220份四川小麥條銹病抗性鑒定與評價

張海鵬，葉雪玲，管方念，黃林玉，李 偉，鄧 梅，魏育明，蔣云峰，陳國躍*

（1.四川農業大學小麥研究所，成都 611130；2.西南作物基因資源發掘與利用國家重點實驗室，成都 611130；3.成都大學，成都 610106；4.四川農業大學農學院，成都 611130）

由小麥?；蜅l形柄銹菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici,Pst）引起的小麥（TriticumaestivumL.）條銹病是我國小麥生產上最重要的病害之一，其流行頻率高、發病范圍廣且危害程度大，嚴重威脅著我國糧食安全。自1950—2020年間，分別在1950、1964、1990、2002 和2017年共發生5 次全國性的小麥條銹病大流行。其間，還有多次中等及以下程度或個別麥區條銹病偏重流行。近期如2020年全國小麥條銹病中度流行，在包括陜、鄂、豫南麥區在內的11 個省區偏重發生，據統計，當年全國發病面積439.52 hm2，造成小麥減產2.49 億kg[1-3]?？v觀我國小麥條銹病歷次大流行的歷史，造成小麥條銹病大流行的主要原因是新的條銹菌毒性小種發展為優勢小種、主栽品種抗病性喪失抗性、感病品種大面積種植。近年來，隨著強毒性條銹菌生理小種條中34號（CYR34）的出現及流行頻率的逐年增高，導致以川麥42、貴農21和南農92R作為骨干親本的抗源（Yr10、Yr24/Yr26/YrCH42）喪失抗性，標志著小麥生產上又一次品種更替的開始[4-5]。迄今為止，已有86個抗條銹病基因（Yr1-Yr86）被正式命名，另外還有100 余個臨時命名基因和超過300 個控制小麥抗條銹病QTLs 被定位[6-10]，但僅有少數主效抗性基因或QTL 被實際應用于小麥抗病育種[4,11]。在國際正式命名的Yr基因中，目前在小麥生產上僅Yr5、Yr15和Yr61等少數全生育期抗性基因對我國小麥條銹菌流行小種或致病類群表現良好抗性。品種抗病性喪失既是一個重大科學問題，也是一個亟待解決的生產實際問題[12]。因此，針對當前小麥生產上流行的條銹菌生理小種或致病類群，明確小麥種質資源抗性水平及抗性基因布局，為育種家提供有效抗源并對高效、合理、可持續性利用小麥條銹病抗性，在生產上為實現多基因布局提供參考。四川作為西南麥區小麥種植面積最大的麥區，是我國小麥條銹菌最重要的秋季、春季菌源區及春季流行區之一，也是我國小麥條銹菌最關鍵的易變區和新小種策源地之一。因此，控制四川麥區條銹病的發生和流行成為保障我國西南，乃至全國小麥安全生產的關鍵。

本研究擬利用當前四川麥區小麥生產上條銹病流行強毒性優勢小種CYR34 及由CYR32、CYR33、CYR34、Sull-4、Sull-5、Sull-7 和G22-14 組成的混合生理小種對220 份四川小麥（包括150 份1997—2016年間育成品種、70 份農家種）分別進行室內苗期和田間成株期條銹病抗性表型鑒定；同時，結合已知條銹病抗性基因Yr5、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr24/26、Yr41和Yr48緊密連鎖或功能標記進行分子檢測，明確四川小麥對當前流行條銹病生理小種或致病類群的抗性水平和抗條銹病基因分布，為四川麥區合理利用條銹病抗源提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

220 份四川小麥種質，包括150 份1997—2016年間四川育成品種、70份四川農家種70份（附表）；8 份已知條銹病抗性基因載體材料，包括AvSYr5NIL、AvSYr10NIL、AvSYr15NIL、AvSYr17NIL、AvSYr18NIL、AvSYr26NIL、CN19（Yr41）和PI 610750（Yr48）等作為抗條銹病基因分子檢測的陽性對照，Avocet S 作為陰性對照；銘賢169 作為室內苗期鑒定條銹菌誘發和感病對照；SY95-71 和Avocet S 分別作為田間成株期條銹病鑒定誘發行和感病對照品種。上述種質均由四川農業大學小麥研究所收集保存。苗期采用條銹菌單小種CYR34 接種鑒定，成株期則為CYR32、 CYR33、 CYR34、 Sull-4、 Sull-5、 Sull-7和G22-14等量組成的混合菌。上述條銹菌均由甘肅農業科學院植物保護研究所賈秋珍研究員提供。

1.2 室內苗期和成株期條銹病表型抗性鑒定

苗期條銹病鑒定在四川農業大學小麥研究所病害鑒定溫室進行。將供試小麥種質播種于育苗盒內，每個育苗盒播種5～10粒，在光照16 h/d，黑暗8 h/d 條件下培養至二葉一心，室內溫度為15～18 ℃。將活化好的條銹菌孢子充分混勻于異構十二烷中，采用噴接法均勻噴灑在植株葉片表面，置于低溫（8～10 ℃）高濕（濕度85%～95%）的接種培養箱中，黑暗條件下培養24 h 后轉移至光照培養箱（15～18 ℃光照16 h/d，10～12 ℃黑暗8 h/d）中生長。待感病對照品種銘賢169充分發病時按照0～9級反應型（infection type，IT）劃分標準[13]進行條銹病苗期表型鑒定。其中，0～3 級為高度抗?。╤igh resistance,HR），4～6 級為中度抗病(moderate resistance,MR)，7 級為中度感?。╩oderat susceptible,MS），8～9級為高度感?。╤igh susceptible,HS）。

于2016年10月中下旬分別在四川農業大學溫江小麥條銹病鑒定圃（成都溫江區，17WJ）、四川農業大學崇州小麥條銹病鑒定圃（成都崇州市，17CZ）及綿陽市農業科學院小麥條銹病鑒定圃（四川綿陽，17MY）進行成株期表型鑒定材料播種工作。每份種質3 行區，田間播種采取單粒點播，行長2 m，行距0.3 m，每行種植20粒種子，株距0.1 m，間隔20行區設置1行Avocet S感病對照；行區四周播種2行感病材料SY95-71作條銹菌誘發行。次年1月中旬采用涂抹法在誘發材料SY95-71倒數第二葉中部接種混合菌種，待3月下旬至4月中上旬感病對照Avocet S充分發病后，調查成株期條銹病反應型和嚴重度（disease severity,DS）。反應型調查標準參照R.F.Line等[13]，反應型抗感分級標準參照苗期劃分。嚴重度是指病原菌孢子堆占整個葉片面積的百分數，調查方法參照小麥條銹病測報技術規范[14]，按照0、1%、5%、10%、20%、40%、60%、80%和100%分級記錄。其中，高抗（0≤DS≤20%）、中抗（20%

1.3 已知條銹病抗性基因特異分子標記檢測

采用改良的CTAB 法[15]提取基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量以及超微量分光光度計測定DNA 濃度和純度，用超純水將DNA 原液稀釋至100 ng/μL。利用已知條銹病抗性基因Yr5[16]、Yr10[17-18]、Yr15[19-20]、Yr17[21]、Yr18[22-23]、Yr24/26[24-25]、Yr41[26]和Yr48[27]的功能標記或緊密連鎖分子標記進行檢測。DNA 分子標記引物由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成。利用熒光定量PCR 儀（CFX96 Touch，美國Bio-Rad）進行Yr18的KASP標記基因分型，其余特異標記通過瓊脂糖或6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳完成。

2 結果與分析

2.1 苗期條銹病抗性表型鑒定

室內苗期鑒定結果顯示，220 份四川小麥種質中，共56份種質表現出抗性（IT≤6），包括27份農家種和29 份育成品種。其中，29 份種質對CYR34 苗期表現為高抗（IT≤3），包括16 份農家種和13 份育成品種。

2.2 成株期條銹病抗性表型鑒定

利用混合菌種進行人工誘發，在多個環境點對220 份種質進行成株期條銹病抗性表型鑒定。在17CZ 鑒定圃，136 份種質（61.82%）表現出成株期抗性（IT≤6，DS≤60%），包括52 份農家種和84 份育成品種；在17MY鑒定圃，共154份種質（70.00%）表現出成株期抗性，包括60份農家種和94份育成品種；在17WJ鑒定圃，共108份種質（49.09%）表現出成株期抗性，包括48份農家種和60份育成品種。綜合3個鑒定圃抗性鑒定結果，93份種質表現出穩定成株期抗性，包括40份農家種和53份育成品種。3個環境中表現穩定高抗（IT≤3，0≤DS≤20%）的種質共51份，包括19份農家種和32份育成品種。

2.3 抗條銹病表型綜合評價

綜合苗期和成株期條銹病表型鑒定結果，25份種質在苗期和成株期均表現出穩定抗性，包括13份農家種和12 份育成品種。其中有9 份種質表現出穩定高抗水平，包括6 份農家種（開江白麥子、安岳紅小麥、灌縣白花干麥兒子2、酉陽光頭、江油露山麥和白玉小麥）和3份育成品種（西昌19、綿麥45和昌麥28），這些種質可進一步用于小麥生產，并作為小麥抗病育種的親本資源。

2.4 抗條銹病基因檢測結果

以Avocet S和相應基因載體分別作為陰性對照和陽性對照，分別使用8個Yr基因的連鎖標記或功能標記對220 份四川小麥進行分子檢測。結果顯示，所有供試種質中均未檢測到Yr5和Yr15，僅在少數種質中檢測到Yr10和Yr48，Yr17、Yr18、Yr24/26和Yr41被檢測到的頻率較高（表1），其中Yr17和Yr24/26分別只在35和72份育成品種中檢測到。共計66份種質中檢測到Yr18，但大部分為農家種，僅包含3份育成品種（圖1）。37 份種質檢測到Yr41，包括7份農家種和30份育成品種。

圖1 利用Yr18的連鎖標記csLV34檢測14份種質Figure 1 Detection of Yr18 in fourteen wheat germplasms by using the linked marker csLV34

表1 Yr基因在四川小麥中的分布Table 1 The distribution of each Yr gene in Sichuan wheat

此外，32份種質未檢測到本研究中的任何Yr基因，包括8 份苗期抗性種質、14 份成株期抗性種質（包括9 份表現為穩定高抗：川農17、綿陽35、西昌19、昌麥26、川麥48、昌麥28、川輻8 號、川育26 和科成麥5 號）及苗期和成株期均表現抗病的4 份種質（川農17、西昌19、昌麥28 和昌麥33）在內的32份四川小麥均未檢測到供試Yr基因，推測這些種質可能含有其他已知或未知的Yr基因。已知基因分子檢測還發現，10 份農家種和31 份育成品種攜帶兩個及以上Yr基因（附表）。

3 討論

四川是我國條銹菌新小種的策源地之一，生產上大部分重要條銹菌生理小種的產生和流行均與該麥區有關[1,28-30]。因此，明確四川麥區育成品種的條銹病抗性及抗性基因的分布對于進一步開展小麥條銹病抗性育種具有重要意義。本研究利用當前小麥生產上條銹病流行強毒性優勢小種CYR34及由CYR32、CYR33、CYR34、Sull-4、Sull-5、Sull-7和G22-14 組成的混合生理小種對220 份四川小麥（包括150 份1997—2016年間育成品種、70 份農家種）分別進行室內苗期和田間成株期條銹病抗性表型鑒定。結果顯示，56 份種質（25.45%）苗期對CYR34 表現出抗性，93 份成株期（42.27%）對包含CYR34在內的混合生理小種具有穩定抗性。其中，29份育成種質表現苗期抗性、53份表現出成株期抗性；而在供試農家種中，27份表現苗期抗性、40份表現出穩定成株期抗性。上述抗性種質為小麥條銹病抗性基因發掘及育種提供了可用的基因源。

基于Yr基因分子緊密連鎖/功能標記對四川小麥進行分子檢測發現，來自四川麥區的農家種與育成品種中Yr基因的分布差異顯著。Yr18是一個成株期條銹病持久抗性基因，其育種應用在全球已有超過百年歷史。研究結果發現，在四川小麥中絕大部分農家種質（90%）均攜帶了Yr18；但有意思的是，在1997—2016年間四川育成種質中，僅發現3個品種（綿陽33、西輻14和川育21）攜帶Yr18。上述研究結果與前人研究基本一致[31-34]，表明該基因鮮有在四川小麥條銹病抗性育種利用。Yr17來自偏凸山羊草，其最早可追溯到20世紀80年代通過引進墨西哥小麥品種而被廣泛應用到四川小麥育種中[35]，該基因對當前我國流行的優勢小種CYR34已喪失抗性。特異標記分子檢測發現，所有供試農家種均未發現攜帶Yr17；約23.33%的四川育成品種（35份）檢測到攜帶該基因。結合抗性表型分析發現，僅攜帶Yr17的育成品種中，4份表現苗期抗性，推測這些育成品種可能其他已知或未知的抗性基因。由普通小麥-簇毛麥育成的92R 易位系攜帶苗期抗性基因Yr24/26，該基因被廣泛用于四川小麥育種。2009年強毒性條銹菌生理小種CYR34的出現導致以Yr24/26作為主要抗源的川育、川麥和貴農系普遍喪失抗性[4-5]。本研究從150 份育成種質中共檢測到72 份品種攜帶Yr24/26，占比高達48%，表明在1997—2016年間四川條銹病抗性育種應用中，以攜帶Yr24/26的抗源占據主導地位。Yr41來自于四川小麥育成品種川農19，并認為該基因對當前我國小麥生產上流行的主要生理小種CYR31、CYR32 和CYR33 等均具有抗性[36]，但CYR34 對其具有毒性。以川農19為抗源，育成了包括川農26、川農27和渝麥13 等一系列抗條銹病新品種[37]。本研究基于Yr41特異分子跟蹤標記檢測發現，該抗源被四川麥區多家育種單位廣泛應用。利用該抗源特異分子標記進行檢測發現在1997—2016年間育成品種中，共發現30 個小麥品種攜帶Yr41；同時，也發現該基因存在部分四川農家種中。結合抗性表型分析發現，僅攜帶Yr41的8份四川小麥中，2份種質表現出苗期抗性、1份種質表現出成株期抗性，這些抗性種質很可能聚合了其他抗性位點。Yr48來自于墨西哥六倍體春小麥PI610750，目前在中國麥區仍然具有抗性[26,38]。在四川小麥中共發現20 份種質攜帶Yr48，包括8 份農家種和12 份育成品種；令人疑惑的是，結合表型發現其中13份種質表現不同程度的感病，其原因有待進一步研究。Yr10來自于小麥品種Moro，對當前流行生理小種CYR34 已失去抗性[13,39]。分子檢測發現，該基因僅存在于2 份（川農11和川農18）育成品種中，表明在1997—2016年間已很少利用該基因作為抗源應用到四川小麥抗病育種中。Yr5和Yr15分別來源于小麥野生近緣種斯卑爾脫小麥（TriticumspeltaL.）和野生二粒小麥（TriticumdicoccoidesL.），對當前世界范圍內絕大多數條銹菌生理小種均表現為高抗或近免疫[40-41]，也是少數對當前中國麥區流行的條銹菌生理小種具有抗性的Yr基因。習玲等[42]對2016年以來育成的78 個四川小麥品種（系）進行條銹病抗性基因檢測發現，包括綿麥538、西科麥557、蜀麥1829、蜀麥1868 及川麥1747 等5 個小麥品種攜帶了Yr15。本研究利用Yr15功能標記對1997—2016年間四川育成種質進行檢測，并未發現這一時期育成品種攜帶該基因。上述研究結果表明，在四川麥區對Yr15的育種利用起始于近年，可能與條銹菌新小種CYR34的出現與流行有關。和前人研究結果一致，本研究也未發現來自于斯卑爾脫小麥全生育期條銹病抗性基因Yr5在四川育種中的利用[43]。

培育持久抗病種質是除產量相關性狀外育種家的首要目標。如何利用有限的抗源提高作物持久抗病能力是當前抗病育種的重點。但回顧這些研究表明，Yr基因的金字塔化部署（將多個基因聚合在同一品種）時可能更持久[44-45]。實際生產中，應用Yr基因豐富程度越高，條銹菌選擇壓力越小，變異產生新的毒性生理小種概率越小。但在抗病基因聚合時，需要提前了解聚合基因的田間實際表現，否則可能面對諸如基因之間上位效應、基因型與環境互作影響抗性表達和抗性基因相關的生理成本等問題[46]。