用RT-qPCR方法評價4個不同豬品種骨骼肌候選內參基因

陳薪全，潘宇恒，敬云鴻，牛麗莉，甘麥鄰，趙 葉，陳 蕾，沈林園*，朱 礪*

（1.四川農業大學畜禽遺傳資源發掘與創新利用四川省重點實驗室，成都 611130；2.四川農業大學動物科技學院/農業農村部畜禽生物組學重點實驗室，成都 611130）

逆轉錄-定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)以其簡便、靈敏、準確的優勢，成為測定各種生物樣品中基因表達水平最常用的方法[1]。具有穩定表達水平的內參基因是調節和監測基因在不同處理或條件下表達變化的內在控制。因此，為了避免偏差，必須考慮RNA提取率、逆轉錄細節和RT-qPCR性能等幾個方面[2-4]。同時，需要選擇合適的內參基因來規范目的基因的表達，獲得可靠、可重復的結果。理想的內參基因應在各種條件下穩定表達，選擇合適的內參基因可提高基因表達檢測的準確性和再現性[5]。

內參基因通常被稱為管家基因，由于其表達的穩定性，在分子生物學研究中最初被用作規范基因表達的參照[6-7]。這些基因如GAPDH、ACTB、18S rRNA和Tublin是組成性表達的，因為它們是基本機體維持所必需的，并且它們已經在Western和Northern印跡實驗中被選擇作為加載對照[1]。然而，在使用RT-qPCR等更靈敏的技術時，這些經典內參基因的表達在不同類型的組織中以及在不同的實驗處理后可能存在很大差異[8-9]。但是，內參基因或任何其他基因只要在滿足實驗的條件下保持恒定的表達，有限的變異是可以接受的[10]。因此，在進行RTqPCR實驗之前，應該對候選內參基因進行驗證。

為了準確測量基因表達水平，建議采用多個候選內參基因進行歸一化，而不是選擇某一個來校準。目前已經開發了多種用于鑒定內參基因表達水平穩定性的算法軟件包，較為常用的算法有geNorm、NormFinder 和BestKeeper[10-12]。但運用不同算法處理后得到的最穩定的內參基因并非完全相同。在這些統計算法的幫助下，目前已有許多關于選擇合適內參基因的研究報道[13-16]。

在本研究中，我們檢測了4 個不同豬品種骨骼肌中8 個候選內參基因的表達水平，并運用3 種常用算法分析其表達穩定性。2009年，一篇論文報道了評估RT-qPCR 實驗所需的信息，名為MIQE 指南[17]。在此背景下，本研究旨在探討4 種不同豬品種骨骼肌中最合適的內參基因，為內參基因的選擇提供依據，并為今后的基因表達研究提供參考。

1 材料方法

1.1 實驗材料

本研究中使用的組織樣品來源于6頭360日齡藏豬骨骼肌、6頭200日齡成華豬骨骼肌、6頭160日齡DLY商品豬骨骼肌、3頭160日齡LY商品豬骨骼肌，以及8 個DLY 商品豬骨骼肌原代細胞樣，樣品采集后迅速置于液氮中并進一步在-80 ℃條件下保存。所有動物研究均經中國四川省四川農業大學動物科技學院機構動物倫理與福利委員會批準，許可證號：DKY-B20131403(中國科技部，2004年6月15日批準)。

1.2 RNA提取和cDNA合成

用TRIzol試劑(TaKaRa，大連，中國)按照生產商的說明，從豬的組織(用剪刀切割)和細胞(直接裂解)中提取總RNA。RNA 提取后，使用NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)檢測RNA 濃度(>200 ng/μL)和純度(1.8

1.3 實時定量PCR

實時定量PCR(RT-PCR)使用SYBR Premix Ex Taq 試劑盒(TaKaRa，大連，中國)在CFX96 實時PCR檢測系統(Bio-Rad,Richmond，CA，USA)上使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2×)(TaKaRa)進行。用2-ΔΔCt方法計算mRNA 的相對表達量[18]。RT-qPCR 所使用引物序列見表1。

表1 候選內參基因引物信息Table 1 Primer information of candidate reference genes

1.4 統計分析

為了評價候選內參基因的穩定性，采用了ge-Norm、NormFinder 和BestKeeper 等各具優勢的內參基因歸一化算法各篩選了3個內參基因。根據公式2-ΔΔCt將循環閾值（cycle threshold value，Ct）轉換為非歸一化相對量。geNorm 和NormFinder 的計算基于這些Ct值轉換后的數據，而BestKeeper 則直接使用原始Ct值分析。

2 結果

2.1 不同豬種骨骼肌候選內參基因的循環閾值(Ct)離散度評價

我們通過RT-qPCR檢測了29個骨骼肌樣本中8個候選內參基因的表達情況。各個內參基因在不同樣品中的Ct值分布如圖1所示，8 個候選內參基因在所有骨骼肌樣本中均有表達，但其表達量在不同豬種骨骼肌中存在一定差異。在所有候選內參基因中，GAPDH的Ct值平均值最低(14.49)，TBP的Ct值平均值最高(25.81)。Ct值分散較小的是TBP、RPL4、B2M和HPRT，這提示我們它們似乎是在這些樣品中表達穩定性最高的基因，而YWHAZ則似乎是在這些樣品中表達穩定性最低的基因。

圖1 箱線圖顯示所有骨骼肌樣品的候選內參基因的Ct值范圍Figure 1 Box-and-whiske plot shows the range of Ct values of candidate reference gene of all psoas muscle

為了進一步評估內參基因表達穩定性并確定合適的內參基因，我們使用了3 種較為常用的方法（geNorm、Normfinder 和BestKeeper 算法）來進行分析。

2.2 通過geNorm分析候選內參基因的穩定性

通過geNorm 軟件計算8 個候選內參基因的平均表達穩定性M值。在M值小于1.5 的前提下，M值越小，基因表達穩定性越高。在所有骨骼肌樣本中，從平均表達穩定性M值的大小來看，候選內參基因中M值最小的是TBP和HPRT，M值最大的是GAPDH，說明TBP和HPRT是8 個候選內參基因中最穩定的內參基因，而GAPDH是最不穩定的內參基因(圖2A)。同樣的方法應用于藏豬骨骼肌，結果表明HPRT和ACTB是最穩定的內參基因，而PPIA是最不穩定的內參基因(圖2B)。在成華豬骨骼肌中，HPRT和RPL4是最穩定的內參基因，而PPIA是最不穩定的內參基因(圖2C)。在DLY 豬骨骼肌中，RPL4和TBP是最穩定的內參基因，而PPIA是最不穩定的內參基因(圖2D)。在LY豬骨骼肌中，B2M和RPL4 是最穩定的內參基因，而YWHAZ是最不穩定的內參基因(圖2E)。在骨骼肌細胞樣品中，PPIA和YWHAZ是最穩定的內參基因，而B2M是最不穩定的內參基因(圖2F)。

圖2 候選內參基因的平均表達穩定性值Figure 2 Average expression stability values of candidate reference genes

根據geNorm 算法納入最不穩定內參基因后的歸一化因子值計算兩兩變異系數(V)，并根據Vn/Vn+1的值確定最優內參基因的個數。如果Vn/Vn+1的值小于0.15，則n為候選內參基因的最優個數。在所有骨骼肌樣本中，geNorm 得到的Vn/Vn+1值在0.132～0.316 之間，V2/V3值小于0.15，說明TBP和HPRT是最佳候選內參基因組合(圖3A)。另一方面，藏豬、成華豬、DLY 豬、LY 豬和骨骼肌細胞樣本的骨骼肌V2/V3的5 個值均小于0.15，說明進行歸一化的候選內參基因的最優數量為2 個。因此，在藏豬骨骼肌中，最佳候選內參基因組合是ACTB和HPRT(圖3B)。在成華豬骨骼肌中，最佳候選內參基因組合是RPL4和HPRT(圖3C)。在DLY 豬骨骼肌中，最佳的候選內參基因組合是TBP和RPL4(圖3D)。在LY豬骨骼肌中，最佳候選內參基因組合為RPL4和B2M(圖3E)。在骨骼肌細胞樣品中，最佳候選內參基因組合為YWHAZ和PPIA(圖3F)。

圖3 確定候選內參基因的最佳數量Figure 3 Determination of the optimal number of candidate reference genes

2.3 使用NormFinder 分析候選內參基因的穩定性

NormFinder 算法是通過計算基因表達穩定值對基因表達穩定性進行排序，從而篩選出最合適的內參基因。表2 的結果表明，在所有骨骼肌樣本中，TBP和HPRT的基因表達穩定值最小，為0.024，因此，TBP和HPRT是最適候選內參基因。在藏豬骨骼肌樣品中，最合適的內參基因是B2M。在成華豬骨骼肌中，最合適的內參基因是ACTB。在DLY 和LY 豬的骨骼肌中，最合適的內參基因都是RPL4。在骨骼肌細胞樣本中，最合適的內參基因是PPIA。這些結果表明，NormFinder 算法得出的最適內參基因與geNorm 算法得到的最適內參基因相似。

表2 通過NormFinder程序分析基因穩定性值Table 2 Analysis of gene stability value by NormFinder program

2.4 利用BestKeeper分析候選內參基因的穩定性

BestKeeper 算法是根據標準偏差值(SD)和變異系數(CV)評估候選內參基因表達穩定性的，其通過低SD 值和低CV 值來確定最適候選內參基因。根據BestKeeper 分析得到的數據如表3所示，在所有骨骼肌樣本中，最適內參基因為B2M。在藏豬骨骼肌中，最適內參基因是ACTB。在成華豬骨骼肌中，最適內參基因是GAPDH。在DLY 豬骨骼肌中，最適內參基因是GAPDH。在LY 豬骨骼肌中，最適內參基因是TBP。在骨骼肌細胞樣品中，最適內參基因是PPIA。這些結果表明，通過BestKeeper 算法分析得到的最合適內參基因與geNorm 和NormFinder算法取得的最合適最適內參基因相似。

2.5 各候選內參基因在所有樣本中的總體表達穩定性

為了獲得所有研究樣本中每個基因的整體表達穩定性，我們將所有骨骼肌樣品中每個基因的排名通過計算加權平均值得到一個綜合排名，最穩定表達的候選內參基因具有最小的排名平均值。表4的綜合排名表明，HPRT在所有骨骼肌樣品和藏豬骨骼肌中都是排名第1。在成華豬骨骼肌中，HPRT和ACTB是最適內參基因。在DLY 和LY 豬骨骼肌中，RPL4是最適內參基因。而在骨骼肌細胞樣本中，PPIA是最適內參基因。

表4 候選內參基因表達穩定性綜合排名Table 4 Candidate reference gene expression stability ranked by geNorm,NormFinder,and BestKeeper

3 討論

在分子生物學研究中，RT-qPCR是基因表達研究中最經典的一項技術之一，它需要合適的內參基因來規范基因表達，選擇合適的內參基因對于保證基因表達的準確性和再現性至關重要。在許多的動物基因表達研究中，最常用的內參基因是GAPDH和ACTB，因為它們具有較高的mRNA 表達穩定性[19]。正如先前的研究報道，GAPDH和ACTB在小鼠的心臟、肝臟、脾臟和胸腺4 個器官中穩定表達，符合內參基因的要求[20]。然而，在另一項研究中，GAPDH在人類卵巢腫瘤組織中的表達穩定性較低，在這一組織類型中不宜選擇GAPDH作為內參基因[21]。這表明最合適的內參基因在不同的組織中是可變的、是不固定的。目前，對于合適候選內參基因的評估，絕大多數研究都集中在某一物種的特定組織上[22-23]。為了獲得可靠且有意義的數據，研究者需要根據具體的樣本和實驗條件選擇合適的內參基因。

對不同品種、不同發育階段的生物學樣本進行分析，才能更好地揭示內參基因的選擇對基因表達的影響[24-27]。我們對研究頻率較高的內參基因進行了篩選，共選擇了8 個候選內參基因來進行探討。選擇了360日齡藏豬、200日齡成華豬這兩個地方豬種的骨骼肌樣品，以及160日齡DLY 商品豬和160日齡LY 商品豬的骨骼肌樣品。對于不同品種的骨骼肌樣品，運用不同的算法產生的內參基因表達穩定性排名并不完全相同，因此，用單一的算法來評估候選內參基因表達穩定性是片面的。為了獲得更全面的結果，我們在本研究選擇了3 種獨立的內參基因評估方法：geNorm、NormFinder 和Best-Keeper。例如，與預期一致，在所有骨骼肌樣本中，HPRT和TBP是geNorm 和NormFinder 算法得出的最適內參基因，而B2M是BestKeeper 算法得出的最適內參基因，這一結果表明了在這3 種算法程序之間存在一定的差異。因此，我們建議使用多個算法來評估內參基因穩定性。此外，我們將這3 種算法得出的結果整合到一起，為單個內參基因的穩定性排名分配權重，然后利用單個權重的均值統計得出一個綜合排名[28]。

在本研究中，我們綜合評估了不同豬種骨骼肌的最適內參基因穩定性。同時，本研究也存在一定的局限性。首先，我們選擇了8 個候選內參基因來進行RT-qPCR，還有一些其他常用的內參基因，如18sRNA、Hmbs和Top2b未被我們選擇使用。其次，本研究的結果可能并不適用于其他組織或豬品種，需要更多的研究來驗證在其他組織或豬品種中的內參基因穩定性。最后，還有一些其他的統計方法未被我們使用，如Refinder 和比較delta CT 法等，根據以往的研究，其他方法也可能獲得類似的結果。

4 小結

用3種獨立的分析方法分析不同豬種骨骼肌中8個候選內參基因的表達穩定性，結果表明，藏豬骨骼肌最適內參基因是HPRT，而成華豬骨骼肌最適內參基因是HPRT和ACTB。DLY豬和LY豬骨骼肌最適內參基因是RPL4，骨骼肌細胞樣最適內參基因是PPIA。說明不同豬種間的最適內參基因存在一定差異。綜上，本研究可為不同品種豬的骨骼肌最適內參基因的選擇提供一定的參考，可為內參基因的選擇提供依據，并為今后的基因表達穩定性研究提供有益的參考。