布魯氏菌耐藥性與耐藥機制研究進展

任 靜,黎圣洪

布魯氏菌是一種革蘭氏陰性嗜氧菌,屬兼性細胞內寄生菌,它引起的布魯氏菌病是一種人獸共患病,畜類布魯氏菌病主要癥狀為母畜流產、公畜睪丸炎,人類感染布魯氏菌主要表現為長期反復的波狀熱、乏力、多汗、肌肉和關節疼痛等。自1887年首次從死于“馬耳他熱”的英國士兵的脾臟中分離到布魯氏菌以來[1],經100多年的研究,共有12種布魯氏菌被發現[2]。目前布魯氏菌病仍是中國主要的公共衛生問題之一[3],根據我國疾病預防控制局(http://www.nhc.gov.cn)發布的數據顯示,2017-2021年中國人間布魯氏菌病的發病率分別是2.79/10萬、2.73/10萬、3.15/10萬、3.36/10萬、4.91/10萬,整體呈現上升趨勢,發病率的上升給我國公共衛生、畜牧業、社會經濟發展帶來負擔。人布魯氏菌病的一線治療方案是多西環素聯合利福平或鏈霉素,效果不理想或存在禁忌時,可采用多西環素與復方新諾明或妥布霉素聯合用藥,或喹諾酮類聯合利福平作為二線治療方案[4]。但隨著抗菌藥物的使用,布魯氏菌出現耐藥,給臨床治療帶來挑戰,因此了解其耐藥性和機制對改善患者預后極其重要。

分析2013-2022年有關動物源、人源布魯氏菌耐藥性研究的文獻及數據發現:動物源布魯氏菌監測的動物對象以牛、羊為主,極少數篇目未注明布魯氏菌種類[5],大多數篇目都是關于羊種、牛種布魯氏菌;人源布魯氏菌的種類絕大多數是羊種。本文就2013-2022年發表的關于牛羊源布魯氏菌(主要為羊、牛種)和人源布魯氏菌(主要為羊種)耐藥性與耐藥機制研究進展作一綜述。

1 不同來源的布魯氏菌耐藥性

1.1 來自牛羊的菌株 通過分析近10年發表的牛源、羊源布魯氏菌耐藥監測結果(表1)發現,全球多地牛羊源布魯氏菌耐藥現象都較為嚴重,南非甚至出現耐藥性強、耐藥譜廣的現象,對利福平、阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、紅霉素的耐藥率甚至達到100%,這可能和上述藥物在當地使用時間較長,應用范圍較廣有關。對多西環素、四環素的耐藥情況各地區有差異,埃及、中國新疆、伊朗德黑蘭的牛羊源布魯氏菌以及土耳其羊源布魯氏菌對四環素的耐藥率小于30%,中國新疆、伊朗德黑蘭、吉爾吉斯斯坦牛羊源布魯氏菌對多西環素的耐藥率小于30%,而南非牛羊源布魯氏菌對多西環素耐藥率大于70%,對四環素耐藥率大于30%,且南非、埃及、土耳其牛羊源布魯氏菌均存在多藥耐藥的情況。

表1 牛源、羊源布魯氏菌的耐藥性

Manafe等[5]收集南非地區牛、山羊、綿羊源的123株布魯氏菌進行耐藥分析,發現牛羊源布魯氏菌對利福平、阿莫西林、多西環素、四環素、青霉素G、頭孢克肟、紅霉素的耐藥趨勢大致相同,總體耐藥情況都比較嚴峻。對于復方新諾明、頭孢西丁牛源的耐藥水平明顯高于羊源。這種現象表明,同一地區不同種類動物宿主所分離得到的布魯氏菌藥物敏感性各不相同,可能是由于不同動物使用抗菌藥物種類和劑量不同所致。

Khan等[11]埃及的研究人員對收集自牛、羊的29株布魯氏菌進行了藥敏檢測,結果顯示羊種布魯氏菌(21株)環丙沙星、紅霉素、亞胺培南、利福平的耐藥率為76.2%、19%、76.2%、76.2%,而牛種布魯氏菌(8株)對環丙沙星、紅霉素、亞胺培南、利福平的耐藥率為25%、87.5%、25%、37.5%,提示同一地區不同種布魯氏菌的抗菌素耐藥率有顯著差異,該研究團隊在所有利福平耐藥株中均檢測出利福平抗性基因(rpoB)突變,在4株羊種布魯氏菌的環丙沙星耐藥株中檢測出gyrA和gyrB基因的喹諾酮耐藥區點突變。

1.2 來自臨床的菌株 在布魯氏菌病治療中,布魯氏菌耐藥性檢測具有重要意義,但由于具備操作布魯氏菌的三級生物安全實驗室單位少,所以布魯氏菌耐藥檢測開展少。1986年Jurica等[12]首次報告了多西環素、利福平雙聯治療羊種布魯氏菌患者期間出現利福平耐藥,該團隊從患者首次治療前的血培養中分離出的布魯氏菌對6種抗生素都敏感(利福平MIC=1.0 mg/L),使用雙聯抗感染6周后停藥。在停藥3個月后,患者再次出現關節痛癥狀,此次血培養分離出的布魯氏菌對利福平耐藥(MIC=64 mg/L),后用多西環素聯合奈替米星聯合治愈了該患者。

通過分析人源布魯氏菌的耐藥性(表2),對比牛羊源、人源布魯氏菌的耐藥性,發現后者耐藥性明顯減弱,對于抗菌藥物的耐藥率多小于30%。人源布魯氏菌對利福平的敏感性減弱是世界范圍普遍存在的問題,這與利福平作為人間布魯氏菌病的一線用藥廣泛運用有關,但對利福平的耐藥率各地差異明顯。我國玉溪、內蒙烏蘭察布、內蒙興安盟、伊朗地區人源布魯氏菌對利福平的耐藥率小于3%,而哈薩克斯坦人源布魯氏菌對利福平的耐藥率高達26.4%。

表2 人源布魯氏菌的耐藥性

我國人源布魯氏菌除發現存在對利福平耐藥的菌株外,還發現對復方新諾明耐藥的現象。劉志國等[19]另外對我國各地149株羊種布魯氏菌在體外對利福平和復方新諾明的敏感性進行了篩查,結果顯示有4株對利福平表現為中介敏感,而對復方新諾明的耐藥率高達25.5%(38/149)。另外,多篇來自內蒙古地區的研究提示,該地區人源羊種布魯氏菌對阿奇霉素的耐藥率達到100%[18-20],建議臨床上停止使用。

Irajian等[9]檢測伊朗德黑蘭人源布魯氏菌的耐藥情況,發現該地區人源布魯氏菌存在對四環素、慶大霉素、復方新諾明耐藥。而對伊朗馬哈丹、卡珊地區的人源布魯氏菌耐藥檢測卻未發現耐藥布魯氏菌株。提示同一國家不同地區人源布魯氏菌藥物敏感性各不相同。

這些布魯氏菌株抗藥性各不相同,可能是由于各國醫療衛生情況和各國抗菌藥物使用水平不同導致,但也有學者提出實驗方法的不同會導致實驗結果的差別,Johansen等[24]從1991-2016年在挪威各地收集到來自臨床的23株羊種布魯氏菌,采用微量肉湯稀釋法(microdilution method)的藥敏結果提示有17株對利福平的敏感性降低,6株對利福平耐藥,而采用梯度條帶法(gradient strip method)的藥敏結果則顯示只有4株對利福平的敏感性降低,其余19株均對利福平敏感。在對上述菌株的耐藥基因檢測中發現了利福平抗性基因(rpoB)的突變,但rpoB突變與體外藥敏試驗結果并不相符。波黑地區的學者對臨床的108株羊種布魯氏菌分別使用布魯氏肉湯、陽離子調節MH肉湯(加4%裂解馬血)、陽離子調節MH肉湯(加5%脫纖維棉羊血)培養后進行藥敏試驗,結果顯示使用布魯氏肉湯組91株(84.3%)對復方新諾明耐藥,而陽離子調節MH肉湯的兩組均無對復方新諾明耐藥,但大于90%的布魯氏菌在各個組別均對阿奇霉素耐藥[25]。不同實驗方法導致實驗結果的差異,應結合臨床用藥療效予以鑒別。不同區域菌株敏感性的數據對指導當地臨床治療更有實際意義,在臨床用藥中應予以考慮和重視。

2 布魯氏菌的耐藥機制研究現狀

2.1 利福平耐藥機制研究現狀 利福平屬于利福霉素類廣譜抗生素,它作用于細菌RNA聚合酶的β亞基,可抑制聚合酶活性,使細菌無法轉錄出完整的RNA而死亡。細菌對利福平的耐藥獲得主要通過:β亞基的編碼基因-rpoB基因突變導致β亞基對利福平的親和力降低、對藥物的修飾滅活、膜通過性改變、外排泵等方式使細菌耐藥[26]。對羊和牛種布魯氏菌的研究表明rpoB基因存在影響利福平抗性水平的高變位點(1560-1740位點)[27]。楊曉雯等[28]在利福平濃度逐漸增高的情況下通過對羊布魯氏菌進行連續傳代,獲得了對利福平具有高水平耐藥性的羊布魯氏菌耐藥菌株。他們的研究結果顯示耐藥菌株rpoB基因1606位點由C變為T,這與前人研究類似[27],該研究還發現利福平耐藥菌株中virB操縱子表達下調,virB操縱子編碼的virB1-12蛋白與細菌在細胞內復制和形成持續性感染有關[29],而耐藥株通過降低virB操縱子基因的表達來抵御利福平的作用。楊曉雯等[30]又進一步構建了virB基因缺失的羊布魯氏菌株,采用布魯氏菌肉湯培養基觀測不同利福平濃度下基因缺失株和親本株的生長特性。3 d后virB7-11基因缺失株的利福平MIC值高于親本株,而virB1-6、virB12基因缺失突變株MIC值與親本株無差異,進一步證實了virB7-11在羊布魯氏菌對利福平耐藥中起重要作用。

2.2 氟喹諾酮類耐藥機制研究現狀 氟喹諾酮類藥物主要通過抑制細菌DNA拓撲異構酶來干擾細菌DNA復制,從而起到抑制細菌增殖生長的作用。細菌DNA拓撲異構酶有I、II、III、IV四種,其中拓撲異構酶II又稱為DNA回旋酶。喹諾酮類藥物耐藥主要通過:DNA回旋酶和DNA拓撲異構酶IV突變、外排泵以及質粒介導的喹諾酮耐藥[31]。Turkmania等[32]通過體外實驗觀察到耐藥牛種、羊種布魯氏菌在加入多重耐藥泵抑制劑羰基氰化物間苯腙(CCCP)后,細胞內氟喹諾酮含量增加,推測布魯氏菌對氟喹諾酮耐藥有外排泵的參與。Turkmania等[33]還通過PCR技術對獲得的耐藥牛、羊種布魯氏菌株進行DNA回旋酶編碼基因gyrA和DNA拓撲異構酶IV編碼基因parC進行檢測,結果發現對左氧氟沙星耐藥的羊種布魯氏菌gyrA基因存在Asp(GAT)91→Asn(AAT)突變,對環丙沙星耐藥的羊種布魯氏菌gyrA基因存在Asp(GAT)91→Tyr(TAT)突變,對氧氟沙星耐藥的牛種布魯氏菌gyrA基因存在Ala(GCT)87→Val(GGT)突變,而在partC基因上未檢測到突變。Elisa等[34]在巨噬細胞模型中觀察羊種布魯氏菌對氟喹諾酮類藥物耐藥實驗過程中發現,羊種布魯氏菌出現對氟喹諾酮類藥物耐藥與gyrA位點發生突變有關,耐藥株gyrA的第260位點均發生C→T突變,導致Ala(GCT)87→Val(GTT)改變,但這些突變株與野生非突變株相比,感染新巨噬細胞的能力和喹諾酮類藥物再次暴露后在巨噬細胞內的生存能力無增強。

2.3 磺胺類耐藥機制研究現狀 磺胺類藥物主要通過與氨基苯甲酸(PABA)競爭二氫葉酸合成酶,阻止細菌二氫葉酸(FH2)合成進而阻止四氫葉酸(FH4)合成,使DNA前體物質嘌呤和嘧啶無法合成抑制細菌生長繁殖,細菌對磺胺類的耐藥性可通過:二氫葉酸合成酶和二氫葉酸還原酶的sul和dfrA基因突變[35]、二氫喋呤還原酶和二氫葉酸還原酶的folA和folP基因突變[36]、SmeVWX和SmeDEF外排泵的調節基因突變[37]產生。Johansen等[24]在23株布魯氏菌的耐藥基因檢測中發現與甲氧芐氨嘧啶耐藥相關基因folA和folP突變,但上述菌株的體外藥敏實驗對復方新諾明并不耐藥。

2.4 氨基糖苷類耐藥機制研究現狀 氨基糖苷類藥物經膜孔通道被動擴散穿過細菌細胞外膜,再經氧依賴行主動跨膜轉運系統進入細胞內,特異性與核糖體30s亞基16sRNA的高保守位點結合進而抑制細菌蛋白合成[38],現有的研究已經證明細菌對氨基糖苷類抗生素的耐藥機制主要包括氨基糖苷類修飾酶的修飾作用[39]、細菌靶位突變[40]和藥物的攝取減少[41]等。我國學者楊曉雯等[38]從喜馬拉雅旱獺體內分離出一株耐阿米卡星的牛種布魯氏菌(MIC≥512 mg/L),對其進行基因分析,結果發現該阿米卡星耐藥株具有編碼氨基糖苷3′-磷酸轉移酶的阿米卡星耐藥基因(aph(3′)-IIa),并通過構建質粒的方式推測出可能是通過T3家族轉座子從沙門氏菌獲得,該耐藥基因可編碼氨基糖苷類抗生素修飾酶,通過修飾酶對氨基糖苷類抗生素進行修飾,使其無法作用于細菌而產生耐藥性。

2.5 大環內酯類耐藥機制研究現狀 大環內酯類藥物主要通過抑制細菌蛋白合成,從而達到抗菌的目的[42]。細菌核糖體23S rRNA基因的單位點突變使大環內脂類抗菌藥物與核糖體親和性下降,從而產生耐藥性[43],劉志國等[19]對85株阿奇霉素耐藥的羊種布魯氏菌進行耐藥基因測序,結果發現所有耐藥菌株的23S rRNA基因的2 632位堿基出現T→C單位點突變,提示布魯氏菌23S rRNA轉肽酶中心的T/C點突變可能是一種羊種布魯氏菌對阿奇霉素耐藥的分子機制。

目前國內外對布魯氏菌耐藥機制的研究較少,尤其缺少布魯氏菌對β-內酰胺類、四環素類藥物耐藥機制的研究。

3 結 語

布魯氏菌的耐藥性、耐藥機制和耐藥基因攜帶情況是目前的研究熱點。中國布魯氏菌病發病率高,近年來也出現了關于利福平、復方新諾明等藥物耐藥菌株的報道。細菌耐藥監測是掌握細菌耐藥性的手段,是臨床合理選擇抗菌藥物的數據支持,但目前布魯氏菌耐藥監測覆蓋面不全,監測到的耐藥率僅反應參加監測的區域耐藥情況,應擴大監測覆蓋區域。利用基因檢測技術檢測標本中耐藥基因的變化,將更多布魯氏菌耐藥基因納入到現有基因組數據庫,有助于了解布魯氏菌耐藥基因在布魯氏菌病流行規律中的作用;另一方面,通過觀察患者體內布魯氏菌對特定藥物的耐藥基因突變,可了解國內不同區域耐藥菌株的流行特點及趨勢,對有效防治耐藥菌株具有重要意義。

利益沖突：無