基于網絡藥理學和分子對接探析槲皮素對抑郁的作用機制

楊翼馳,劉 芳,聶家奇,馮倩倩,李小松,王素青

(1.武漢大學 公共衛生學院,武漢 430000;2.武漢大學 護理學院,武漢 430000)

抑郁是一種情緒障礙,以心理愉悅感消失、情緒低落超過2個星期、明顯軀體不適和功能缺陷為特征,臨床表現為失眠、意志減退、食欲異常、精神頹廢等,嚴重者有自殺傾向[1]。世界衛生組織(WHO)表示,截至2017年,全球患有抑郁癥的人數約為3.22億,而2005—2015這十年間,抑郁癥的患病率提升了18.4%[2]。目前,臨床上大部分抗抑郁藥治療周期長,有嚴重的副反應,且費用高昂,給抑郁癥患者及家庭造成了巨大的壓力[3]。因此,研究分子機制及靶點,研制出安全且高效的藥物對抑郁癥的治療極為重要。

槲皮素(3,3’,4’,5,7-五羥基黃酮)是一種普遍存在于人類膳食中的類黃酮物質[4]。廣泛存在于桑樹、山茶花、菖蒲、辣木、金絲桃、蔥、苜蓿、刺槐、葡萄和銀杏葉中[5]。槲皮素具有許多生物活性,例如抗氧化劑、抗炎、神經保護和腦保護等[6]。一項膳食類黃酮攝入量與認知功能的隊列表明,較高的類黃酮膳食攝入量可能與成年個體更好的認知健康有關,并且在單個多酚中,只有槲皮素與認知健康相關[7]。 FANG Ke等[8]發現,槲皮素可以緩解大鼠腹膜內注射脂多糖(LPS)誘導的抑郁癥。Samad等[9]也證明,槲皮素可以防止壓力引起的焦慮和抑郁樣行為,并改善雄性小鼠的記憶力。但截至目前,槲皮素改善抑郁的具體作用機制并未得到充分解釋 。

網絡藥理學是一門從系統生物學和網絡生物學中衍生而來的新學科[10]。建立 成分、靶點、疾病間的生物網絡關系是其常用方法,以研究藥物對機體的整體影響以及具體作用機制。本文擬采用網絡藥理學及分子對接技術,探討槲皮素對抑郁的作用機制,為臨床應用提供依據,以期開發出新的藥物用于抑郁癥的治療。

1 資料與方法

1.1 藥物靶點的收集

在Pubchem (https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數據庫中收集槲皮素(Quercetin)名稱、結構等相關信息,下載其二維結構并以SDF格式儲存。將該文件導入SwissTargetPrediction(http：//www.swisstargetprediction.ch/)平臺草圖繪制器,蛋白質靶標種類選擇“智人”,對靶點進行預測。SwissTargetPrediction平臺可以鑒定具有與查詢分子高度相似的已知配體的蛋白質,進而預測分子的靶標。進行預測時,3D 相似性值的閾值設置為 0.75,2D 相似性值的閾值設置為 0.45[11]。低于這些閾值,配體與查詢分子的相似性非常低,不顯示在結果中。接下來在Superpred(https：//prediction.charite.de/)數據庫中收集槲皮素的靶點。Superpred生物物種默認為“智人”,置信度為大于等于0.7,采用邏輯回歸機器學習模型對靶點進行預測。將收集到的靶點置于同一Excel文檔中,進行去重整合,校正為人源靶點。

1.2 疾病靶點收集

以“Depression”為關鍵詞,分別在OMIM(https：//omim.org)和Genecards(http：//Genecards. org)兩個數據庫中獲取抑郁疾病靶點信息。在OMIM中選擇具有已知序列的基因進行搜索。在Genecards中,若靶點數目過多,則以大于等于“Relevance score”的2倍中位數為篩選條件。將靶點信息置于同一Excel文檔中,整合抑郁相關靶點。

1.3 蛋白質互作網絡(PPI)構建及核心靶點篩選

通過Jvenn(http：//jvenn.toulouse.inra.fr/app/index.html)對槲皮素和抑郁靶點求交集,獲得槲皮素-抑郁的共同靶點,以CSV文件形式導出。將交集靶點文件上傳至STRING平臺(https：//cn.string-db.org/)進行PPI構建,蛋白質類型設置為智人,置信度設置為中等(0.400)。再將該網絡數據導入到Cytoscape3.9.1應用軟件 ,并使用CytoHubba插件中的MCC算法篩選出度值排行前10的基因為hub基因。CytoHubba插件是基于應用程序編程接口在Java中實現的。PPI網絡中每個節點定義為v,度值定義為F(v)。MCC計算后的度值定義為MCC(v) = ∑C∈S(v)(|C| - 1)!,其中S(v)是包含v的最大集團的集合,(|C|-1)!是所有小于|C|的正整數的乘積[12]。

1.4 GO和KEGG富集分析

在David平臺輸入槲皮素-抑郁的共同靶點進行富集分析,物種選擇“Homo sapiens”,最小基因數目為2,評分閾值<0.1。利用Excel軟件計算并篩選富集分析中校正后P<0.05的項,并對GO 生物過程、GO 分子功能以及 GO 細胞成分分析的前15項進行可視化展示。KEGG 通路按校正后P值大小排序,利用R軟件,以圖片形式對前15條通路進行展示。

1.5 分子對接

在RCSB PDB(https：//www.rcsb.org)下載度值前五的蛋白分子對應的復合體晶體結構,刪除配體部分,去除水分子,利用Discovery Studio2019中Macromolecules/Prepare Protein/Clean Protein功能對蛋白分子進行預處理。接著利用LibDock依次進行分子對接,并需要LibDockScore以確定靶點蛋白與槲皮素之間的結合力,得分較高的組分被視為與槲皮素相互作用的活性組分。

2 結果

2.1 藥物及疾病靶點的收集

在SwissTargetPrediction數據庫收集到100個槲皮素靶點,在Superpred數據庫收集到111個靶點。取并集后共獲得槲皮素人源靶點198個。在Genecards平臺共查詢到3 675個抑郁靶點,在OMIM平臺共查詢到188個靶點,去重合并后共獲得疾病相關靶點3 718個。

2.2 PPI網絡以及核心靶點分析

Jvenn中共獲得103個槲皮素-抑郁共同靶點,用韋恩圖表示(見圖1)。利用STRING平臺繪制槲皮素和抑郁交集靶點的PPI網絡圖,包括103個節點,536條邊。將其結果信息上傳至Cytoscape3.9.1軟件進行簡化(見圖2)。經MCC算法計算后,度值排名前10的hub基因依次為：SRC、MTOR、EGFR、AKT1、PTK2、CXCR4、KDR、IGF-1R、PIK3R1、PTPN11。依據MCC分數對hub基因進行可視化(見圖3),顏色由紅轉黃,MCC得分越高,其基因顏色越趨近于紅色。

圖1 槲皮素靶點與抑郁靶點的Venny圖Fig.1 Venny diagram of quercetin targets and depression targets

圖2 槲皮素和抑郁共同靶點的PPI網絡圖Fig.2 PPI network diagram of common targets of quercetin and depression

2.3 GO與KEGG通路分析

應用David平臺進行GO、KEGG富集分析。GO是基因本體(Gene ontology)的簡稱,用于注釋與其相關的生物功能、通路、以及其他的基因產品。經校正后P<0.05 的富集條目篩選,獲得了162條GO富集分析結果,其中包含88項生物過程條目,40項細胞成分條目,34項分子功能條目。圖4展示了各部分校正后P值最高的15條通路。各個部分顏色不同。橫向坐標代表校正后的P值,校正后P值越高,說明基因在通路富集程度越大。其中,最具有代表性的是生物進程條目,涉及凋亡過程的負向調節(Negative regulation of apoptotic process)、信號轉導(Signal transduction)和蛋白質磷酸化(Protein phosphorylation)等生物學過程。

圖3 排名前10的hub基因Fig.3 Top 10 hub genes

圖4 槲皮素作用靶點的GO富集分析Fig4 GO enrichment analysis of quercetin targets

經校正P<0.05篩選后,共得到107條KEGG信號通路結果。校正后P值排名前15的通路結果如圖5所示,主要有：缺氧誘導因子-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、ErbB信號通路(ErbB signaling pathway)、磷脂酶D信號通路(Phospholipase D signaling pathway)、神經營養素信號通路(Neurotrophin signaling pathway)等。橫軸表示Gene ratio ,表示 KEGG通路中所含的基因數目占所有基因的百分比;縱坐標表示路徑名稱;氣泡大小代表著富集的基因數目;縱軸展示通路名稱;氣泡尺寸表示富集基因的數量,其大小與富集基因數呈整正相關;以不同色彩代表P值,氣泡顏色隨P值依次漸變。其中,ErbB信號通路高度值hub基因富集程度最高,可能是最重要的信號通路(見圖6)。

圖5 槲皮素作用靶點的KEGG 通路富集分析Fig 5 KEGG pathway enrichment analysis of quercetintargets Molecular docking results

2.4 分子對接結果

分子對接結果顯示(見圖7),槲皮素與SRC 、MTOR、EGFR、AKT1、PTK2 分子對接LibDockSccore值依次為 95.718 8、97.583 3、77.993 5、114.16、93.314 5,對接評分均較高,說明槲皮素與這些靶標具有良好的結合能力。

3 討 論

本研究的主要目的是探析槲皮素治療抑郁的潛在機制。網絡藥理學結果表明,SRC、AKT1和mTOR可能是槲皮素改善抑郁癥的關鍵作用靶點。以往研究表明,LPS注射可導致小鼠神經炎癥和抑郁樣行為。LPS注射組小鼠腦組織中SRC-1表達降低,提示SRC-1在炎癥和抑郁中的作用[13]。 pCREB影響海馬突觸可塑性和空間記憶功能,它的表達減少與阿爾茨海默癥的學習和記憶受損有關。體外實驗中,SRC-1敲低顯著降低了pCREB表達水平[14]。神經炎癥可以誘導神經元再生,使神經營養因子釋放減少,導致神經活動失調,并有助于抑郁癥的發展[15]。有研究證實,PI3K / Akt通路的激活誘導NF-κB的磷酸化,這導致大腦區域的神經炎癥,并有助于嚙齒動物抑郁樣行為的發展[16]。PI3K / Akt / NF-κB通路也能在新生兒母體剝奪和慢性輕度應激的抑郁模型中被激活[17]。mTOR作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶[18],可通過p70S6激酶的磷酸化和哺乳動物eIF4E結合蛋白(4EBP)的抑制來調節神經發生、樹突狀脊柱生長和蛋白質翻譯啟動,從而合成神經元突觸所需的蛋白質[18-19]。這與目前抗抑郁藥的作用機制一致,即通過促使神經突觸再生,從而達到抗抑郁的目的。這些發現與我們的結果一致。因此我們推測槲皮素可能通過作用于SRC、AKT1和mTOR產生抗抑郁效應。

圖6 ErbB信號通路圖Fig 6 ErbB signaling pathway map

圖7 分子對接結果Fig 7 Molecular docking results

KEGG通路富集分析結果顯示,槲皮素治療抑郁可能與 HIF-1信號通路、ErbB信號通路等多條通路密切相關。HIF-1是一種由α、β兩種亞基構成的轉錄因子,能對缺氧作出反應。已有研究表明,HIF-1通路激活的顯著增加導致腦源性神經營養因子(BDNF)的持續表達[20]。BDNF廣泛存在于中樞神經系統,在海馬、皮質中大量表達,并參與神經元功能的維持、發育以及神經元受損后的修復,從而產生抗抑郁藥樣效應[21]。以上結果提示激活HIF-1信號傳導可在槲皮素治療抑郁中發揮重要作用。神經調節素-1(NRG1)是精神分裂癥,雙相情感障礙等多種精神疾病的易感基因,對皮質神經元、運動神經元、多巴胺能神經元、耳蝸感覺神經元和PC12細胞具有神經保護作用[22]。NRG1相關通路的異常改變與抑郁癥的發生密切相關。Bi等人發現,阻斷NRG1-ErbB4信號傳導增強了焦慮樣行為[23]。NRG/ErbB信號傳導改變后,轉基因小鼠出現異常行為以及學習記憶缺陷。因此,綜合既往文獻及本研究結果,推測槲皮素可能通過調控HIF-1、NRG/ErbB等多條信號通路來維持神經元功能和發育,從而發產生抗抑郁效應。

目前已有研究僅說明槲皮素可改善抑郁樣行為,并未對其具體機制進行研究。本研究利用網絡藥理學方法,發現了槲皮素治療抑郁的潛在靶點及通路,為設計和開發新的有效抗抑郁藥物奠定基礎。但本研究也存在一定局限性。首先,研究所使用的數據庫數據覆蓋范圍有限,不包含未經證實和未記錄的化合物或靶標。其次,分子對接本質上屬于計算機預測技術,無法完全代替動物實驗。因此,研究結果需在動物模型中進行進一步驗證。

4 結 論

研究以網絡藥理學方法為指導,利用分子對接技術,對槲皮素-抑郁的關鍵靶點進行驗證,發現槲皮素對抑郁的作用主要涉及SRC、AKT1、mTOR等靶點,HIF-1、NRG/ErbB等信號通路,提示槲皮素的抗抑郁機制可能是促進神經突觸再生、改善腦腸軸功能以維持神經系統正常功能。