多殺性巴氏桿菌分型技術及毒力因子研究進展

郭亞男，張正剛,2，馬 科，張久盤，王建東*

（1.寧夏農林科學院動物科學研究所，寧夏 銀川 750002；2.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏同心縣科技服務中心，寧夏 同心 751300）

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocid，P.multocida）由Louis Pasteur于1887年首次在禽霍亂病例中分離得到，命名為巴斯德氏菌。它主要存在于動物口腔、鼻咽和上呼吸道，能夠引起家畜和野生動物及人類感染[1]，1994年被分為3個亞種[2]，目前的分型方法主要有莢膜分型法、脂多糖分型法和MLST分型法。

P.multocida發病機制的分子基礎主要涉及莢膜、脂多糖（LPS）、鞭毛、粘附素、多殺性瘧原蟲毒素（PMT）和外膜蛋白等毒力因子[3]。毒力因子使細菌能夠在宿主體內繁殖，并且破壞或躲避宿主的防御系統。一些毒力因子可增強P.multocida在環境中的生存能力，在P.multocida中的毒力因子主要包括粘附、定植功能的相關蛋白質、鐵捕獲蛋白（ExbB、ExbD、TonB、HgbA、HgbB和Fur）、細胞外酶，例如神經氨酸酶（NanB和NanH）和超氧化物歧化酶（SodA、SodC和TbpA）、透明質酸酶（PmHAS）、毒素（ToxA）、脂多糖（LPS），莢膜和外膜蛋白（OmpA、OmpH、Oma87和PlpB）[4]。這些VF能夠促進宿主的定植和入侵，破壞宿主防御機制，損傷宿主組織，或刺激有害宿主炎癥反應。本文就多殺性巴氏桿菌的分型方法和毒力因子進行概述，以期為該病原的相關研究提供理論依據。

1 多殺性巴氏桿菌分型技術研究進展

1.1 多殺性巴氏桿菌莢膜分型

P.multocida可以根據莢膜（A、B、D、E和F）的組成分為不同血清型，可以根據表達的LPS抗原進一步分為16種血清型[5-6]，該分型系統涉及莢膜血清型A的hyaD-hyaC基因（參與透明質酸合成）、莢膜血清型D的dcbF基因（參與肝素合成）、莢膜血清型F的fcbD基因（參與軟骨素生成）以及莢膜血清型B和E的bcbD和ecbJ基因（均參與糖基轉移酶合成）[7]。有莢膜的P.multocida菌株比無莢膜的菌株更具毒性，能逃避宿主免疫識別并降低免疫細胞的吞噬功能[8]，B型和E型菌株在牛和水牛中引起出血性敗血癥（HS），而家禽禽霍亂是由A型和F型菌株引起的。A型和D型菌株可引起兔鼻炎，牛、羊和豬的肺炎[9]。自限性或慢性感染癥狀相對輕微，但許多上呼吸道和全身感染可在1～2 d內致命[10]，且具有高度傳播性，在野生動物和馴養的動物種群中均有大規模暴發報道。Confer AW等[11]的研究表明，從肺病變中分離出的P.multocida有61%和25%分別屬于莢膜A型和D型。

1.2 多殺性巴氏桿菌脂多糖分型

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也是重要的毒力因子，在對P.multocida LPS結構及其合成基因簇深入分析的基礎上，Harper等[5]發現可將P.multocida分為L1～L8共8個基因型，并建立了對應的特異性PCR分型方法；Heddleston等[13]將P.multocida分為1～16共16種脂多糖血清型。此外，P.multocida LPS是一種免疫顯性抗原，對細菌（殺傷細胞）疫苗刺激的同源保護至關重要。

1.3 多位點序列分型

針對P.multocida建立的MLST方案，最初設計用于對禽類分離株進行分類，之后國際研究界也一直使用這種方法對其他幾種宿主物種進行分型[13]。MLST是一種通過對管家基因的內部片段進行測序來表征細菌分離株的方法[14]，通常與其他基因型方法結合使用。Subaaharan等[15]報道MLST方法對病原體流行病學研究，在特異性、穩定性上更具優勢。

2 多殺性巴氏桿菌毒力因子研究進展

2.1 脂多糖

脂多糖（LPS）是P.multocida的主要免疫原性毒力因子之一，幾乎所有革蘭氏陰性菌的外膜主要由LPS構成[16]，因此LPS在細菌與環境之間的相互作用中起著至關重要的作用，并且與膜屏障功能、細菌毒力和宿主免疫密切相關。LPS包含3～4個區域：脂質A，作為膜錨定成分；內核，通常含有1～3個3-脫氧-d-甘露糖-辛酸-2-洛糖酸（Kdo）殘基和庚糖；外核，由多種糖組成，通常包括葡萄糖、半乳糖、半乳糖胺和葡萄糖胺；O-抗原（O-多糖），由高度可變且重復的寡糖單元組成[17]。脂質A是LPS的內毒性成分，強烈刺激先天性和適應性免疫反應。LPS的脂質A可通過能夠識別常見的病原體相關分子模式（PAMP）的Toll樣受體蛋白家族成員Toll樣受體4（TLR4）刺激先天性免疫系統細胞[18]。Rathinam等[19]的研究表明，P.multocida的LPS交叉保護性極弱。Periasamy等[20]的研究表明，P.multocida的LPS能夠刺激牛粒細胞增殖，并促進炎性因子表達。

2.2 莢膜多糖

莢膜多糖（CPS）是高分子量的細胞表面多糖，是許多致病菌的重要毒力因子，通過增強細菌的毒性而發揮致病性，影響防御細胞和細菌間的平衡[21]。莢膜具有保護細菌抵抗宿主吞噬細胞的吞噬和消化的作用，在惡劣環境條件下阻斷大多數噬菌體感染[22]。Boyce等[8]的研究表明，P.multocida CPS可以逃避宿主吞噬細胞的吞噬或攝取，通過向小鼠腹腔內注射菌株進行毒力測試，毒力激發后有莢膜的細菌能夠抵抗吞噬細胞的攝取，從而大量繁殖，無莢膜的細菌很容易被小鼠腹膜巨噬細胞吸收，能夠從血液、脾臟和肝臟中有效清除。在革蘭氏陰性細菌中，大多數CPS由Wzy依賴性或ATP結合（ABC）轉運蛋白依賴途徑組成[23]。CPS可保護菌體表面不被補體和抗體影響，從而防止菌體被吞噬和滅活[24]，CPS血清A組由透明質酸組成，血清D組是易受降解硫酸軟骨素A和C以及肝素酶影響的多糖，血清F組是類似軟骨素的多糖，血清型B型CPS主要由甘露糖組成，但也含有阿拉伯糖和半乳糖，血清型E菌株的CPS組成尚未確定[25]。

2.3 鐵調節和鐵捕獲蛋白

鐵是P.multocida等致病菌最重要的營養素之一，宿主中游離鐵的含量不多[26-27]。P.multocida中的鐵可能對其存活和發病機制起重要作用，與鐵相關基因的表達調節通常由革蘭氏陰性細菌中的毛皮基因控制[28]。當鐵含量豐富時，毛皮與亞鐵相互作用并與保守啟動子區域結合抑制基因轉錄[29]。鐵載體是與蛋白質載體競爭、與三價鐵結合的鐵配體，而一些外膜蛋白也可以從宿主鐵結合分子（如乳鐵蛋白、血紅素、鐵蛋白、血紅蛋白和轉鐵蛋白）中獲得鐵[30-31]。HgbA和HgbB是2種蛋白質，由P.multocida直接從血紅素成分中獲取鐵。據報道，HgbA基因在分離株中分布得更規律，而HgbB基因患病率因宿主來源和動物疾病狀況而異。據報道，另一種稱為轉鐵蛋白結合蛋白A（TbpA），在牛中作為流行病學標志物，在鐵的運輸中起著至關重要的作用[32]。P.multocida物種中多個鐵采集系統的存在可能解釋了其在某些條件下利用一組特定的基因在鐵有限條件下獲取鐵的能力。DNA微陣列研究了P.multocida在無鐵培養基中添加不同鐵源后，對捕獲不同鐵源的基因表達模式。

2.4 外膜蛋白

NanB、NanH、ompH、plpB和psl基因的產物是參與營養獲取和運輸的外膜蛋白（OMP）。革蘭氏陰性菌的OMP在引發疾病過程中起著至關重要的作用。它們參與生產性感染所需的營養攝取、分子進出細胞的運輸、宿主的定植和入侵、宿主免疫反應的逃避、宿主組織的損傷等過程[33]。多殺性巴氏桿菌OmpA蛋白可以與C4b蛋白結合，具有免疫逃避作用[34]；OmpH蛋白約占莢膜A型多殺性巴氏桿菌莢膜總蛋白的27%，敲除OmpH基因后，其莢膜含量也顯著降低，表明該蛋白與莢膜形成有關[35-36]。此外，這些OMP是良好的免疫原，可用作疫苗成分為機體提供保護[37]。因此，分離株之間的OMP變異可以通過評估其菌株間異質性來幫助流行病學調查，并可用于評估種內多樣性[38]。

2.5 菌毛和粘附素

細菌粘附素是一種重要的細菌毒力因子，是細菌定植的先決條件之一，它對靶分子具有精確的選擇性，并以鎖定和鑰匙模式識別分子基序[39]。粘附素是一類表面結合的蛋白質，可促進細菌附著到宿主組織。它們根據蛋白質中外膜錨的缺失或存在分別被分類為菌毛性或非菌毛性。在不同類型的粘附素中，細菌凝集素是最常見的，能夠識別和結合特定的糖分子[40]。粘附素的粘附性是通過識別宿主細胞表面呈現的特定碳水化合物、蛋白質或脂質來實現的。除了粘附外，粘附素還通過毒力基因的上調促進毒素傳遞，從而導致宿主入侵。此外，這種相互作用可引發宿主分泌細胞因子或噬菌素，從而加劇疾病[41]。

2.6 超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（SOD）是在1938前發現的[42]，SOD是一種金屬酶，形成一線抗氧化防御機制，是解毒超氧自由基的主要酶組分之一[43]，絕大多數生活在氧氣下的生物都至少表達一種SOD。超氧化物歧化酶sodA和sodC在氧化應激反應和抗氧化應激中很重要[44]。含有sodA基因編碼的蛋白可以和錳的超氧化物歧化酶結合，清除吞噬細胞中的超氧化物及中和超氧化物中的O2-和NO兩種自由基[45]。

2.7 唾液酸和透明質酸酶

透明質酸（HA）是葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺的線性重復，存在于各種動物部位，即雞冠、眼睛、臍帶、皮膚和軟骨中[46]。透明質酸是高分子量分子，具有粘彈性能、高生物相容性，可以保持彈性和水分，減少炎癥，潤滑身體各個部位。此外，低分子量HA參與傷口愈合、血管生成、細胞分化、腫瘤細胞遷移和細胞凋亡[47-48]。一些細菌，包括鏈球菌屬和P.multocida，會產生透明質酸作為其膠囊和黏液的組成部分[49]，唾液酸酶蛋白NanB和NanH可裂解宿主膜中的唾液酸，用作營養物質，并修飾細胞包膜逃避宿主免疫系統[5]。

3 結語與展望

多殺性巴氏桿菌的分型主要有3種，根據粉劑莢膜（A、B、D、E和F）的組成分為不同血清型。國外主要采用MLST分型方法，而且具有相應的數據庫進行數據更新，更有利于病原追溯和物種進化分析，在研究多殺性巴氏桿菌流行病學方面具有優勢。雖然研究學者已從多殺性巴氏桿菌的多方面開展了深入研究，但是畜禽養殖業疫苗缺乏的難題尚未解決。因此，研究學者可以將多殺性巴氏桿菌相關研究與該病原的疫苗研制和診斷試劑研發相結合，促進畜禽產業高質量發展。