酶分子設計常用策略和進展

蘇紹玉,葉秀云,鄢仁祥

(1.福州大學 生物科學與工程學院,福州 350100;2.福建省科學技術信息研究所,福州 350300;3.福建省海洋酶工程重點實驗室,福州 350116;4.福建福大百特生物科技有限公司,福州 350100)

酶分子設計是以其分子結構與功能規律作為基礎,通過生物化學、分子生物學以及生物信息學等手段,在基因和蛋白質層面上對現有酶分子進行改造優化,制造和設計出改良的酶分子,以滿足工業生產、生活以及科研的需要。酶是生物體內一種重要的分子,在細胞內部行使著重要的生物學功能。例如,酶作為蛋白質的一種重要類型,通常是一種具有高效催化效率和底物選擇特異性的天然生物催化劑。酶分子設計是在深入了解其空間結構與生物學功能關系的基礎上,改造和設計酶以獲得具有特定物理和化學性質的新分子。在漫長的分子進化歷程中,自然界已經進化出種類多樣的酶,但天然酶一般只是在自然條件下才發揮出其良好的生物學功能。在實際生活中,酶以及相關制劑在造紙、釀酒、紡織以及皮革等相關工業領域都有著廣泛的應用。另外,酶制劑一般可以用可再生資源進行生產,最終又可以通過自然界的微生物進行降解,具有綠色環保的特點,在提倡可持續發展的今天有著非常重要的應用意義。但在實際工業生產中的高溫高壓以及非水相溶劑(例如,釀酒中用到的酶制劑在酒精以及高溫環境中)等非常溫環境下酶的穩定性與催化活性一般會有所下降,甚至在一些情況下酶的活性可能會消失。因此,當代酶工程的研究趨勢之一就是探尋耐高溫、耐酸堿、耐鹽等可以適應工業需求的酶。根據實際需要,通常需要對蛋白質以及酶進行改造和優化設計,同時了解其發揮生物學功能所需要的生物環境,使其能夠在工業環境或者特定條件下仍然可以發揮甚至提高其生物學功能。在自然界中也存在一些可以適應工業需求的酶,這些酶一般存在于嗜高溫、嗜酸堿以及高鹽的細菌中。

從工業應用的角度來講,酶及其相關制劑的研發主要考慮兩個因素。一是酶制劑的分子特性參數,包括耐熱性、耐酸堿性、非水溶劑穩定性、抗氧化性、底物特異性、酶的催化活力效率以及酶表面活性劑的耐受性等;二是酶發酵水平的高低,即生產酶的工業成本的高低。本文主要討論酶的分子特性參數。從分子層面上來看,酶分子所具有的生物學功能有很大程度上是由其三維空間結構以及其所處的溶劑環境條件共同決定的。因此,酶分子三維空間結構構象、生物學功能信息以及所處溶劑環境條件對準確的酶分子設計提供了基礎性的數據支撐。近年來,隨著X射線晶體衍射、冷凍電鏡以及核磁共振等實驗技術快速和穩定的發展,越來越多的包括蛋白質在內的一系列復雜分子的三維結構得到準確解析,這些分子結構一般可以通過在蛋白質結構數據庫(https：//www.rcsb.org)中檢索獲得。另外,在AlphaFold數據庫(https：//www.alphafold.ebi.ac.uk)中也提供了大量預測的蛋白質結構[1]。近些年,也有報道使用AlphaFold和機器學習算法進行分子對接的研究[2]。這些分子三維結構對相應的生物學機理解釋提供了更加精細的信息,這也進一步促進了理性藥物開發和蛋白質分子設計的發展。在我們課題組前期的工作中,對幾種酶進行了研究,包括漆酶[3-4]和幾丁質酶[5-6]等,另外我們課題組也分別在兩個實例中對特定的酶進行改造,提高了酶的催化活力[7],以及提高了酶的熱穩定性[8]。國內外都有不少分子設計相關的網站和工具可以使用,例如美國密歇根大學結構生物信息學課題提供的https：//zhanggroup.org/research/#ProteinDesign 網站上就有不少基于蛋白質受體的分子設計工具。

從分子的角度來看,酶分子可以和多種分子相互作用,包括多肽、多糖、金屬離子以及小分子等,另外酶和其他蛋白質之間也會相互作用。同時,一部分的蛋白質是生物體內重要的酶[9]。酶分子的催化作用一般具有專一性、高效性、以及作用條件較為溫和等特點。通常來講,依靠結構信息的酶功能機理解釋,一般可以使用數學模型來描述酶分子結構和其催化活性以及穩定性之間的相關關系。這些數學模型的基本假設是酶分子結構中包含了決定其物理、化學及生物學等方面性質的大部分信息,而這些理化性質則進一步決定了酶分子的生物活性和穩定性。簡而言之,酶分子結構以及生物化學性質與其生物活性也存在一定程度上的相關性。另外,溶劑環境對酶分子功能也有影響。因此,結構和溶劑環境是構成分析酶分子生物學功能模型的重要參數[10]。目前常見的結構參數包括疏水性、電荷極性、幾何構型(例如立體和拓撲信息等)、構象表面特征以及理化性質等?；诮Y構的分子設計的原理,就是完成結構特征的數字化或者特征特化,同時不斷優化相應的結構特征,以提高酶分子催化活性和穩定性。本文從酶分子三維結構以及所處溶劑的視角對酶分子設計進行系統性總結和討論。

1 酶分子設計簡介

通常來講,酶分子設計的目的是獲得特定需求的新酶分子,或者獲得比已有酶具有更優良特性的新分子,或者設計出從基因層次上更容易表達的酶,或者探索可以展示出其最優生化性能的溶劑環境條件[11]。溶劑環境對酶性能有影響,簡單來說酶的催化活力在非極性溶液和水性介質溶液中有顯著差異,這是由于酶在非極性溶液環境中的介電常數較水介質溶液中的介電常數低。在非極性溶液環境中兩個帶電荷基團之間的靜電作用比在極性溶液環境中顯著增高。酶分子設計的原理就是讓其從一種狀態到另外一種狀態(例如,設計出更適合特定需求的狀態)轉變的過程。在自然界中也存在這種酶分子在不同狀態之間根據不同溶液環境自動化轉變的過程,其中比較著名的例子之一是脂肪酶。脂肪酶隸屬于羧基酯水解酶類,能夠逐步地將甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。脂肪酶一般存在于含有脂肪的動物、植物和微生物的組織中。同時,脂肪酶也廣泛地應用于藥品、食品生產以及生物化學產品等實際應用方面[12]。

來源不同的脂肪酶,在氨基酸序列、組成以及結構上存在一定的差異,但一般相同類型的脂肪酶的三維結構是比較相似的,即脂肪酶之間存在進化層面上較強的弱同源性。脂肪酶的活性部位一般由絲氨酸(S)、天冬氨酸(D)、以及組氨酸(H)等氨基酸殘基組成。脂肪酶屬于絲氨酸蛋白酶類,這個主要由三個氨基酸組成的活性區域一般也稱為S-D-H三聯體催化部位。脂肪酶的催化部位一般包埋在分子結構內部,結構表面則被一小段特定的氨基酸殘基形成的螺旋蓋狀結構覆蓋(此結構又稱為脂肪酶活性口袋的“蓋子”),對三聯體催化部位起保護作用。脂肪酶活性影響的關鍵相關因素之一是活性口袋的開閉。通常認為,酶分子處于活性口袋打開的狀態(即激活狀態Activation state)時,才能更易于在與底物的碰撞過程中發生結合和反應。在圖1中清晰地以三維結構形式展示一種脂肪酶活性口袋的開閉狀態。從PDB[13]結構數據庫中下載了一種脂肪酶的兩種狀態結構,其PDB號分別為1DT3和1EIN[14]。在Pymol[15]軟件中對兩個酶結構通過使用結構比對命令進行結構重疊。其中,圖1a中紅色和黑色圓分別是這個酶激活和非激活狀態時活性口袋的大小。藍色和紅色箭頭分別表示結構重疊的兩個結構(見圖1a)分開后的兩個結構(見圖1b,1c)。從圖1a中可以看到,1DT3為酶活性口袋未激活時的種狀態,顏色主要渲染為紅色;1EIN為此酶活性口袋的打開狀態,顏色主要渲染為綠色顯示。

圖1 脂肪酶活性口袋的開閉狀態Fig.1 Open and closing states of the lipase activity pocket

在這個脂肪酶中,活性結合位點為146位的絲氨酸(S146)、201位的天冬氨酸(D201)以及258位的組氨酸(H258)。這三個結合位點氨基酸殘基在圖1a中渲染為黃色。通過結構重疊的結果,可以看到這個脂肪酶的開閉狀態主要差異在于一個二級結構以α-螺旋為主的區域(即脂肪酶活性口袋的蓋子,在圖1a中渲染為褐色),這個區域在這個酶中的位置為85到92的氨基酸片段“SIENWIGN”。當脂肪酶結構處于催化活性激活狀態時,其活性口袋明顯比非活性狀態時更大(相應活性口袋區域在圖1中標注為黑色和紅色圈)。圖1b為脂肪酶打開活性口袋狀態時的脂肪酶表面圖,其中黃色區域為活性氨基酸殘基。圖1c為脂肪酶活性口袋關閉狀態時的表面圖,雖然此時活性氨基酸也標注為黃色但是因為其被包埋在結構內部所以無法觀測到。當脂肪酶分子處于水溶液中時,蓋子的疏水性氨基酸朝內,從而關閉活性口袋。而當脂肪酶處于油水界面時,疏水氨基酸會朝界面處油脂分子結合,從而打開了活性口袋,這個過程增強了底物和酶活性中心的催化活力。大多數脂肪酶在脂質與水的界面上時會自動打開這個蓋子從而使脂肪酶的活性提高。當脂肪酶處于非活化狀態時,這個蓋子又可以自動關閉以保護活性部位。例如在純水介質中,脂肪酶中蓋子主要是關閉的,而在疏水層的存在下(例如油脂界面處),蓋子會逐漸打開以激活催化活性。

與脂肪酶類似,自然界中的不少酶都存在這種活性口袋的開閉狀態。例如,胃蛋白酶也存在生物活性激活和非激活兩種狀態。從生物化學的角度來看,胃酸可以激活胃蛋白酶。同時,胃蛋白酶非激活狀態結構可以讓其貯存在其合成部位而沒有引起細胞或組織自我消化與水解的潛在危險,待細胞需要其功能時再進一步被激活。從分子三維結構的角度來看,胃蛋白酶原處于沒有活性狀態結構時也主要是因為活性中心未暴露出來。一般通過調整胃蛋白酶所處環境的pH值、以及對一些特定多肽鏈的剪切修飾等方法使酶的活性中心形成或暴露出來,進而激活其酶活性。胰蛋白酶原也有類似的活化機制。另外還有其他類似例子,例如Liu等報道昆蟲中的一種酶可以在蛻皮液中被激活從而在特定時期發揮其生物學活性[16]。

一些酶在不同的溶劑環境中(例如油水界面、溶劑的酸堿性),其活性口袋區域可能處于關閉和打開的兩種重要的不同狀態。這個核心活性區域的關閉和激活打開現象也為酶分子設計提供了一些思路,在需要提高酶分子的活性時打開其活性區域或者在保持結構穩定性的同時盡量擴張其活性空腔區域,并探索促進酶分子打開和關閉其活性口袋的最優溶劑環境。

2 酶分子設計工具之分子對接

分子對接是分子之間空間結構與能量的雙重匹配過程。分子對接是酶分子設計中的重要方法之一。分子對接這一概念的歷史最早可以追溯到19世紀由 Fischer等學者提出的受體學說。受體學說認為,其他分子會與酶分子即受體會發生類似鑰匙與鎖之間的識別關系,這種分子識別關系主要依賴兩者之間空間與能量的相互作用。通常情況下,可以與酶相互作用(即可對接)的分子包括小分子、金屬離子、多糖以及多肽等,以及蛋白質和蛋白質之間也可以對接。不同類型的分子與酶對接一般使用不同的對接力場體系,即使用不同的對接程序完成這個對接過程。小分子(包括多糖)和酶分子對接一般使用AutoDock Vina[17]。酶分子和其他蛋白質大分子之間的對接一般使用Zdock[18]。多肽和酶分子對接一般使用Flexpepdock[19]。網絡上還有不少其他可以實現類似功能的程序和網站。不同的對接體系一般所使用的能量函數不同,在通常情況下不同能量函數之間不可混用。

分子對接在酶分子設計中主要用于衡量酶分子和底物(或者酶分子和其他分子)之間的可匹配性。分子對接一般是從兩個維度進行,第一個維度是計算結合親和力的大小;第二個維度是計算分子復合物的結合模式構象。一般而言,活力更好的酶與相應底物的親和力更強;另一方面,分子對接過程中,也可以分析活性通道中改變哪些氨基酸可以更好地減少底物對接過程中的空間位阻效應?？臻g位阻效應主要指底物進入酶分子活性空腔過程中的空間阻礙作用。酶分子催化反應中空間位阻效應會降低其催化活性。通常來講,底物進入受體活性通道中的空間位阻效應越小,那么相應酶分子的活性則越高?？臻g位阻效應的原理是每個原子在分子中占有一定的空間。如果原子太接近了,相鄰的原子就會形成重疊的電子云表現為斥力。另外,對接結果中對酶分子-底物相互作用的關鍵氨基酸分析,也可以對設計更強親和力的酶分子提供一定的線索。一般可以設計不同的結構突變體,之后不同的結構突變體分別和底物進行對接,通過對接的親和力分數大小以及結構構象判斷突變是否比原始結構更加優良。

圖2為AutoDock Vina軟件的使用界面。學術界通常使用AutoDock Vina等一些開源軟件對酶分子和小分子進行對接。在進行分子對接前,酶分子的結構文件格式需要進行初始化,例如酶分子結構文件一般需要經過去水、加氫原子、加電荷等處理后存為pdbqt格式。類似地,小分子配體也需要經過前處理并存儲為pdbqt格式。AutoDock Vina在分子對接過程中還需要指定一個對接區域盒子(Box),使盒子包括酶分子的活性口袋(見圖2),可以把一些與配體有相互作用的氨基酸殘基選擇出來作為設定box的參考。盒子的位置和大小一般通過指定盒子的中心位置(x,y,z)以及盒子的長寬高來確定的(見圖2)。酶活力直接相關的區域稱為酶的活性口袋或者活性中心。通常又將活性中心分為結合部位和催化部位。結合部位負責與底物結合,決定酶的專一性。催化部位負責底物鍵的斷裂和新鍵形成,決定酶的催化能力。酶的活性部位位于空腔之內,底物分子(或者一部分)結合到空腔內并發生催化作用?？涨皇鞘杷暂^高的區域,非極性氨基酸多,但也含有極性氨基酸,以便與底物結合并發生催化反應。其疏水性質產生一個微環境,提高與底物的結合能力有利于催化?？涨坏幕钚晕稽c對于不需要輔酶的酶來說就是幾個氨基酸,而對于需要輔酶的酶來說輔酶或者輔酶的一部分也可能是活性部位的組成部分。酶與底物結合主要依靠氫鍵、鹽鍵、范德華力、疏水作用等作用力。酶的活性中心一般具有一定的柔性和可運動性。

圖2 AutoDock Vina程序分子對接界面Fig.2 Molecular docking interface of AutoDock Vina program

圖3為酶分子1IEP(轉移酶的一種)[20]分別和小分子伊馬替尼(Imatinib)以及布洛芬(Ibuprofen)進行分子對接的結果。伊馬替尼(圖3a上小分子)是全球首個獲得批準的腫瘤發生相關信號傳導抑制劑。布洛芬(圖3b上小分子)也為酶的一種抑制劑,在生物體內有鎮痛、抗炎等作用?？梢酝ㄟ^對接結果來判斷兩個抑制劑對蛋白1IEP作用效果的差異。這里對復合物的模型的模擬是使用AutoDock Vina[21]軟件進行分子對接得到的。在圖3a中,黃色小分子為伊馬替尼在對接前的初始結構,紅色小分子為對接后的結果。蛋白質1IEP和布洛芬對接結果在圖3b中(圖3b中紅色為對接后的布洛芬),其親和力數值為-8.5 kcal/mol。而酶1IEP和伊馬替尼對接的親和力數值為-10.5 kcal/mol。從親和力的數值上來說,小分子伊馬替尼對酶1IEP相互作用更好一些。在這個實際例子中可以根據對接結果的能量來判斷蛋白質和小分子相互作用的強弱。

圖3 使用AutoDock Vina軟件進行分子對接例子Fig.3 Examples of molecular docking using AutoDock Vina

圖4是以球形對酶分子的活性空腔進行展示。此圖為使用Discovery Studio 2019(福州大學海洋酶工程重點實驗室購置的正版Discovery Studio軟件,https：//www.3ds.com)繪制而成。此酶分子的活性空腔區域可以用一個球狀結構進行表示。球狀結構的酶活性口袋一般用(x,y,z,r)的一組4個數值組成的向量表示。其中坐標(x,y,z)表示該球體的球心位置,以及r表示球體的半徑。

圖4 酶活性空腔的展示Fig.4 Demonstration of an enzyme active cavity

找到酶分子的空腔是分析其結合位點的關鍵步驟之一[22],一般通過把酶分子結構以表面的形式顯示的方式尋找空腔[23]。在圖5中,使用Discovery Studio軟件畫出的酶分子1IEP的6種表面形式(表1詳細列出6種表面信息),包括疏水表面(見圖5a)、電荷表面(見圖5b)、氫鍵受體和供體表面(見圖5c)、溶劑可及性表面(見圖5d)、芳香環表面(見圖5e)以及離子化表面(見圖5f)。

分子對接不僅僅在酶分子設計領域有著廣泛應用,也常常用于一些蛋白質功能的機理解釋。例如,生物殺蟲劑有效成分通常是一些化學小分子物質,那么實用的殺蟲劑就需要可以抑制蟲子中的一些受體分子(通常為蛋白質),但是同時需要對人體內相應的受體分子的沒有抑制作用或者抑制作用相對弱一些。在這種情況下,可以對殺蟲劑的有效成分小分子與昆蟲以及人體內相應的蛋白質進行分子對接,并進行親和力和構象分析。通常來講,設計良好的殺蟲劑小分子對昆蟲中相應蛋白質的親和力會更強一些。

表1 不同類型的蛋白質表面Table 1 Different types of protein structural surfaces

圖5 蛋白質不同表面形式Fig.5 Different types of protein surfaces

除了計算酶分子和底物結合親和力外,分子對接結果還可以用于詳細地分析活性區域以及相互作用關鍵氨基酸,這在酶分子設計中可以對關鍵氨基酸突變體設計提供一些設計思路。分子對接是研究底物和酶的重要手段之一。某個底物能夠激活生物酶、靶點、受體信號的傳遞,這些都可以通過分子對接方法進行相應的分析。

通常來講,分子對接是進行酶分子設計的重要手段之一。但是,酶分子的實際應用不是簡單的與配體分子結合完成的。通過生物實驗的分離手段將蛋白質分離后,其體外活性狀態和其在生物體里(細胞膜上或細胞液里)是不太一樣的。作為酶分子設計,做完分子對接后不是結束,后面組織、動物的實驗、或者工業實際應用,這一系列的問題都需要研究通了。生物體各系統是相互連貫的,而且多系統平行。因此,基于分子對接的酶分子設計或者底物設計后續都要進行詳細的實驗驗證。

3 酶分子設計工具之動力學模擬

酶分子設計中另外一個常用到的方法是分子動力學模擬(Molecular dynamics simulation)[24-25]。經典分子動力學的模擬過程一般是從一個定義好的構型開始,這個構型可以是分子對接好的復合物也可以只是一個蛋白質單體,之后使用牛頓運動方程來計算蛋白質原子的動態軌跡。對于酶分子體系中的每一原子,所受的合力根據其與其他粒子之間的相互作用來計算,這些相互作用通常以力場的形式進行描述。分子力場有時也被稱為勢函數。一般分子力場勢函數包括以下幾個部分：描述分子內成鍵作用的項;鍵伸縮能：構成分子的各個化學鍵在鍵軸方向上的伸縮運動所引起的能量變化;鍵角彎曲能：鍵角變化引起的分子能量變化;二面角扭曲能：單鍵旋轉引起分子骨架扭曲所產生的能量變化;交叉能量項：上述作用之間耦合引起的能量變化。一個可靠的分子力場對準確模擬出酶相應的動態變化構象具有關健性的作用。目前常用的分子力場是CHARMM和Amber等力場[26]。同時,分子力是分子動力學模擬中的參數之一,分子力以粒子的質量為加速度, 再加上粒子以前的位置和速度,這就決定了一小段時間步長之后粒子的新位置。目前常用的分子動力學模擬軟件包有Amber(http：//ambermd.org)和Gromacs(http：//www.gromacs.org)等。通常來講,長時間的分子動力學模擬(例如,10納秒以上的模擬過程)對理解酶生物學功能背后的原理以及酶分子設計非常有用。通常來講,模擬的時間長度越長,相應的結果越可靠。近些年新版本Amber[27]軟件(例如版本21)通常通過CPU多線程以及GPU等技術來提高模擬的速度進而縮短了分子模擬程序運行時間。

在分子動力學模擬中也需要考慮酶分子所處的溶劑環境因素,這樣才能更準確地模擬出相應的動態結果?？茖W界已經證實一些酶分子變性后在去除變性因素仍然可以恢復其之前的三維結構。這表明酶分子的序列及其所處的溶劑環境也一定程度上決定其三維空間結構。所以,在動力學模擬中,常常通過調整不同的參數(例如溶劑的pH值)以及不同的溶劑化環境(例如,水溶液、有機溶液或者水和有機溶劑的混合體系)的方式來獲得酶分子特定的動態三維結構。酶在有機相中催化反應過程有其特點：例如,疏水性底物或者產物的溶解度增加;可以一定程度抑制有水參與的副反應;酶一般不溶于有機容易易于回收;一定程度減少微生物污染等。因此,進行動力學模擬時,需要指明酶所處的溶劑環境。在溶劑環境和結構確定的條件下,動力學模擬一般可以模擬出酶的動態結構。

目前,經典分子動力學模擬Amber網站[27]提供軟件的下載和使用教程。但可能由于動力學模擬需要的計算量較大等原因,Amber網站目前還沒有提供可以直接提交數據就計算的網絡服務器。在用Amber軟件過程中,進行結合自由能計算與能量分解通常用MM-PBSA/GBSA方法。為了更深入地表示蛋白和氨基酸殘基之間的相互作用,一般研究工作中會用相互作用能量和氨基酸殘基數的一個關系圖表示,可以把每個殘基對結合能的貢獻算出來。從使用的角度來說,分子動力學模擬一般主要分為能量最小化(Minimization)、體系加熱(Heating)、平衡(Equilibrition)、數據采集(Production)以及結果分析等幾個主要步驟。同時要注意動力學模擬前需要進行前體系溶劑化,并在體系中加抗衡離子等準備步驟。分子動力學模擬常用的時間單位是皮秒(符號ps)以及納秒(符號ns)。經過一定時間長度的模擬,通?？梢垣@得上千個甚至數量更多的酶結構構象。結果分子中,一般通過聚類算法把這些構象進行分類并篩選出具有代表性構象以此來觀察酶的動態結構[28]。

在生物體內或者生物反應體系中,每個酶分子結構都不是靜止的,基本都像個小機器,有一定的構象變化。但結構生物學目前的晶體衍射實驗手段通常只能獲得靜止的三維結構圖片。NMR實驗方法可以獲得一定范圍內酶的動態結構。為了揭示相應分子機制,就要不斷獲得中間態的三維空間結構照片,獲得的動態幀數越多則相應機制解釋得越精準。動力學模擬可以用于模擬酶催化過程中的構象變化以及計算這個成果中的自由能變化,找出酶催化過程的關鍵氨基酸殘基。動力學模擬也可以用于模擬酶與不同底物的結合狀態,以及探索可能的催化機理。因此,基于分子動力學模擬得到的分子動態結構是分子設計的重要信息之一,成為現有NMR實驗方法獲得酶動態結構的一種重要補充方法。

4 小分子相關資源

從小分子數據庫PubChem[29]中(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)可以獲得各種小分子的結構文件和相應分子功能信息。另外,PDB(https：//www.rcsb.org)數據庫中存儲的雖然主要為蛋白質的結構信息,但是其中不少蛋白質為復合物結構,在這些復合物結構中也存在小分子結構,即也可以從PDB數據庫的蛋白質的復合物中獲得小分子的結構數據。PDB數據庫中同時存儲著蛋白的突變數據,這些突變體的不同突變位點對應著不同的性質,這些突變位點數據為酶分子設計提供了重要參考信息?？梢杂眯蛄斜葘徒Y構疊加等方法把這些位點對應到目標酶上,從而可以根據模板的突變位點和性質信息系完成初步的酶分子設計和優化。對于未知結構和結合位點的酶,可以使用一些預測工具,例如密歇根大學的結構生物信息學實驗室https：//zhanggroup.org網站,進行結構和功能位點的預測,這樣可以根據相應的預測結果進行分析。

除了從PubChem和PDB等數據庫直接下載小分子外,小分子的結構也可以采用ChemOffice[30]以及Discovery Studio等軟件進行直接繪制得到,并可通過能量最小化等步驟優化其三維結構。特別是對一些比較新穎的小分子結構,一般從數據庫中難以直接獲得其三維結構。這種情況下,通過繪圖軟件獲得小分子的三維結構是可行的途徑之一。配體分子與受體酶分子之間相互作用關系通常分為激活、抑制、以及拮抗三種作用關系。激活作用主要是指配體提高了酶分子相應的活性。與此相反,抑制作用是指配體抑制了酶分子的活性。受體拮抗劑,也叫阻斷劑,指能與受體結合,并能阻止激動劑產生效應的一類配體物質。拮抗作用系指兩種以上分子合并使用后,使激動劑作用反而減弱或消失,多數情況下有拮抗作用的分子不宜配對使用。

一般而言,直接通過分子對接和分子動力學的方式難以直接判斷小分子對酶分子是激活、抑制、以及拮抗三種作用中的哪一種。為了分析具體的相互作用類型,一般是通過實際的生物實驗來判斷小分子和酶分子之間的作用關系。

5 酶分子設計常用策略

目前,學術界關于酶分子設計通常采用定點突變(Site-directed mutagenesis)的方法進行設計的主要兩個方向為提高酶分子的催化活性以及提高其穩定性。在分子設計中,提高酶分子的催化活性和提高酶分子穩定性一般采用兩種不同的策略。提高酶分子催化活性一般是以酶分子-底物的復合物(可以是實驗解析的復合物構象,也可以為分子對接的到的復合物結果)中距離底物3-5 ?距離范圍內的酶分子氨基酸進行突變,即在酶分子的活性口袋及其附近進行位點突變;而提高酶分子穩定性則一般選取遠離酶分子活性中心區域的氨基酸進行突變。有時會進行多個位點協同突變,以期同時提高酶分子的活性和穩定性。提高酶分子的穩定性是讓其更好地適合工業應用。雖然目前學術界已經篩選出了數量眾多以及種類多樣的酶分子,但是在工業應用的環境一般都是處于高溫高壓以及強酸強堿條件下,大多數酶分子在這種情況下可能會失活或者不太穩定。因此,需要對酶分子進行設計和改造,使其在特定條件下仍然可以起到一定的生物學功能甚至可以提高其生物學功能。

表2中列出了用于酶分子設計不同目標的策略。從生物物理學的角度來看,提高酶的熱穩定性的分子設計策略一般是通過增加酶分子中化學鍵的數量,包括共價鍵和非共價鍵的數量來提高酶分子的熱穩定性以及耐酸堿性等。構成酶分子的原子間通過共用電子對作用形成的化學鍵為共價鍵,共價鍵一般包括肽鍵以及二硫鍵等。非共價鍵包括主要包括氫鍵、范德華力、鹽鍵、疏水作用力、芳環堆積作用、鹵鍵等。這些共價鍵和非共價鍵的化學鍵的數量增多一般有利于提高酶分子的穩定性。另外,酶分子制劑也需要一定的穩定性以方便儲存、運輸以及在實際在復雜環境中使用。同時,降低酶分子聚集性也是提高其穩定性的一個方面。因此,提高穩定性是酶分子設計中需要考慮的一個重要因素。

酶分子一般可以和許多功能類似的小分子分別對接。在這種情況下,可以分析這些小分子之間的共性,一般可以通過藥效團(Pharmacophore)[31]的方式進行的。藥效團是特征化的小分子三維結構要素的組合,可以分為兩種類型。一類是具有相同藥理作用的類似物,它們具有某種基本結構,即相同的化學結構部分,如磺胺類藥物、局麻藥、受體阻斷劑、擬腎上腺素藥物等;另一類是一組化學結構完全不同的分子,但它們以相同或類似的機理與同一受體鍵合,產生同樣或者類似的藥理作用,如己烯雌酚的化學結構比較簡單,但因其立體構象與雌二醇相似,也具有雌激素樣作用。對藥效團的分析可以找出底物和蛋白質結合的關鍵區域,發現其中的規律,這為酶分子設計提供一定的線索。同時,生物實驗中一般通過易錯PCR的方法可以獲得酶分子的突變體并進行篩選。易錯PCR一般通過調節體系中的Mg2+、Mn2+以及dNTP濃度來提高PCR過程中的突變率。在易錯PCR過程中,增加突變頻率可以通過在每一輪PCR反應中使用低保真的DNA聚合酶,改變dNTP濃度(例如,使其中1種dNTP濃度高于其他3種),同時可以一定程度地提高二價陽離子Mg2+、Mn2+等在溶液中的濃度來達到。同時,這是一個累計的過程,可以通過多輪的易錯PCR過程調節最終的突變率。另外,隨機突變也是酶分子設計的常用策略之一。

表2 用于酶分子設計的不同目標Table 2 Different objects in enzyme molecular design

酶分子設計中常常也會考慮以增加二硫鍵(Disulfide bond)的方式來提高穩定性。 二硫鍵是連接不同肽鏈或同一肽鏈中,兩個不同半胱氨酸殘基之間的化學鍵。二硫鍵是一種比較穩定的共價鍵,在酶分子中主要起著穩定肽鏈空間結構的作用。一般而言,一個酶分子中二硫鍵數目越多,則酶分子對抗外界因素影響的穩定性就愈大。在酶分子設計中,也常常以提高酶分子整體二硫鍵數量的方式來提高酶分子的穩定性。一個區域打算設計為其他不同的二級結構,那么可以從容易形成特定二級結構的氨基酸中選取。二級結構是分子設計中的重要內容。例如,1988年杜邦公司宣布,成功設計并合成了由四段反平行α-螺旋組成為蛋白質。另外,酶分子相應區域的親疏水性和酸堿性也是分子設計的考慮因素。在農業科學的研究中,常常以開發酶或者蛋白質抑制劑的方式來設計農藥分子。因此,抑制劑的開發也是酶學研究中的內容之一。凡是能降低酶促反應速度的物質統稱為抑制劑。表3中詳細列出了酶分子設計的常見策略。

表3 酶分子設計中常用策略Table 3 Common strategies used in enzyme molecular design

酶分子的聚合情況有時也是影響其功能的一個重要方面。一個酶分子的結構域數量一般是以其一條鏈中所含結構域的個數進行確定的。一般而言,酶分子的結構文件中有幾條鏈,那么這個酶分子就是幾聚體。例如,漆酶(Laccase)就有雙聚體和三聚體兩種類型[32]。酶分子為幾聚體的情況也可以做為分子設計的內容之一。例如,陳等[33]就通過突變氨基酸阻止蛋白質的二聚化來設計阻止腫瘤和炎癥發生的靶點。

酶分子設計的過程(見圖6),首先需要通過結構預測算法(例如,I-TASSER[34])或者搜索數據庫(例如PDB和AlphaFold數據庫)等方法建立所研究對象的結構模型,在此基礎上進行結構-功能-應用的關系研究,然后提出設計方案,通過實驗驗證后進一步修正設計,這往往需要幾次循環才能達到目的。一般的分子設計工作通?？梢园匆韵聨讉€主要步驟進行：

1)通過結構生物學實驗或者同源建模等方法構建目標酶分子的三維結構模型;

2)找出對所要求的性質有重要影響的位置和區域。提高酶催化活力一般是選取靠近活性口袋的氨基酸,而提高酶穩定性一般選取遠離活性口袋的氨基酸。提高酶穩定性選取遠離酶活位置一般是為了在提高酶穩定性的基礎上不影響酶的活性,同時二級結構區域一般選擇為LOOP;

3)對上一步中所選出位點上改變殘基所得到的突變體,一方面使突變體酶分子產生具有所要求的性質,同時考慮殘基的體積、疏水性等性質的變化所帶來的影響;

4)預測突變體的結構。同時計算突變后的自由能的改變量ΔΔG=ΔG(天然)- ΔG(突變),從能量變化的角度來判斷突變體是否符合要求,其中ΔG為折疊態和伸展態之間的吉布斯自由能差;

5)定性或定量計算優化所得到的突變體結構是否具有所要求的性質。

一般而言,能否成功地進行酶分子設計,除了要求有較為合理的設計方案外,一般還需要在研究過程中探索相應酶所具有的結構化學和物理化學參數等,最終設計出來的結構是否符合需求需要通過實際生物學實驗來進一步驗證。

圖6 酶分子設計一般流程Fig.6 A general flowchart for enzyme design

6 酶分子設計經典案例

表4中列出了酶分子設計相關的生物信息學軟件資源。這些軟件資源廣泛的應用酶分子設計的研究中。近些年來國內外不少課題組都研發一些經典的酶分子設計案例。例如,Xia等通過比較三種酶結構(嗜冷酶VPR、嗜中溫酶PRK和嗜熱酶AQN),并進行了多副本分子動力學模擬[35]。然后進行了連續靜電學計算和靜電表面勢的比較,實驗結果表明,靜電特性差異有助于三種酶對不同溫度的適應,從而為進一步的酶工程、誘變以及分子設計研究提供了基礎[35]。在這個案例中,Xia等直接從PDB數據庫中獲得蛋白質晶體結果,之后使用GROMACS軟件進行多副本的分子動力學模擬,這樣有助于較為準確的模擬出酶催化過程的動態過程。同時,作者采用VMD軟件進行結構圖形顯示和分析。在多種分子作用力的比較中,靜電作用為三種酶性質差異的主要因素。

Tang等[36]通過改進的標準化B因子指標以及二級結構的LOOP方法來定位提高酶熱穩定性的關鍵區域,同時采用環嫁接策略提高枯草桿菌蛋白酶的熱穩定性。B因子指標是晶體學中原子狀態的“模糊度”,其數值越大則相應部分構象就越不穩定或者柔性越強。因此,酶結構中B高因子區域的氨基酸突變后,酶穩定性容易提高。在這個案例中,Tang等[37]采用Swiss-Model網站對目標蛋白進行結構建模,并用Pymol軟件進行B因子計算,之后采用Amber軟件進行分子動力學模擬。B因子法是這個工作中篩選突變區域的主要標準。篩選好相應區域后,突變剛性更強的氨基酸殘基,作者通過這種增加了酶結構總體的剛性的方式進而提高了酶的熱穩定性。

Lin課題組通過使用AutoDock軟件進行分子對接以及Amber軟件進行分子動力學模擬等方法,篩選出了谷氨酸突變為丙氨酸的突變策略,分別提高了兩種酶的催化活力[38-39]。Lin課題組主要采用定位酶活性口袋附近氨基酸的策略,對底物結合以及進入活性口袋的過程進行優化,進而進行突變提高了酶活性。

Nikolaivits等[40]對多酚氧化酶進行系統性研究,對酶活性位點附近幾個關鍵氨基酸殘基進行突變,并最終篩選出其中一種有效突變體(G292N,即序列中292位的甘氨酸突變為天冬酰胺),這種突變體可以提高酶活。Lyu等[41]通過基因工程改造短乳桿菌提高谷氨酸脫羧酶的生產效率,和野生菌株相比,改造后的菌株生產效率有顯著提高。Nikolaivits和Lyu這兩個案例采用的策略和軟件和Lin課題組的方法類似。

表4 酶分子設計相關資源Table 4 Related resources for enzyme design

在以上這些例子中,分子對接、分子動力學模擬以及生物物理學等方法都可以綜合地應用于酶分子設計中。另外,分子對接和分子動力學模擬除了可以用于篩選突變位點之外,也常常用于分子作用機理的解釋。分子設計方法不僅僅局限于本文所論述的這些策略,也可以考慮其他不同的方法。例如Patil等采用利用超聲波對微生物培養過程中形成的細胞束進行疏松,促進了菌體生長,產酶量提高以及提高了酶活[42-43]。但是使用超聲波對酶機構的影響,目前還沒有明確的結論。另外,通過酶固定化的方法也是提高酶活力的方法之一[44]。例如,將酶固定在納米顆粒上可以減少酶解旋,通?？梢蕴岣呙阜€定性和催化性能。酶經過固定化處理后通常穩定性可以提高。例如,Aslani等[45]通過固定化胰蛋白酶提高其活性和穩定性。一些酶需要和金屬離子結合才能發揮其催化活性,例如漆酶是催化氧化反應的一種多銅離子氧化酶,漆酶通常使用氧分子和銅離子來啟動催化過程。因此,在一些酶分子設計中可能還需要考慮金屬離子的相互作用。

目前,開展酶分子設計的研究一般需要結合實驗驗證進行,所以相應的研究成果一般發表在實驗類的雜志或者一些綜合類的雜志中,例如這里所討論的一些案例發表在Journal of Biological Chemistry、Enzyme and Microbial Technology以及Applied Biochemistry and Biotechnology等雜志上。

7 總 結

隨著學術界對酶分子理解不斷加深,酶分子設計逐漸成為國內外不少課題組的研究內容之一。酶分子設計是在深入了解其序列、結構以及功能關系的基礎上進行的一種理性設計和改造方案,甚至可以設計出自然界中還未存在的新結構。酶的催化活性通常取決其活性口袋特點,通常而言在酶總體結構適合的范圍內其活性口袋越大則酶活力可能越高。在合理范圍內,擴大酶活性口袋通常有兩個方向,其一是設計更好的突變體;其二,改變酶所處的溶劑環境,不同的溶劑環境會導致酶活性口袋的打開或者關閉。

酶分子活性通常受其三維結構構象的顯著影響。因此,酶分子設計一般是在其結構基礎上進行的改造,這是一個系統性過程。酶分子是一個復雜的體系,不少酶分子具有多靶點、整體性等特點。酶分子行使其生物學功能過程中一般由多個部分協同發揮作用,重要和不重要部分只是相對而言的。同時,也可以通過優化酶分子所處的溶劑環境以及固定化等方法提高酶的穩定性和催化活力和穩定性。通過虛擬的氨基酸突變等技術設計更高催化活力、高穩定以及選著性的酶是一種通用的方法。近些年生物信息學技術的發展,使酶分子設計方法在國內外不少課題組都有一些基于計算方法的成功案例。隨著PDB以及AlphaFold等數據庫提供的蛋白質結構數量越來越多,基于結構的酶分子設計在未來將很可能會得到較為廣泛的應用。

簡而言之,酶分子是一種重要的生物分子,目前酶分子設計的主要方向有提高熱穩定性、酸堿穩定性、抗氧化性、提高酶的催化活力、提高催化底物專一性、耐非水溶劑環境以及減少副作用等。由于酶分子結構、功能以及所處溶劑環境的復雜性,特定的酶需要進行具體和詳細分析后才能更好地設計出新酶。隨著生物技術的不斷發展,酶分子在學術研究和工業生產中已經有越來越廣泛的應用。酶分子設計目的就是為蛋白質工程提供設計方案,使酶及其制劑產品更好地為生活和工業生產服務。因此,掌握酶和蛋白質的相應機理并進行合理的設計是科學研究與商業研發的一個重要方向。通常來講,酶分子設計是在其三維結構的基礎上進行結構-功能-溶劑環境-應用關系的研究。酶分子設計之后,一般通過實驗驗證后進一步修正和優化設計。