青錢柳二倍體與四倍體苗期生長和次生代謝產物積累比較1)

毛乾興 李卓穗 卞國良 范文杰 徐獻剛 尚旭嵐

(南京林業大學，南京，210037) (句容市磨盤山林場) (南京林業大學)

青錢柳(Cyclocaryapaliuru)屬胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya),是中國特有的單種屬植物,主要分布于我國亞熱帶地區[1]。青錢柳常以葉入藥,或制成茶葉代茶飲[2],在民間已有悠久的歷史。藥理研究表明,青錢柳葉提取物具有降血糖、降血壓和抗氧化等生物活性[3-6]。前期研究發現,青錢柳在自然界中存在二倍體與同源四倍體兩種細胞型[7]。

多倍化是推動植物進化的一個重要因素。由于染色體倍性的提高,多倍體植物常表現為器官的巨大性和較強的抗逆性,而且由于基因的重組,加大了基因表達上的復雜程度,改變了各種代謝途徑中酶的活性,從而提高了次生代謝產物的質量分數[8-9]。但Tan et al.[10]對紅橘(Citrusreticulata)的研究發現,基因組加倍抑制了果實中黃酮類物質的積累;劉瑛琦[11]的研究也發現,藍花丹(Plumbagoauriculata)同源四倍體較二倍體植株地上和地下部分的白花丹素質量分數顯著降低。植物次生代謝產物通常是利用初生代謝產物合成或分解代謝而來,其合成也需要能量和額外的營養投入[12]。因此,初生代謝產物的分配需要在初生生長和次生代謝間保持一個平衡[13]。已有研究者對不同種源或家系青錢柳苗期生長規律,和黃酮、三萜、多酚等次生代謝產物的積累規律進行了研究[14-15],但尚未見從不同倍性角度開展相關研究的報道。

本研究以二倍體和四倍體青錢柳當年生容器苗為材料,通過定期測定其苗高和地徑,對其年生長規律進行模型擬合,比較兩種倍性苗木的生長性狀、碳氮養分質量分數和主要次生代謝產物積累的差異,并探究兩種倍性青錢柳苗木初生生長和次生代謝的關系,為青錢柳種質資源的選育和開發利用提供參考。

1 材料與方法

試驗材料：采種母樹均來自湖北五峰土家族自治縣,2020年春季取莖尖,采用常規壓片法制片進行染色體計數,確定母樹倍性分別為二倍體(2n=2x=32)和四倍體(2n=4x=64),于2020年10月分單株采種,陰干去翅后,室外自然層積至種子萌發。2022年4月,將株高為3～5 cm的實生苗移栽至無紡布容器(口徑8 cm×高度11 cm)中,擺放于南京林業大學園林實驗教學中心遮蔭大棚下,遮光度約為60%。所用基質為江蘇興農科技有限公司生產的育苗基質,主要由泥炭、椰糠和珍珠巖組成,并添加腐殖酸有機肥。移栽成活后,從二倍體和四倍體中各選擇生長一致的苗木180株進行觀測,每個倍性3個重復,每個重復60株。

苗高、地徑的測定：從2022年4—12月,每月初分別用鋼卷尺和游標卡尺測定所有苗木的苗高和地徑。地徑和苗高曲線擬合采用邏輯斯諦(Logistic)擬合方程y=k/(1+ae-bx),其中,y為苗高或地徑生長量;x為時間;a、b為待定系數;k為既定條件的苗高或地徑生長可能達到的極限值,可用等差三點法計算求得。

形態指標和生物量的測定：2022年10月上旬,每個重復選取15株長勢一致且健壯的標準株,二倍體和四倍體各45株,取從上往下數第四復葉,用WZNDENDRO根系掃描儀分析系統進行掃描,測其面積。同時,每個重復隨機挑選6個標準株帶回實驗室,將根部清洗干凈,主根與須根分離并平鋪在同一平面,用根系掃描儀分析系統進行掃描,獲得各徑級根系的長度、面積、體積。將掃描后的葉片、根系與莖分別測定鮮質量,后將其分別放入烘箱內60 ℃烘干至恒定質量,測其干質量,即獲得單株葉生物量、單株莖生物量、單株根系生物量和整株生物量。

全碳、全氮質量分數的測定：將測定生物量后的葉、莖、根,分別研磨成粉末,過孔徑為0.15 mm的篩子,將過篩后的樣品充分混合。每個樣品稱取100 mg,用錫箔紙包好,均采用元素分析儀(德國碳氮元素分析儀)測定全碳、全氮質量分數。

次生代謝產物質量分數的測定：取葉、莖、根粉末樣品,參照林源等[16]的方法進行提取?？傸S酮質量分數的測定參照Zhou et al.[17]的方法,總三萜質量分數的測定參照Fan et al.[18]的方法,總多酚質量分數的測定參照游見明等[19]的方法。次生代謝產物質量分數以1 g青錢柳葉干樣中含有次生代謝產物的質量表示(單位為mg·g-1);次生代謝產物積累量以次生代謝產物質量分數與相應葉生物量的乘積表示(單位為mg·株-1)。

數據處理：運用Excel 2019軟件將試驗所得數據進行統計分析,用SPSS 26.0軟件對各指標進行獨立樣本t檢驗,苗高和地徑進行邏輯斯諦(Logistic)非線性回歸分析,并對初生生長指標與次生代謝指標進行相關性(Person)分析。

2 結果與分析

2.1 青錢柳二、四倍體苗期生長節律差異

為了解不同倍性青錢柳1年生苗的年生長節律,運用邏輯斯諦方程分別擬合二倍體和四倍體的苗高和地徑生長過程,方差分析結果和擬合方程見表1。兩種倍性苗高、地徑的邏輯斯諦方程擬合模型回歸關系均達到極顯著水平。

由圖1可知,二倍體與四倍體青錢柳的苗高和地徑生長節律基本相似,呈S型曲線增長。5月份的生長速率較緩,6月開始加快,8月達到最大生長速率,9月生長逐漸趨于平緩。根據邏輯斯諦方程求導所得拐點(表1)及移栽時間(4月9日),可將1年生苗的生長階段劃分為生長初期、速生期、生長后期3個時期。

結合實際觀測和理論計算,將二倍體1年生苗的苗高生長劃分為,生長初期(4月9日—6月2日)、速生期(6月3日—9月2日)、生長后期(9月3日—11月末);四倍體1年生苗的苗高生長劃分為,生長初期(4月9日—6月14日)、速生期(6月15日—9月26日)、生長后期(9月27日—11月末)。二倍體苗高速生期持續時間為91d,四倍體苗高速生期持續時間為103 d,四倍體苗高速生期比二倍體速生期延長12d。速生期內,二、四倍體1年生苗苗高生長量分別約占總生長量的48.9%、51.2%。

二倍體1年生苗的地徑生長劃分為,生長初期(4月9日—6月10日)、速生期(6月11日—8月30日)、生長后期(8月31日—11月末);四倍體1年生苗的地徑生長劃分為,生長初期(4月9日—6月12日)、速生期(6月13日—9月15日)、生長后期(9月16日—11月末)。二倍體地徑速生期持續時間為80 d,四倍體持續時間為94 d,四倍體地徑速生期比二倍體速生期延長14 d。速生期內,二、四倍體1年生苗地徑生長量分別約占總生長量的47.5%、49.7%。

表1 1年生青錢柳苗高和地徑的邏輯斯諦回歸方程

圖1 1年生青錢柳苗高和地徑的邏輯斯諦擬合曲線

2.2 青錢柳二、四倍體生長性狀及生物量差異

青錢柳二倍體和四倍體生長性狀情況見表2。四倍體青錢柳復葉面積比二倍體增加了23.6%,根體積增加了16.2%,都達到顯著差異水平(P<0.05),直徑大于2 mm的根系體積比二倍體增加了57.4%,達到極顯著差異水平(P<0.01)。另外,四倍體青錢柳總葉生物量、莖生物量、根生物量及總生物量比二倍體分別增加了44.0%、16.8%、52.6%、40.0%,均達到顯著差異水平。結合根系掃描圖片(圖2)分析,四倍體主根較粗大,根系生物量的積累主要集中在主根,側根較二倍體少?？梢?四倍體青錢柳在葉片和主根的性狀上表現出巨大性。

表2 青錢柳二倍體與四倍體生長性狀及生物量

倍 性d≥2mm根體積/cm3葉生物量/g莖生物量/g根生物量/g總生物量/g二倍體(3.38±0.07)b(1.82±0.06)b(1.55±0.12)b(2.30±0.03)b(5.67±0.18)b四倍體(5.32±0.10)a(2.62±0.01)a(1.81±0.10)a(3.51±0.13)a(7.93±0.02)a四倍體比二倍體增幅/%57.4 44.0 16.8 52.640.0

A為青錢柳四倍體葉片形態,B青錢柳二倍體葉片形態;a為青錢柳四倍體根系形態,b為青錢柳二倍體根系形態。

2.3 青錢柳二、四倍體碳氮養分質量分數差異

由表3可知,四倍體青錢柳葉片的氮質量分數顯著低于二倍體(P<0.05),碳質量分數在兩種倍性間無顯著差異,碳、氮質量分數比則四倍體顯著高于二倍體(P<0.05);四倍體青錢柳莖的碳質量分數顯著高于二倍體(P<0.05),氮質量分數和碳、氮質量分數比在兩種倍性間均無顯著差異;四倍體青錢柳根系碳、氮質量分數均顯著低于二倍體(P<0.05),但碳、氮質量分數比四倍體顯著高于二倍體(P<0.05)。

表3 青錢柳二倍體與四倍體碳氮養分質量分數比較

2.4 青錢柳二、四倍體次生代謝產物積累差異

青錢柳植株各器官次生代謝產物質量分數的測定結果見表4,青錢柳四倍體葉片中總黃酮、總多酚質量分數顯著低于二倍體(P<0.05),三萜質量分數無顯著差異;青錢柳四倍體與二倍體莖總黃酮、總多酚和總三萜質量分數均無顯著差異;青錢柳四倍體根系總黃酮、總多酚和總三萜質量分數顯著低于二倍體(P<0.05)。

青錢柳次生代謝產物積累量結果顯示,四倍體莖和根系黃酮積累量顯著高于二倍體(P<0.05);四倍體葉片多酚積累量顯著高于二倍體(P<0.05);四倍體葉片三萜積累量顯著高于二倍體(P<0.05);其余各器官的次生代謝產物積累量均未呈現顯著差異。

表4 青錢柳二、四倍體葉、莖、根次生代謝產物質量分數與積累量

倍性總多酚質量分數/g·kg-1葉莖根總多酚積累量/mg·株-1葉莖根二倍體(35.45±0.40)a(12.50±1.56)a(33.68±1.32)a(64.60±0.72)b(18.44±1.03)a(75.10±3.79)a四倍體(31.35±0.89)b(17.45±2.69)a(23.26±4.18)b(81.99±2.33)a(29.76±5.22)a(79.24±3.94)a

倍性總三萜質量分數/g·kg-1葉莖根總三萜積累量/mg·株-1葉莖根二倍體(25.41±0.29)a(20.01±2.64)a(45.04±2.10)a(46.30±0.53)b(29.92±1.91)a(100.07±2.71)a四倍體(26.98±0.27)a(26.36±4.34)a(28.56±5.55)b(70.54±0.70)a(48.11±6.48)a(98.15±4.06)a

2.5 青錢柳苗期生長性狀與次生代謝產物質量分數與積累量的相關性分析

從表5可見,兩種倍性青錢柳的苗高、地徑、復葉面積、根體積、葉生物量和根系生物量之間均呈極顯著正相關;比葉質量與苗高、地徑、復葉面積、根體積、葉生物量、根生物量、葉碳、氮質量分數比呈顯著或極顯著正相關;葉碳、氮質量分數比與苗高、地徑、復葉面積、根體積、葉生物量、莖生物量、根生物量呈顯著正相關。

青錢柳苗高、地徑、復葉面積、葉生物量、根生物量和葉碳、氮質量分數比與葉片黃酮和葉片多酚質量分數呈顯著或極顯著負相關;苗高、地徑、復葉面積、根體積、葉生物量和根生物量與葉三萜質量分數呈顯著正相關;莖碳、氮質量分數比與莖黃酮質量分數呈顯著負相關。

青錢柳苗高、地徑、復葉面積、根體積、葉生物量、比葉質量、莖生物量、根生物量與葉多酚、葉三萜和莖黃酮積累量呈顯著或極顯著正相關;苗高、地徑、復葉面積、葉生物量、根生物量與根黃酮積累量呈顯著正相關;葉片氮質量分數與葉三萜積累量、莖黃酮和莖三萜積累量、根黃酮積累量呈顯著負相關;葉片碳、氮質量分數比與葉多酚、葉三萜、莖黃酮、莖多酚和莖三萜積累量呈顯著正相關。

3 討論

多倍體植株普遍表現出更優越的農藝性狀,如生活力強、生長迅速、器官增大、代謝物質量分數增加等,因而具有較高的育種價值和應用前景[20]。林木多倍體育種在短周期森林工業用材樹種、收獲次生代謝產物的經濟林木和生態防護林木新品種選育等方面都發揮了重要作用[21]。多倍體培育技術已應用于杜仲(Eucommiaulmoides)[22]、黃梁木(Neolamarckiacadamba)[23]、黃連木(Pistaciachinensis)[24]等木本藥用植物,獲得了生物量和有效成分質量分數高的種質材料。

表5 青錢柳苗期生長性狀與次生代謝產物積累的相關系數

指標相關系數w(YF)w(YP)w(YT)w(JF)w(JP)w(JT)w(GF)w(GP)w(GT)PYFPYPPYTPJFPJPPJTPGFPGPw(YP)0.91?w(YT)-0.84?-0.65w(JF)0.360.45-0.47w(JP)0.500.57-0.370.88??w(JT)0.430.54-0.230.83??0.99??w(GF)0.560.25-0.75-0.70?-0.70?-0.68?w(GP)0.350.10-0.74-0.55-0.54-0.520.92??w(GT)0.320.14-0.68-0.51-0.49-0.460.90??0.99??PYF0.350.260.10-0.200.210.28-0.06-0.31-0.35PYP-0.95??-0.750.95??-0.33-0.37-0.26-0.76-0.56-0.49-0.20PYT-0.98??-0.88?0.92??-0.42-0.47-0.37-0.63-0.48-0.44-0.180.98??PJF-0.97??-0.810.84?-0.38-0.46-0.37-0.60-0.44-0.37-0.430.95??0.95??PJP-0.79-0.670.50-0.21-0.35-0.31-0.36-0.13-0.04-0.750.700.700.88?PJT-0.86?-0.810.53-0.31-0.48-0.46-0.27-0.09-0.05-0.700.720.770.90?0.97??PGF-0.79-0.89?0.69-0.42-0.27-0.20-0.40-0.16-0.140.060.700.82?0.700.510.63PGP-0.43-0.580.19-0.47-0.25-0.230.100.080.11-0.290.260.380.480.630.680.66PGT0.26-0.08-0.22-0.380.040.040.450.210.140.54-0.36-0.21-0.33-0.34-0.230.350.51

本研究結果表明,青錢柳二倍體與四倍體苗木的生長節律基本相似,都呈“S”型曲線生長,但四倍體較二倍體的速生期延長了約兩周。生長期延長,有利于植株生物量的積累,如賈明良等[25]的研究發現,十六倍體半夏(Pinelliaternata)比八倍體半夏的生長期延長,產量顯著增加。本研究還表明,四倍體青錢柳復葉面積、根系體積與主根體積均顯著高于二倍體,且葉生物量、根生物量和總生物量均有顯著提升,這說明四倍體青錢柳地上部分與地下部分都表現出了巨大性的特點。張石虎等[26]對黃梁木的研究表明,與二倍體相比,四倍體莖更粗、葉面積更大、生物量更高。林玉鳳[27]對穿心蓮(Andrographispaniculata)的研究發現,四倍體莖更粗、葉面積更大、生物量更高,但植株較矮。青錢柳是我國極具推廣價值的藥食同源植物,目前主要采收葉片進行加工利用,四倍體青錢柳較二倍體有更高的生物量,因此,具有較大的開發利用潛力。

碳和氮是植物器官以及代謝產物的基本組成元素,化學計量比與植物生長和代謝密切相關,植物葉片的碳、氮質量分數比在一定程度上反映了植物的營養利用效率,具有重要的生態學意義[28-29]。本研究結果表明,四倍體青錢柳葉片與根系碳、氮質量分數比顯著高于二倍體,相關性分析結果也顯示,青錢柳葉碳、氮質量分數比與苗高、地徑、生物量等多個生長指標呈極顯著或顯著正相關,說明四倍體具有更高的營養利用效率,相同的養分條件能獲得更大的生物量。

對青錢柳葉、莖、根中次生代謝產物質量分數的測定結果表明,兩種倍性苗木的總黃酮與總多酚質量分數均為葉片中最高,而總三萜質量分數為根系中最高。通過比較發現,四倍體青錢柳葉片與根系中的總黃酮和總多酚質量分數均顯著低于二倍體,而四倍體根系中總黃酮、總多酚和總三萜質量分數也顯著低于二倍體。次生代謝過程被認為是植物在長期進化中對生態環境適應的結果,它在處理植物與生態環境的關系中充當著重要的角色[8]。植物的生長與次生代謝之間普遍存在著權衡關系,而這種關系對藥用植物藥效成分的積累至關重要[12]。相關性分析結果表明,青錢柳葉片總黃酮和總多酚質量分數與苗高、地徑、復葉面積、比葉質量、碳氮質量分數比等生長性狀指標呈顯著負相關,說明青錢柳初生生長和次生代謝間存在著一種權衡關系。本研究結果顯示,雖然四倍體葉中總黃酮和總多酚質量分數較低,但由于四倍體葉生物量顯著大于二倍體,因此兩種倍性葉中總黃酮積累量無顯著差異,四倍體葉總多酚和總三萜積累量顯著高于二倍體。但應注意的是,本研究結果僅以1年生容器苗為材料觀測所得,隨著苗木的生長發育,兩種倍性植株的生長和次生代謝會如何改變,還需進行長期的研究。

4 結論

1年生青錢柳二倍體與四倍體苗木的生長節律基本相似,但四倍體的速生期較二倍體延長了約兩周;四倍體復葉面積、根體積、根生物量、葉生物量和總生物量顯著高于二倍體;四倍體葉片和根系碳氮質量分數比顯著高于二倍體,說明四倍體具有更高的營養利用效率,能獲得更大的生物量;四倍體青錢柳葉片中的總黃酮和總多酚質量分數均顯著低于二倍體,四倍體根系中總黃酮、總多酚和總三萜質量分數也顯著低于二倍體,但由于四倍體葉生物量顯著大于二倍體,因此兩種倍性葉中總黃酮積累量無顯著差異,四倍體葉總多酚和總三萜積累量顯著高于二倍體。相關性分析結果表明,青錢柳葉片總黃酮和總多酚質量分數與苗高、地徑、復葉面積、比葉質量、碳氮質量分數比等生長性狀指標呈顯著負相關,說明青錢柳初生生長和次生代謝間也存在著一種權衡關系。