高效聚合抗赤霉病基因育種技術體系的研制

李式昭,鄧清燕,涂 洋,伍 玲

(四川省農業科學院作物研究所/農業農村部西南地區小麥生物學與遺傳育種重點實驗室/糧油作物綠色種質創新與遺傳改良四川省重點實驗室/農業農村部天府種業創新重點實驗室(部省共建),成都 610066)

由禾谷鐮刀菌復合種(Fusariumgraminearumcomplex)引起的小麥赤霉病(Fusariumheadblight, FHB)是一種世界性真菌病害,在我國廣泛分布于溫暖潮濕或半潮濕麥區[1]。21世紀以來,隨著全球性氣候變暖,耕作制度的改變如麥稻、麥玉輪作和秸稈還田等因素的影響[2],赤霉病呈蔓延擴展趨勢,頻繁流行,不僅造成小麥大面積減產,還大幅度降低籽粒品質,嚴重威脅我國小麥生產安全[3]。與此同時,致病菌還產生雪腐鐮孢菌烯醇(Nivalenol,NIV)、脫氧雪腐鐮孢菌烯醇(deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)等毒素污染小麥籽粒,進一步威脅人、畜健康[4]。因此,挖掘抗病基因,解析抗病作用機理,改良品種赤霉病抗性就成為了防治小麥赤霉病危害的有效途徑[5]。

小麥對赤霉病的抗性有五種類型,包括抗初始侵入(Type Ⅰ)、抗單穗病癥擴展(Type Ⅱ)、抗毒素積累(Type Ⅲ)、籽粒對赤霉病的抗性(Type Ⅳ)和耐病性(Type Ⅴ)[6],屬數量性狀,受多基因控制。目前已定位的小麥赤霉病抗病QTL數量高達數百個,廣泛分布于小麥的21條染色體上[7-8],正式命名的主效抗病基因有7個,其中Fhb4和Fhb5屬抗侵染類型,Fhb1、Fhb2、Fhb3、Fhb6和Fhb7則屬抗擴展類型。Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5源自普通小麥蘇麥3號及望水白,Fhb3、Fhb6和Fhb7則源自小麥近緣屬種中的大賴草、披堿草及長穗偃麥草[9-15]。7個主效抗赤霉病基因中,Fhb1是抗性最強且最穩定的抗病基因,對我國抗赤霉病育種有著重要意義[16]。

我國長江中下游麥區、東北春麥區和南部沿海省份等雨量充沛地區一直是赤霉病常發和重發區域。近年來,西南麥區受耕作制度改變及小麥花期暖濕陰雨氣候等影響,赤霉病也開始呈現逐年加重的趨勢。由于西南麥區屬赤霉病偶發病區,有針對性的抗赤霉病育種研究還較少,不僅缺乏抗赤霉病育種資源材料,本地育成品種的赤霉病抗性也普遍較差[17]。因此,建立高效聚合抗赤霉病基因的育種技術體系,快速選育適合當地環境的抗赤霉病小麥新品種就成為當前西南麥區的迫切需求。本文使用改良農藝性狀后的抗赤霉病種質與西南麥區主栽品種雜交或復交,在低世代分離群體進行抗赤霉病性彌霧接種鑒定,高世代群體采用單花滴注法接種鑒定,并利用抗赤霉病基因標記進行分子標記輔助育種,以提高西南麥區小麥抗赤霉病育種效率。該技術體系規范了育種過程中赤霉病抗性鑒定及分子標記檢測的世代和方法,有效降低了育種成本,結合夏繁加代技術,有望準確、高效選育出適應西南麥區地理環境且聚合已知抗赤霉病基因的小麥新品種。

1 育種目標

通過高效聚合有效的赤霉病抗性基因,實現赤霉病抗性和本地品種(系)豐產性的結合,育成綜合性狀優良的抗赤霉病小麥新品種。對低世代群體,要側重于抗性和個體豐產性的選擇;對高世代群體,要側重于抗性、產量性狀和群體協調性的結合,并利用抗赤霉病基因標記進行分子標記篩選。

2 育種技術體系流程

2.1 親本選擇

西南麥區缺乏抗赤霉病育種資源材料,而目前已有的抗病品種如蘇麥3號、望水白、Frontana等,往往伴隨不抗條銹病、產量低、穗密度稀、植株偏高等不良農藝性狀,難以在育種中直接應用。因此,要使用農藝性狀改良后的抗赤霉病種質與西南麥區豐產品種(系)雜交或復交,才能有效提高小麥抗赤霉病育種效率?，F階段,南京農業大學已培育出抗赤霉病改良新品系如NMAS07(Fhb1+Fhb4+Fhb5)、NMAS22(Fhb1+Fhb2+Fhb4+Fhb5)等,長江中下游麥區也新審定一批抗赤霉病品種如生選6號、寧麥20、揚麥33等,這類品種(系)赤霉病抗性好且穩定,農藝性狀相對優良,可作為抗赤霉病育種親本加以利用。

2.2 低世代群體田間選擇及抗赤性彌霧鑒定

對低世代(如單交為F2～F4代,復交為BC1F2～BC1F4代)分離群體,應盡量種植為小區,行長3～6m,行距26.7cm,每小區3～6行,以方便噴霧及后期蓋膜保濕。赤霉病接種:采用小區彌霧接種法進行鑒定。在鑒定小區大約10%麥穗揚花(揚花初期)時,利用大型機械噴霧設施或噴壺,向小區內小麥穗部均勻噴灑赤霉病菌分生孢子懸浮液,對育種材料進行大規?？钩嘈詮涭F接種鑒定。注意開始接種前,應將培養好的分生孢子懸浮液濃度調整至1×104個孢子/mL,并加入1/1000比例的Tween-20。噴霧效果以全區麥穗基本形成霧珠為宜,在彌霧接種后若天氣干燥應對鑒定小區進行蓋膜保濕處理,以確保分生孢子充分萌發并發病,避免接種失敗。

彌霧接種于鑒定小區處于乳熟中后期進行抗性調查,抗性評價標準參考《小麥品種抗赤霉病性田間鑒定技術規程》(DB51/T 1680-2013),根據發病麥穗的平均病害嚴重度和小區發病普遍率綜合進行抗性評價。0級為無發病小穗;1級為零星小穗發病,發病小穗占全穗的5%以下;2級為發病小穗占全穗的5%～24%;3級為發病小穗占全穗的25%～50%;4級為發病小穗占全穗的50%以上;為節約鑒定時間,小區發病普遍率可目測估計。評價標準:平均嚴重度0級表示免疫(I);1級表示高抗(HR);2級或3～4級且發病普遍率≤20%表示中抗(MR);3級且發病普遍率>20%表示中感(MS);4級且發病普遍率>20%表示高感(HS)。

在低世代群體,田間綜合選擇農藝性狀好,同時抗條銹病和赤霉病的單穗混收混播。至F4代或BC1F4代選種后,得到的F5代或BC1F5代種子單穗單收,進入高世代群體篩選。

2.3 分子標記輔助選擇

對F5代或BC1F5代單穗種子,每穗取4粒采用SDS法[18]提取基因組DNA。采用與赤霉病抗性基因Fhb1、Fhb2、Fhb4和Fhb5[19]緊密相關的8個分子標記(表1)對單穗材料進行檢測,均以聚合赤霉病抗性基因的川麥64近等基因系(CM64Fhb1+2+4+5)為陽性對照。

表1 小麥赤霉病抗性基因相應分子標記信息

PCR擴增反應體系為15μL,包含20ng DNA模板,上下游引物各0.5μmol/L,TaqPCR Mix預混液(2 ×,含藍染料)。PCR擴增程序:94℃預變性3min;94℃變性 30s,52～61℃退火30s,72℃延伸40s,共36個循環;72℃延伸5min,最后4℃保存(程序中退火溫度因引物不同而異)。PCR擴增產物通過1.5%(w/v)瓊脂糖或8%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分析。

含有抗赤霉病基因的單穗應優先保留,特別是含有多個抗赤霉病基因的單穗更應重點關注,入選單穗按穗行進入下一代田間種植。若時間緊迫,也可優先對抗赤霉病Fhb1基因[16]進行檢測。

2.4 高世代群體田間選擇及抗赤性單花鑒定

對高世代(如單交為F5～F6代,復交為BC1F5～BC1F6代)群體,將經分子標記輔助選擇后入選的單穗種子種植為穗行,行長1.8m,行距26.7cm。赤霉病接種:采用小麥穗部單花滴注接種法進行鑒定。在待鑒定小麥穗行大約10%麥穗揚花(揚花初期)時,選擇不同單株的主莖穗,剪去部分麥芒以區別其余麥穗,隨后用微量移液器將10μL稀釋好的赤霉病菌分生孢子懸浮液(濃度1×106個孢子/mL)注射至麥穗中上部的一個小花內(為方便接種,可將待注射小穗剪去1/3)。每個穗行接種10～15個穗子,接種后用透明塑料薄膜將整個麥穗套住保濕,并注意及時掛牌記載接種日期,保濕72h后去掉塑料袋,之后根據空氣濕度情況定期進行噴霧保濕,以保證充分發病。

單花滴注鑒定于各材料接種后25～30d(根據氣候每年時間有所差別)進行抗性調查,抗性評價標準參考《小麥抗赤霉病評價技術規范》(NY/T 1443.4-2007)和《小麥區域試驗品種抗赤霉病鑒定技術規程》(NY/T 2954-2016),根據接種麥穗的平均病害嚴重度進行抗性評價。0級為接種小穗無可見發病病狀;1級為僅接種小穗發病或相鄰的個別小穗發病,病斑不擴展到穗軸;2級為穗軸發病,發病小穗占全穗的1/4以下;3級為穗軸發病,發病小穗占全穗的1/4～1/2;4級為穗軸發病,發病小穗占全穗的1/2以上。以接種的10～15個麥穗赤霉病嚴重度的平均值作為平均病害嚴重度,評價標準:=0表示免疫(I);0<<2.0表示抗病(R);2.0≤<3.0表示中抗(MR);3.0≤<3.5表示中感(MS);≥3.5表示高感(HS)。

在高世代群體,田間綜合選擇農藝性狀好且基本穩定,群體協調性好,株高適中,穗層整齊,褪色落黃好,且同時抗條銹病和赤霉病的穗子單穗單收,繼續播種為穗行。至F6代或BC1F6代穗行選擇后,得到的F7代或BC1F7代種子混收進入品系鑒定試驗。

2.5 品系鑒定

對已穩定的高世代(如單交為F7代,復交為BC1F7代)群體,種植為小區,小區面積6.67m2,參照《農作物品種(小麥)區域試驗技術規程》(NY/T 1301-2007)對入選品系進行農藝性狀和抗性調查,重點考察產量三因素和條銹病、赤霉病抗性,擇優升入多點品比試驗直至推薦參加正式區域試驗。

需要注意的是,以上世代選擇和鑒定操作應根據具體育種情況為準,若材料穩定很快可提前進入高世代選擇,若持續分離則應增加低世代選擇的代數和時間。

3 育種實例

3.1 抗赤霉病新材料川1147選育流程

川1147系譜為:17139/NMAS07,其中母本17139(系譜(CM107//CM107/Yr15)F4/川農16)系課題組自育品系,表現豐產性好,高抗條銹病;父本NMAS07引自南京農業大學,含有Fhb1、Fhb4、Fhb5 3個抗赤霉病基因。

按上述高效聚合抗赤霉病基因育種技術體系流程,以17139為母本,NMAS07為父本配置雜交組合,馬爾康夏繁F1代,于F2～F4代連續3代進行大規?？钩嘈詮涭F鑒定,獲得的F5代種子(每穗4粒)經提取DNA后進行分子標記篩選,選擇含有抗赤霉病基因Fhb1的單穗繼續種植為穗行,于F5～F6代連續2代進行抗赤性單花滴注鑒定,獲得的F7代種子混收進入品系鑒定試驗,表現農藝性狀好,遺傳穩定,性狀整齊一致,兼抗條銹病和赤霉病,命名為川1147。

3.2 抗赤霉病新材料川782選育流程

川782系譜為:17140/生選6號//川16316,首先利用17140與生選6號進行雜交,其中17140(系譜(CM107//CM107/Yr15)F4/川農16)系課題組自育品系,表現豐產性好,抗條銹病;生選6號引自江蘇省農業科學院農業生物技術研究所,經國審抗赤霉病。由于F1代組合優勢明顯但穗子偏小,將F1再次與大穗大粒種質川16316(系譜98-1231//貴農21/生核3295)配置復交組合,馬爾康夏繁BC1F1代。

同樣按上述流程,BC1F2～BC1F4代連續3代進行大規?？钩嘈詮涭F鑒定,經分子標記篩選后BC1F5～BC1F6代連續2代進行抗赤性單花滴注鑒定,獲得的BC1F7代種子混收進入品系鑒定試驗,表現農藝性狀好,遺傳穩定,性狀整齊一致,兼抗條銹病和赤霉病,命名為“川782”。

4 結語

由于機械化易操作,目前西南麥區小麥生產的經營主體已逐步轉變為農業種植大戶,小麥生產出現播期延長、花期集中、品種多樣性下降的特點。而隨著全球氣候變暖和耕作制度的改變,西南麥區赤霉病流行風險呈逐年增加趨勢,若發生赤霉病爆發

圖1 抗赤霉病小麥新品系川1147和川782選育流程

流行,將比以往造成更加嚴重的產量損失和經濟損失,因此,培育并推廣抗病新品種已成為西南麥區防治小麥赤霉病的關鍵。本文建立了高效聚合抗赤霉病基因的育種技術體系,在低世代分離群體進行抗赤霉病性彌霧接種鑒定,高世代群體采用單花滴注法接種鑒定,并利用抗赤霉病基因標記進行分子標記輔助育種。該技術體系發揮了從低代起即可有效對農藝性狀和抗病性同時展開篩選的優勢,且結合分子標記篩選可以大大降低育種成本,并能有效防止選擇過程中抗病基因的丟失,提高抗赤霉病育種效率,有望準確、高效選育出適應西南麥區地理環境且聚合已知抗赤霉病基因的小麥新品種。