蘇 蘇州 215123；2.江蘇省精準診療藥物創制工程研究中心(蘇州大學)，江蘇 蘇州 215000；3. 蘇州東嶺生物技術有限公司，江蘇 蘇州 215123)

PD1(programmed death-1,程序性死亡受體-1)為PDCD1基因編碼的Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要表達于活化的免疫細胞表面,如T細胞、B細胞、NK細胞以及單核細胞等。PD1是維持自身耐受性的重要因子,在生理條件下可通過TCR識別抗原,調節外周組織中T細胞的功能,從而應對和清除外源病菌及內源異常細胞。PD-L1(程序性死亡配體-1)也稱CD274,是PD1的配體之一,是由CD274基因編碼的一種細胞表面糖蛋白,多過度表達于腫瘤細胞表面[1]。作為重要的負性免疫調節因子,當T細胞表面PD1受體與腫瘤細胞表面表達的PD-L1配體結合后,可向細胞內傳遞調控信號,抑制T細胞活化與增殖,從而幫助腫瘤細胞逃脫宿主的免疫監視,因此,抑制PD1/PD-L1通路或者通過特異性靶點抑制PD-L1蛋白的表達,可有效增強腫瘤治療效果。近年來的臨床研究結果顯示,由PD1/PD-L1通路介導下的免疫抑制在非小細胞肺癌、胃癌、乳腺癌、大腸癌等多種惡性腫瘤的發生發展中均具有重要作用,PD-L1在以上各種癌組織的表達明顯升高,且PD-L1的陽性表達與腫瘤大小、轉移情況、分化程度及遠期生存率存在密切關系[2-3];此外,從誘導腫瘤細胞表面高表達PD-L1的相關因素來看,目前已報道的腫瘤細胞中調控PD-L1表達的相關信號通路主要有Akt3信號通路和MAPK信號通路、IFN-γ信號通路和AR信號通路[4],而且這些通路的某些抑制劑已被證明可調節PD-L1。例如：TGFβR-1抑制劑LY364947可明顯降低TGFβR-1誘導的PD-L1mRNA和蛋白表達[5];突變轉錄因子FOXP3在PD-L1啟動子區的結合位點后,胰腺癌細胞PD-L1的表達明顯受到抑制[6];但關于結腸癌腫瘤細胞PD-L1表達的具體調控機制仍需進一步研究。CRISPR/ Cas9系統是一種新型基因編輯技術,通過sgRNA介導核酸酶Cas9對基因組特定位點進行識別、切割,從而實現基因編輯,操作相對簡便,基因編輯效率高。本文利用CRISPR/Cas9技術,在PD-L1基因終止密碼子之前插入綠色熒光蛋白GFP基因,通過構建穩定表達PD-L1-GFP報告基因的結腸癌細胞株HT29,旨在建立一個可直觀觀察細胞上PD-L1是否表達以及表達強弱的系統,為進一步研究結腸癌細胞中PD-L1表達的可能調控機制提供幫助,為后期體內外篩選調控PD-L1的上游新靶點及藥物奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

HT29細胞和293T細胞(蘇州東嶺生物技術有限公司保存),Lenti CRISPR V2質粒載體和pUC19載體(蘇州東嶺生物技術有限公司),膠回收試劑盒(Thermo),Stbl3感受態大腸桿菌(TransGen Biotech),DMEM培養基和D10培養基(HYclone),T4連接酶(Takara公司),DNA聚合酶(NEB)。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA引物的設計與合成

根據NCBI查詢的PD-L1基因序列,使用CRISP 在線設計工具(http：//www.e-crisp.org/E-CRISP/),根據靶點設計原則,在PD-L1基因終止密碼子處設計sgRNA,并在序列正義鏈與反義鏈的5’端添加Esp3I(BsmBI)酶切位點,合成的具體序列如下：

sgRNA-1： GAGGAGACGTAATCCAGCAT

gRNA-1-F：CACCGAGGAGACGTAATCCAGCA

gRNA-1-R：AAACATGCTGGATTACGTCTCCTC

sgRNA-2： GTCTCCTCCAAATGTGTATC

gRNA-2-F：CACCGTCTCCTCCAAATGTGTATC

gRNA-2-R：AAACGATACACATTTGGAGGAGA

為檢測突變是否成功,設置了一對檢測引物,擴增產物為包含sgRNA靶點的基因組DNA片段,檢測引物具體序列如下：

Test-F： TGGGGGACAAGCCATCCCAA

Test-R： ATGATTTGCTTGGAGGCTCC

1.2.2 LentiV2-gRNA重組質粒的構建及鑒定

根據所設計序列合成單鏈sgRNA,經梯度降溫PCR退火形成雙鏈sgRNA。退火結束后,將得到的雙鏈gRNA連接到已用Esp3I酶切回收后的線性Lenti-V2空載質粒中,連接產物轉化Stbl3感受態細胞,37 ℃培養過夜后挑取陽性單克隆進行測序驗證,測序引物：LKO1-5(GACTATCATATGCTTACCGT)。針對序列正確的單克隆,提取其對應菌液中的質粒DNA,即可得到正確的Lenti-V2-sgRNA重組質粒。

1.2.3 pUC19-Donor-GFP重組質粒的構建及鑒定

設計左同源臂+GFP+右同源臂序列,序列兩端添加酶切位點XbaI/BamHI,送公司合成Donor片段,將合成的Donor片段、pUC19分別用XhaI和BamHI雙酶切后連接。取10 μL連接產物轉化至50 μL Stbl3感受態大腸桿菌中,37 ℃培養1 h后,均勻涂在含有Amp的LB平板上,過夜培養。次日挑取6個克隆于4 mL含有Amp的LB培養基中,37 ℃培養16 h。16 h后取1 mL菌液抽提質粒,并對質粒進行菌落PCR,判斷選取的單克隆中是否含有目的片段。將驗證正確的質粒送至測序,測序引物：M13-R (CAGGAAACAGCTATGACC),測序正確后凍存菌種。

1.2.4 細胞培養和細胞轉染

從-80 ℃冰箱中取出凍存的HT29細胞,復蘇結束后留2 mol/L的細胞量在10 cm培養皿中培養,隔天進行傳代培養。培養至第4天時將HT29轉移至24孔板中的2孔(一孔轉染,一孔陰性對照),每孔0.5×106細胞。轉染前1～2 h更換新鮮培養基(0.9 mL/孔),按Lenti-V2-sgRNA(0.6 μg)、Donor-GFP(0.4 μg)、1 mg/mL PEI(3 μL)、DMEM(97 μL)配制轉染體系,室溫孵育30 min后,將混合液加入到1孔中,另一個孔無須加入,輕輕搖勻后放入培養箱培養(37 ℃,5%CO2)。

1.2.5 多克隆效果驗證

提取轉染后的HT29細胞基因組DNA,利用在PD-L1基因組以及GFP上分別設計的上下游引物,對其進行PCR鑒定,以檢測其中是否含有在PD-L1位點成功插入GFP片段的目的細胞。引物序列：PD-L1-F(TTCAAATTTATCATTTATCA),GFP-R(CCGGACACGCTGAACTTGTG),PCR體系：模板DNA10ng、PD-L1-F和GFP-R各1μL,2X PrimeSTAR HS DNA Polymerase MIX 10 μL,總體積20 μL。PCR擴增程序：98 ℃預變性20 s,98 ℃ 變性 10 s,55 ℃退火5 s,72 ℃延伸35 s,共30 個循環,68 ℃ 徹底延伸 2 min。擴增的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 單克隆細胞篩選

轉染72 h后,觀察細胞生長狀況并計數,采用有限稀釋法,用D10(10%的FBS+DMEM)按每200 μL一個細胞稀釋到96孔板中,培養24 h后,顯微鏡觀察熒光及細胞狀態,并做好標記。繼續培養,當上一步標記的單克隆細胞密度達到80%后,消化并收集細胞,用基因組DNA抽提試劑盒提取基因組,作為檢測引物(TestF、R)的擴增模板,最后將擴增產物送至公司測序,以檢測PD-L1-GFP報告基因是否插入成功。

2 結果與分析

2.1 Lenti-V2-gRNA重組質粒構建結果

重組質?；驕y序結果顯示,在酶切位點之間插入的片段位置、方向以及序列與預期一致(圖1),含有本實驗所需要的兩條sgRNA序列,證明LentiV2-gRNA重組質粒構建成功。

2.2 兩條sgRNA切割效果驗證結果

為了驗證所設計的兩條sgRNA的切割效果,將兩種Lenti-V2-gRNA重組質粒轉入293T細胞后提取基因組DNA,并對其進行T7E1酶切鑒定,結果顯示1和2兩種sgRNA都能切下相應大小的條帶(圖2),證明Lenti-V2-sgR1和Lenti-V2-sgR2都具有切割效果,本實驗隨機使用其中1條,采用 sgRNA2,即Lenti-V2-sgR2。

圖1 Lentiv2-gRNA重組質粒測序結果

圖2 T7E1酶切圖

2.3 pUC19-Donor-GFP重組質粒構建結果

以挑選的6個單克隆為模板,經菌落PCR均能擴增出目的片段(圖3),說明菌落中含有目標質粒。將陽性質粒進一步送至金唯智測序,從圖4可以看出,第一行的序列為測序結果,第二行的序列是所需的模板序列,序列比對完全正確,pUC19-Donor-GFP質粒構建成功。

注：1-6為隨機挑取的6個單克隆,M為DNA marker。圖3 pUC19-Donor-GFP重組質粒轉化質粒菌落PCR結果

圖4 pUC19-Donor重組質粒測序結果

2.4 Lenti-V2-sgR2和pUC19-donor-GFP細胞轉染結果

將Lenti-V2-sgR2和pUC19-donor-GFP轉染至HT29細胞,72 h后熒光顯微鏡下觀察細胞狀態。由圖5可知,培養72 h后可觀察到少量細胞表達綠色熒光,證明GFP成功轉入HT29并進行了表達。

2.5 PD-L1-GFP報告基因工程細胞株陽性單克隆篩選結果

2.5.1 多克隆效果驗證結果

圖6為多克隆PCR鑒定結果,可以發現實驗組在200 bp位置有目的條帶,而對照組沒有,證明GFP插入到指定位點。

2.5.2 單克隆細胞篩選結果

為將上述驗證的插入正確GFP序列位點的細胞挑選出來,將多克隆細胞進行單克隆篩選,圖7為熒光顯微鏡觀察結果,可以看到細胞形成了單克隆并且具有均一的熒光,可以進行后續的驗證。

(a)細胞圖

(b)熒光圖圖5 HT29細胞熒光蛋白表達

圖6 多克隆驗證瓊脂糖凝膠電泳圖

圖7 單克隆細胞熒光狀態圖

為驗證上述挑選的單克隆中所需的序列存在,對其基因組PCR之后送至金唯智測序,圖8顯示與正常HT29細胞基因組相比,敲入的實驗組所挑的單克隆在終止密碼子前插入了GFP片段,證明細胞系構建成功。

3 討論

PD1表達于活化的免疫細胞表面,如B淋巴細胞、CD4+T細胞等。PD-L1作為PD1的配體之一,在癌組織上可見異常高表達,如腎癌、肝癌、肺癌、乳腺癌及卵巢癌等;但在腫瘤鄰近的正常組織中低水平表達,提示它參與腫瘤發生發展,并在削弱抗腫瘤免疫反應中發揮重要作用。

PD1/PD-L1是負性共刺激分子,當腫瘤細胞表面的PD-L1與免疫細胞表面的PD1結合時,可抑制免疫細胞的增殖與活性甚至誘導其凋亡,使癌細胞成功逃脫免疫殺傷。近年來,PD-L1及其受體PD1信號通路一直是腫瘤免疫領域的熱門研究對象,針對阻斷PD1/PD-L1通路的單克隆抗體已然成為了腫瘤免疫治療的明星產品,目前FDA 已經批準了五種PD-L1抑制劑。作為非特異性免疫治療產品,PD-L1抑制劑的抗癌效應具有廣譜性,且在不同癌癥疾病中顯示出了很好的治療[7-11],但由于治療過程中的原發性和獲得性耐藥,相當大比例的患者無法從中受益。相較于單藥療法,近年來越來越多的研究正向著PD1/PD -L1耐藥機制研究以及聯合用藥靶點的篩選上轉移[12]。

在一些研究報道中,針對不同類型免疫檢查點的聯合療法已被證明對幾種腫瘤有效。例如：采用抗PD-1抑制劑抗體、抗CD137激動劑抗體和疫苗治療的三聯療法可以顯著增強胰腺導管腺癌的治療效果[13-14];聯合anti-PD-L1和anti-TIGIT在臨床上對轉移性NSCLC患者非常有效[15];增強 ITCH 活性可促進 PD-L1泛素化降解從而降低腫瘤細胞 PD-L1 表達,化合物AK087 與 MAPK抑制劑聯用可明顯增強 MAPK 靶向治療黑色素瘤的效果[16]等。但對于其他大部分腫瘤來說,不同療法治療過程中腫瘤表面PD-L1的表達量變化情況及產生治療抗性的關鍵機制,仍需進一步研究。

注：斜體為GFP片段,下劃線為PDL1終止密碼子,WT為正常HT29測序序列,Knock-in clone為實驗組測序序列。圖8 對照組和實驗組序列對比圖

為了探究結腸癌細胞表面PD-L1表達的更多可能調控機制,本研究利用CRISPR/ Cas9系統和同源重組的原理,通過兩次轉染將GFP熒光基團成功插入到 PD-L1基因終止密碼子之前,成功構建了PD-L1-GFP報告基因HT29細胞株,通過熒光信號直觀觀察細胞上PD-L1是否表達以及表達的強弱程度,為進一步研究結腸癌細胞中PD-L1表達的可能調控機制提供了材料,并為后期體內外篩選調控PD-L1的上游新靶點及藥物奠定了基礎。