39份育成小麥品種（系）抗病基因分子檢測

李小雨，蔣 進，費德友，王淑榮

（南充市農業科學院，四川 南充 637000）

由小麥條銹菌（Pucciniastriiformisf.sp.tritici）、禾谷鐮刀菌（Fusariumgramiearium）和白粉菌（Blumeria graminisf.sp.tritici）所引起的三大真菌性病害條銹?。╯tripe rust）、赤霉?。‵usariumhead blight,FHB）和白粉?。╬owdery mildew,Pm）是小麥生育期中最主要的病害，嚴重影響小麥生產。3種病害均為氣傳性病害，特別是條銹病菌能夠隨風進行遠距離傳播，迄今已記載有5次全國范圍內的條銹病大暴發，累計造成減產138億kg，2002年和2017年是最近2次大流行，導致小麥累計減產28 億kg[1]。赤霉病菌主要在開花期對小麥穗部進行侵染，然后汲取小麥穗部營養，發病嚴重后會造成籽粒發育不完整產生干癟形態籽粒，進而導致小麥減產并積累脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)、雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol,NIV）和赤霉烯酮（zearalenol,ZEN）等多種真菌毒素[2-3]。在2001年到2018年的赤霉病流行19年間里，以2012年最為嚴重，當年全國超過1.5億666.7 m2小麥面積遭受到不同程度的侵害，其中又以河南省最為嚴重[3]。小麥白粉病主要侵害小麥葉片及葉鞘，發生嚴重時也會延展至小麥穗部，基部葉片和葉片正面一般較上部葉片和背面發病重，發病充分時可以導致小麥葉片早枯，影響籽粒灌漿降低千粒重[4]。

以川西平原、川中北和川東北的成、德、綿、南為主的四川小麥種植區是西南麥區的主產大市，據2020年統計以上述4 大市為主的四川小麥播種面積約占西南冬麥區的70%。受到全球氣候變暖及極端氣候和秸稈還田農作制度改變的影響，條銹病、赤霉病和白粉病病害呈現出日益蔓延并逐年加重的趨勢。四川省處在條銹病冬繁區，屬亞熱帶季風濕潤氣候，冬季以暖冬為主，3—4月揚花期間降雨頻繁，多形成陰雨連綿天，適宜的氣候條件和地理位置使得四川省小麥三大病害情況愈加嚴峻[5-8]。選育和利用抗病品種是控制條銹病、赤霉病和白粉病害最經濟、有效和安全的手段[9]。因此，加快培育兼具抗條銹病、赤霉病和白粉病的品種是四川小麥育種的主要目標之一。

病原菌與寄主存在有協同進化關系，這使得病原菌新生理小種同樣能夠不斷快速迭代導致品質喪失抗病性，如2009年以條中24（CYR34）為主要的生理小種的出現，導致四川大部分主流品種喪失抗性，并在幾年后CYR34 開始成為優勢生理小種，與CYR32、CYR33 及桂22-14 成為四川地區條銹病主要流行生理小種[10-13]。目前，國際上已正式命名了83個抗條銹病基因（Yr1～Yr83）、80多個主效抗白粉病基因（Pm1～Pm68、PmG3M 等）以及7 個抗赤霉病基因（Fhb1～Fhb7）[14-16]。小麥條銹病表型分為全生育期抗性（ASR）、成株期抗性（APR）和感?。⊿）類型，其中Yr5和Yr15等基因能夠有效抵御CYR32和CYR34 生理小種的侵染。同樣根據抵抗赤霉病菌侵染的不同程度可將小麥赤霉病抗病性分為抗初侵染（TypeⅠ）、抗拓展（TypeⅡ）、抗籽粒侵染（TypeⅢ）、耐病性（TypeⅣ）和抗DON積累（TypeⅤ）5種抗病類型。四川省雖然不是赤霉病及白粉病傳統發病區，但研究者在四川小麥主產地發現四川赤霉病菌種群主要以禾谷鐮刀菌和亞洲鐮刀菌（Fusariumsatcum）為主要生理小種，白粉病菌以V1a、V2、V3a等為主的毒株[17-20]。目前被發現位于3BL染色體上的Fhb1是目前被研究者認為最有效、貢獻率最高的抗赤霉病主效基因。隨著生理小種的變化，Pm1等許多抗病性基因已經部分或者完全喪失了抵抗白粉病菌侵染的能力，但來自于簇毛麥的Pm21在四川地區小麥育種中仍然被廣泛應用。因此，了解當地小麥品種（系）的抗病性及抗病基因攜帶類型，鑒定篩選出抗病材料對于優異基因的轉移利用至關重要。

因此，本研究對來自于南充市農業科學院近年培育的39份小麥品種（系）進行條銹病、赤霉病田間多年鑒定，同時利用與條銹病、赤霉病和白粉病抗病基因連鎖的分子標記對供試材料進行檢測，明確其抗病性基因組成，篩選出抗條銹病、赤霉病和白粉病的優良小麥品種（系），以期為今后新品種培育和生產示范推廣提供材料來源和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的39 份材料均為南充市農業科學院近年所培育并保存的小麥品種（系），其中8 份通過四川省審定，其余31份為自育高代品系。條銹病誘發及對照采用銘賢169，赤霉病分別以蘇麥3號（高抗）、揚麥158（中抗）和安農8455（高感）作為感病對照?；旌仙硇》N（CYR32、CYR33、CYR34、貴22-14、水源類型等）混合菌，由甘肅省農業科學院植物保護研究所賈秋珍研究員提供。禾谷鐮孢懸浮液（F0301、F0609、F0980 和F1312）由江蘇省淮安市農業科學研究院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間抗病性鑒定

條銹?。ń臃N鑒定）和赤霉?。ㄗ匀话l?。┨镩g抗性鑒定于2020—2023年間連續3年在四川省南充市農業科學院試驗基地完成。每份材料采用順序排列方式行播2 行，行長1.2 m，行距25 cm，旁邊垂直條播銘賢169 作為誘發及感病對照，并在其四周設置保護行。在小麥分蘗-拔節期時采用混合菌種-滑石粉比例混合涂抹法和噴霧接種結合進行，按照DB51／T713-2007《小麥抗條銹病性田間鑒定技術規程》中關于小麥條銹病調查的要求進行反應型記載。在2022—2023年度里另設置一組赤霉病單花滴注試驗。于揚花期使用移液槍對每份材料的10 個單穗的中部進行10 μL 孢子懸浮液滴注，套袋后每日4 次噴水保濕，在接種后的25 d 和30 d 進行記載。按NY/T2954-2016標準記載嚴重度。1級：無病穗；2 級：1/4 以下小穗發??；3 級：1/4～1/2 小穗發??；4級：1/2～3/4小穗發??；5級：3/4以上小穗發病。

1.2.2 抗病基因檢測

小麥植株DNA 提取參照Hill-Ambroz 的改良CTAB法進行[21]。采用20 μL體系進行PCR擴增，其中2× Taq PCR Mix 和所需引物由上海生工生物合成，PCR 程序參照所需標記要求設置，產物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和熒光定量分析。分子標記選用與條銹?。╕rAs2388、Yr5、Yr9、Yr10、Yr15、Yr18、Yr26、Yr34/48、Yr36、Yr65、Yr80、Yr81）、赤霉?。‵hb1）和白粉?。≒m21）緊密連鎖的SSR 和KASP 等標記進行，具體所用引物序列見表1。

表1 小麥抗病性基因分子標記信息Table 1 Molecular marker information for detection of wheat resistance genes

2 結果與分析

2.1 條銹病田間抗病性鑒定結果

采用混合生理小種（CYR32、CYR33、CYR34、貴22-14、水源類型等）2020—2023年連續3年接種鑒定供試材料成株期條銹病抗性鑒定，從表2 結果可以看出2021年成株期表現為中抗及以上的材料有16份，占供試材料的41%，其中南麥941、南麥995和南麥979 等6 份材料對混合菌種表現為高抗，占供試材料的15.4%；其余23份材料對混合菌種表現為感?。ㄖ懈泻透吒兴剑?，占比59%，中感和高感分別有4 份和19 份。2022年成株期表現為中抗及以上的材料有14 份，占供試材料的35.9%，其中南麥941、南麥904和YY-82這3份材料對混合菌種表現為高抗；其余25 份材料對混合菌種表現為感?。ㄖ懈泻透吒兴剑?，占比64.1%，中感和高感分別有6份和19 份。2023年成株期表現為中抗及以上的材料有20 份，占供試材料的51.3%，其中南麥941、南麥995 和南麥979 等6 份材料對混合菌種表現為高抗，占供試材料的15.4%；其余19 份材料對混合菌種表現為感?。ㄖ懈泻透吒兴剑?，占比48.7%，中感和高感分別有12 份和7 份。南麥941 等11 份材料在連續3年的觀察中對條銹混合菌種均表現為中抗及以上水平，占總供試樣本的28.2%，這表明所育材料在條銹病抗性水平上還需要有所提高。南麥941 和YY-82 這2 份材料連續3年均表現出高抗水平，表明該材料可以被繼續用來作為小麥抗病材料的重要親本，特別是南麥941 可以在生產上繼續推廣種植。

2.2 赤霉病田間抗病性鑒定結果

蘇麥3 號、揚麥158 和安農8455 均達到對照抗感發病水平，從表2 的連續3年赤霉病自然發病觀測結果可以看出，39份材料均沒有出現高抗及以上抗赤霉病的品種（系）。與對照相比，南麥941、南麥971、南麥990 和南麥991 在3年未接菌自然發病和單年單花滴注情況下均表現為中抗，南麥995在3年未接菌自然發病表現為中抗，在單花滴注情況下為中感。有10 份材料連續3年表現為中抗及以上水平，占比25.6%。在單花滴注鑒定中，僅有7份材料表現為中抗，比平均3年中抗材料占比下降17.9%；19 份材料為中感與往年相當；13 份表現為高感，相比平均3年高感材料占比提升64.7%。

2.3 田間抗性鑒定綜合評價

根據39份供試材料連續3年的條銹?。ń臃N鑒定）和赤霉?。ㄗ匀话l?。┮约?年的赤霉病單花滴注鑒定結果顯示。所有供試材料中僅有南麥941這1份材料在條銹病達中抗及以上水平且赤霉病鑒定也為中抗，占比2.5%；南麥995這1份材料在條銹病表現為中抗及以上水平且赤霉病自然發病鑒定為中抗水平，占比2.5%；南麥987、南麥979、南麥969、南麥904、南麥619和YY-82等6份材料在連續3年條銹病接種鑒定且連續2年赤霉病自然發病鑒定下綜合表現為中抗水平，占比15.3%。

2.4 抗條銹病抗病基因分子標記檢測結果

利用已知的Yr基因緊密連鎖標記或基因標記對39 份材料進行12 個Yr基因掃描，檢測結果如表3。39 份材料中超過一半供試材料可能攜帶有Yr10、Yr26和Yr65基因，分別占比達到53.8%、61.5%和64.1%；在7份材料中檢測到YrAs2388功能基因的目的條帶，占比17.9%（圖1）；有9份材料檢測到Yr5全生育期抗病基因目的條帶，占比23.1%；有16 份供試材料檢測到Yr9全生育期抗病基因目的條帶，占比41%；有5份材料檢測到Yr18基因連鎖標記條帶，占比12.8%；在Yr36抗病基因標記中僅有1 份材料檢測到目的條帶；此外，Yr15特異分子標記、Yr34/48和Yr80的KASP 分子標記檢測結果顯示，所有供試材料均不攜帶有上述3個目的基因；利用Yr81KASP檢測結果顯示，南麥995 等5 份供試材料可能攜帶有Yr81抗病基因（圖2）。從檢測結果來看，除Yr10、Yr26和Yr65基因分布頻率較高外，其余抗條銹病基因在整個供試材料中的出現頻率均較低。

圖1 YrAs2388擴增部分供試小麥品種（系）Figure 1 Amplification of YrAs2388 in some tested wheat varieties(lines)

圖2 利用分子標記KASP_3077熒光定量 PCR 檢測小麥育成品種(系)中Yr81基因Figure 2 Detection of Yr81 based on real-time PCR using molecular marker KASP_3077 of wheat cultivars and lines

表3 39份育成品種（系）抗病基因分子標記檢測Table 3 Detection of resistance gene in 39 wheat varieties (lines)

2.5 抗赤霉病Fhb1分子標記檢測結果

為提高抗赤霉病Fhb1基因的檢測結果準確性，我們同時利用該基因的診斷性標記His3B-4和功能基因標記TaHRC-GSM對39份供試材料進行雙向驗證檢測是否攜帶有Fhb1。PCR檢測結果顯示，除陽性對照蘇麥3號外，所有材料均未能擴增出1 309 bp和1 400 bp目的條帶，這說明嚴重缺少抗赤霉病Fhb1基因的資源材料，在今后的培育工作中需要加強該基因的轉移利用。

2.6 抗白粉病Pm21分子標記檢測結果

在小麥的抗白粉病應用中，Pm21基因是目前應用最多的廣譜抗病性基因。利用Pm21抗病基因的標記CINAU-NLR對所有材料進行檢測，以綿麥367為對照，所有供試材料中僅有南麥660等6份材料擴增出477 bp的目的條帶，占比15.4%，其余材料均未擴增出目標條帶（圖3）。

圖3 Pm21擴增部分供試小麥品種（系）Figure 3 Amplification of Pm21 in some tested wheat varieties (lines)

3 討論

3.1 抗病基因轉移利用在南麥系列材料中的重要地位

四川省是中國重要的條銹病策源地和條銹病菌冬繁區，由于其特殊的地形和氣候條件，使得其不僅是條銹病的發病地也是條銹病流行區[12]。小麥種植大市南充市位于四川東北部，是典型的丘陵區，該地處于嘉陵江流域，冬季氣溫偏高且空氣濕度較大，近幾年的氣候條件均有利于條銹病菌的萌發和侵染[6]?；跅l銹病高發現實情況，條銹病抗性選育一直是南麥系列選育新品種的硬性條件之一。從本研究的結果來看，南麥系列的小麥品種（系）具有較好的條銹病抗性。從多份材料中檢測出Yr9、Yr10和Yr26等全生育期抗性基因，并且有多份材料在田間條銹病接種鑒定中表現出連續多年的中抗及以上水平。CYR34（V26）作為新的致病生理小種出現引起條銹病菌的流行，這使得以Yr10和Yr26等為主的抗病基因的攜帶品種開始逐步喪失抗病性[37]。研究中發現雖然CYR34對Yr10和Yr26具有聯合毒性，但Yr5、Yr15、Yr11-14、Yr16和Yr18等基因能夠減弱CYR34的侵染程度，特別是來自于野生二粒小麥G25的Yr15基因能夠抵御超過3 000個條銹病生理小種的侵染[13,38]。在本研究中，39 份材料均未檢測到Yr15基因，Yr5和Yr18基因也僅分別檢測到9 份和5 份攜帶有。目前，南充小麥抗病育種可用抗源嚴重匱乏，進一步引進篩選的新的抗病基因資源并應用于抗條銹病育種，是實現南麥系列抗條銹病整體水平提升的重要途徑。因此，在今后小麥培育中南麥系列品種培育應當加強Yr15等廣譜抗性基因的篩選和轉移利用。

本研究中所選取的39份材料，有一部分是已經通過審定的品種，其余部分為高代或者中間材料，通過對供試材料進行條銹病、白粉病和赤霉病進行分子標記檢測，以南麥941 為首的部分材料雖然檢測出多個抗條銹病基因和抗白粉病Pm21基因，但未檢測到抗赤霉病Fhb1基因。分析其原因，可能是由于前幾年在小麥揚花期間晴朗天氣頻率高，赤霉病發病率和嚴重度低，使得作為非傳統赤霉病高發區缺乏自然選擇壓力和較低的人為選擇關注度。因此，培育出的材料大多缺乏赤霉病抗性基因Fhb1。在四川小麥品種抗病研究中，鄧清燕等[39]從156 份材料中篩選到1份高代材料中攜帶有Fhb1基因，張華等[40]從153份四川主推品種和后備材料中也僅篩選到12份材料可能攜帶有Fhb1基因。Fhb1是目前報道出抗赤霉病最強并且最穩當的赤霉病抗病基因，被廣泛應用于育種和科學研究中。Fhb1基因主要來源于蘇麥3號和寧麥9號等材料及其衍生后代，以蘇麥3號為主的衍生后代中有些材料表現出產量較低、高稈等不利的農藝性狀，以寧麥9號為主的衍生后代寧麥、揚麥和鎮麥等材料在綜合農藝性狀上有較大提升[41-43]。本研究通過診斷性標記His3B-4 和功能基因標記TaHRC-GSM相結合的方式進行驗證篩選，均未發現可能攜帶有Fhb1基因的材料。因此，想要快速提高南充小麥赤霉病品種的選育，可以選擇從河南、江蘇等赤霉病高發區引進綜合性狀較好的抗病品種進行轉移利用。

3.2 利用分子標記促進南麥系列材料抗病基因的聚合

歷史事件表明，單一抗源條銹病基因的品種在生產中進行大面積使用，在短時期內雖然能夠取得良好的防治效果，但由于條銹菌生理小種的快速變異，一但新毒性小種的出現常會導致單一抗性品種在生產中快速“喪失”抗病性，也能夠加速新毒性小種占據成為優勢生理小種，引發區域內條銹病大爆發[10,44]。在檢測結果中，榮春南麥1號和特研麥88 雖然攜帶有全生育期抗性基因Yr5，但在連續3年接種鑒定中均為高感。我們推測可能是田間菌源豐富，致使個別單基因品種難以克服多個混合小種。因此需要加強多基因聚合來提高對混合小種的侵染。采用分子標記輔助選擇（marker-assisted selection，MAS）手段在進行資源鑒定和育種選擇時可同時達到高效率與高精準雙要求。李靜靜等[45]利用MAS 快速創制出攜帶有蘇麥3 號Fhb1基因的20 個新品系；高月等[46]利用MAS 將金禾9123、普冰01 和良星99 中的抗白粉病Pm21、Pm35和Pm25快速聚合至后代材料中。本研究通過抗病基因的分子標記快速鑒定出所有供試材料可能攜帶抗病基因類型情況，雖然檢測出24 份材料同時攜帶有3 個以上抗條銹病Yr基因，但均缺乏Yr5、Yr15、Yr18及YrAs2388這些全生育期、成株期廣譜抗性多基因聚合類型。以南麥941為代表的材料聚合有（YrAs2388+Yr10+Yr26+Yr65）4個抗條銹病基因，該材料在田間觀測中連續3年均為高抗條銹病，故在今后培育中可以進一步利用MAS 將廣譜抗性基因Yr15和赤霉病主效基因Fhb1聚合到南麥941 這一系列優異材料中。本研究中對12 個抗條銹病Yr基因和1 個赤霉病Fhb1及1 個白粉病Pm21基因進行功能標記或者緊密連鎖標記檢測，從檢測結果上看，這些基因都能夠通過相應的標記進行快速識別。因此，在今后南麥品種培育中，可以使用條銹病、赤霉病和白粉病基因相關標記進行輔助選擇促使品種同時聚合多個抗病基因類型。

3.3 39份南麥系列材料中可能攜帶有未知抗病基因

Yr9和Yr10等基因已經喪失了對CYR34（V26）小種的抗性，僅對小部分生理小種具有一定抵抗[37,47]。在本研究中，從南麥619 中檢測到Yr9和Yr10兩個條銹病基因，但在3年混合接種鑒定中均表現出中抗水平。由此我們推測在南麥619中可能還攜帶有其他抗條銹病基因未被檢測到。單一的條銹病基因或許已經喪失抗性，但當多個微弱基因聚合在一起的時候可能會產生加性效應，能夠表現出抗病性[47]。在檢測中我們還發現南麥660 和南麥904 兩份材料均同時僅攜帶有Yr10和Yr65兩個微弱基因，但這兩份材料在連續3年接種鑒定中鑒定為中抗和高抗，原因可能是抗性基因Yr10和Yr65表現出抗性水平，也可能是這些基因組合存在加性效應或上位效應，抑或是由于該種質攜帶其他未檢測到的已知或新的抗性基因存在。

目前對于赤霉病的遺傳研究，國內外已經定位到近100 個與赤霉病相關的QTL，這些位點在各個染色體上均有分布，其中僅有7 個Fhb1-Fhb7被正式的命名，其中Fhb1是被認為最好的抗赤霉病基因[48]。在本研究中，南麥941、南麥971、南麥990 和南麥991 在3年自然發病鑒定和1年單花滴注鑒定中均表現為中抗表現，但這4 份材料在診斷性標記His3B-4 和功能基因標記TaHRC-GSM檢測下均未發現Fhb1基因目的條帶。我們推測可能在這些材料中還存在有其他未檢測的FHB基因類型。

4 結論

在四川盆地條銹病傳統高發區、赤霉病日益頻發狀態下，本研究利用流行的混合生理小種（CYR32、CYR33、CYR34、貴22-14、水源類型等）和赤霉病孢子懸浮液滴注對39 份南麥系列品種（系）進行田間抗病性鑒定，獲得南麥941 和南麥995 等6 份高抗穩定材料；南麥941和南麥971等4 份中抗赤霉病穩定材料。利用已知的12 個條銹病抗病基因分子標記檢測供試材料，Yr9、Yr10和Yr26分布頻率較高，Yr15廣譜抗性基因均未檢測到。因此，應當加強對Yr15基因的轉移聚合。檢測到南麥941等7 份攜帶有YrAs2388基因，南麥995 等9 份攜帶Yr5基因，這些材料可以進一步作為條銹病抗性基因轉移利用資源加以利用。39 份材料赤霉病分子標記檢測結果現在均未攜帶Fhb1基因，但有部分材料田間觀察中均表現為中抗赤霉病，如南麥941 和南麥971 等4 份材料，可進一步加強對該材料抗源和抗性基因的挖掘，結合分子標記輔助選擇應用于小麥育種中。