基于響應面法和模糊數學感官評價法優化油茶籽粕醬油釀造工藝

劉曉媛，王雪菲，朱 靜，尤書會，姜興旭*

（信陽農林學院 食品科學與工程學院，河南 信陽 464000）

傳統醬油是以大豆或者脫脂豆粕為主料，經微生物發酵制備而成的，其成分復雜，含有多種氨基酸、糖類、有機酸等[1]。醬油根據發酵工藝可分為低鹽固態發酵（可溶性無鹽固形物10～20 g/100 mL）、高鹽稀態發酵（可溶性無鹽固形物8～15 g/100 mL）和高鹽恒溫發酵3種[2-3]。其中低鹽固態發酵工藝是我國釀造醬油的主要工藝，占全國醬油產量的80%左右[4]，但由于該法發酵時間短，所釀醬油的風味較單一[5-6]。而這一缺陷可通過豐富釀造原料種類來彌補，如牡丹籽粕醬油[7]、花生醬油[8]等。油茶籽粕作為油料加工副產物，每年產量近2 200萬t。其蛋白質占比約10%～20%，且氨基酸組成豐富，是潛在的優質植物蛋白資源[9-10]。油茶籽粕直接丟棄不僅是種資源浪費，還會污染環境。但因其含有大量辛辣、刺激的茶皂素，不易于二次加工[11]。目前我國對油茶籽粕的研究主要集中在功能成分提取、分離等方面[12-13]。本研究以油茶籽粕和大豆作為主要原料釀造油茶籽粕醬油，采用響應面法和模糊數學感官評價法，優化低鹽固態法制備油茶籽粕醬油的釀造工藝，為油茶籽粕的精深加工提供新思路，同時也為推進低鹽固態法釀造油茶籽粕醬油的工業化生產進程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆：哈爾濱團茂食品有限公司；油茶籽粕：河南省信陽市光山縣槐店鄉司馬光油茶園；米曲霉（Aspergillus oryzae）滬釀3.042：久微食品科技（上海）有限公司；面粉：五得利面粉集團有限公司。鄰苯二甲酸氫鉀（分析純）：北京化工廠；甲醛、氫氧化鈉、酚酞、氯化鈉、鉻酸鉀、硝酸銀（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

PE-28型pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；VYJG-99200鼓風干燥箱：杭州億捷科技有限公司；SPX-150-BS-II生化培養箱：上?？等A生化儀器制造有限公司；FA2104分析電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；C22-L2E電磁爐：杭州九陽生活電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 油茶籽粕醬油釀造工藝流程及操作要點

大豆潤水、油茶籽粕預處理→蒸煮制曲→成曲加鹽水→入罐發酵→成熟醬醅→浸提醬油→加熱滅菌→油茶籽粕醬油

操作要點：

大豆潤水：加黃豆體積的1.2倍清水浸泡3 h。

油茶籽粕預處理：油茶籽粕經干燥和粉碎后過60目篩，向油茶籽粕粉末中加入體積分數85%的乙醇浸提3 h去除茶皂素[14]。

蒸煮制曲：將大豆、油茶籽粕粉按比例混勻，蒸至無硬心，室溫冷卻至35 ℃后，以曲料質量為基準拌入20%的面粉和0.3%的米曲霉，33 ℃恒溫培養36 h[15]。

入罐發酵：將與鹽水混勻的成曲放入罐中，紗布封口，45 ℃恒溫發酵14 d得到成熟醬醅。

浸提醬油、滅菌：成熟醬醅第一次加沸水（沸水量為曲質量的1.5倍）浸提，65 ℃保溫20 h，過濾得到濾渣和濾液，濾渣需二次加沸水（沸水量為曲質量的一半）浸提，65 ℃保溫6 h[16]，過濾。合并兩次濾液，煮沸滅菌，即得油茶籽粕醬油。

1.3.2 油茶籽粕醬油釀造工藝優化

（1）單因素試驗

固定油茶籽粕醬油制備基本工藝條件：以100 g黃豆質量為基準，油茶籽粕添加量50%，鹽水質量分數15%，鹽水添加量85%，發酵溫度45 ℃。分別探究油茶籽粕添加量（30%、40%、50%、60%、70%），鹽水質量分數（11%、13%、15%、17%、19%），鹽水添加量（65%、75%、85%、95%、105%），發酵時間（12 d、14 d、16 d、18 d、20 d）對成品感官評分、氨基酸態氮、總酸和無鹽固形物的影響。

（2）響應面試驗

根據Box-Benhnken中心組合設計原則，在單因素試驗的基礎上，固定發酵時間為14 d，以油茶籽粕添加量（A）、鹽水質量分數（B）、鹽水添加量（C）為自變量，以感官評分（Y1）和氨基酸態氮（Y2）為響應值，進行3因素3水平的響應面試驗分析，Box-Benhnken試驗因素與水平見表1。

表1 釀造工藝優化Box-Benhnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experiments for brewing technology optimization

1.3.3 分析檢測

氨基酸態氮測定：參照國家標準GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》；總酸、可溶性無鹽固形物測定：參照國家標準GB 18186—2000《釀造醬油》。

1.3.4 油茶籽粕醬油模糊數學感官評定法

隨機選取10名有一定品鑒能力的食品專業學生，從色澤、氣味、滋味和組織狀態四個方面對油茶籽粕醬油進行感官評價，感官評分標準制定參考國標GB/T 18186—2000《釀造醬油》，滿分100分，具體見表2。

表2 油茶籽粕醬油感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of camellia seed meal soy sauce

1.3.5 模糊數學評價的建立

根據油茶籽粕醬油感官評價標準，對不同發酵條件下的油茶籽粕醬油的感官指標進行模糊數學綜合評價，并建立數學模型。

（1）對象集、因素集、評語集與權重集的建立

對象集U={u1，u2，u3，u4，u5，u6，u7，u8，u9，…uj…，u37}，u1～u37代表進行感官評價的油茶籽粕醬油樣品，j=1，2，3，4，5，6，7，8，9，……，37。

因素集R={V1，V2，V3，V4}，V1～V4依次代表油茶籽粕醬油的4個評價因素。即R={氣味，色澤，滋味，組織狀態}。

評語集B={b1，b2，b3，b4}，b1～b4依次代表優、良、中、差4個等級評判結果，對應的分值是90，80，70和60。即B={優，良，中，差}={90，80，70，60}。

權重集X={x1，x2，x3，x4}，x1～x4代表權重，使用強制決定法[17]設置權重X={0.3，0.2，0.3，0.2}。

（2）模糊矩陣的建立及評價結果的確定

選取10名有一定品鑒能力的食品專業學生，從色澤、氣味、滋味和組織狀態四個方面對不同發酵條件下油茶籽粕醬油進行感官綜合評價，評價之后統計各個因素在各個等級中的票數，根據所得票數結果得到油茶籽粕醬油的感官評價模糊關系矩陣Rj。

其中j=1，2，3，4，5，…37為樣品的編號，每一行都代表每一個的質量因素的評價數據結果。然后依照油茶籽粕醬油模糊數學評價模型Tj=X×Rj（其中T評價集，X為權重系數，R為模糊矩陣）對第j號樣品的感官評分進行計算。

1.3.6 數據處理

每組試驗重復3次，結果取平均值；采用Microsoft Excel 2019，SPSS 21.0軟件，Origin 9.0進行數據處理分析與作圖。

2 結果與分析

2.1 釀造工藝優化單因素試驗

2.1.1 油茶籽粕添加量對油茶籽粕醬油品質的影響

不同油茶籽粕添加量下，茶籽粕醬油的感官評分結果見表3。將表3中的每個醬油樣品質量要素中每個級別相對應的品評人數，除以整個品評小組人數，即總的參與品評人數，可得到每一組品評結果的模糊矩陣。舉例來說，選用表3中的油茶籽粕添加量30%為樣品，氣味評價結果有7人為優，1人為良，1人為中，1人為差。則氣味R=（0.4，0.3，0.3，0）；色澤R=（0.4，0.3，0.2，0.1）；滋味R=（0.5，0.3，0.2，0）；組織狀態R=（0.4，0.3，0.2，0.1），由此可得到矩陣R1如下：

表3 不同油茶籽粕添加量下油茶籽粕醬油的感官評價Table 3 Sensory evaluation of camellia seed meal soy sauce with different addition of camellia seed meal

表4 不同鹽水質量分數下油茶籽粕醬油的感官評價Table 4 Sensory evaluation of camellia seed meal soy sauce under different brine mass fraction

表5 不同鹽水添加量下油茶籽粕醬油的感官評價Table 5 Sensory evaluation of camellia seed meal soy sauce under different brine addition

表6 不同發酵時間下油茶籽粕醬油的感官評價Table 6 Sensory evaluation of camellia seed meal soy sauce under different fermentation time

依照油茶籽粕醬油模糊數學評價模型Tj=X×Rj對第j號樣品的感官評分進行計算，感官綜合評定的結果如下：

T1=X×R1={90，80，70，60}×（0.43，0.30，0.23，0.04）=81.20分。同理可計算出其余單因素及響應面優化試驗的模糊綜合感官得分。

由圖1可知，隨著油茶籽粕添加量的增加，成品醬油的氨基酸態氮上升，總酸先減后增，感官評分和可溶性無鹽固形物則先增后降。由于原料內的蛋白質、淀粉、有機酸等經微生物酵解[18]后，可產生大量具備呈味特性的氨基酸[19]、有機酸及還原糖[20]等，故隨著油茶籽粕添加量在30%～40%范圍內增加，油茶籽粕醬油的氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物含量和感官評分均呈上升趨勢，總酸則略有下降；在油茶籽粕添加量為40%時，感官評分最高（83.2分），氨基酸態氮和可溶性無鹽固性物分別為0.36 g/100 mL和13.1 g/100 mL；當油茶籽粕添加量＞40%之后，由于發酵周期內的米曲霉分泌蛋白酶可持續分解原料內的蛋白質，致使油茶籽粕醬油的氨基酸態氮上升。油茶籽粕與大豆（蛋白質約為40%～50%，粗多糖約為25%）相比[21]，蛋白質低（10%～20%），粗多糖含量高（40%）[22]，故當油茶籽粕添加量＞50%之后，米曲霉等微生物更傾向于分解結構較簡單的多糖類物質而產酸、產酶[23]，致使所制醬油的氨基酸態氮增加趨勢變緩的同時，總酸卻急劇增加，可溶性無鹽固形物及感官評分急劇下降。因此，選擇油茶籽粕最適添加量為40%。

圖1 油茶籽粕添加量對油茶籽粕醬油品質的影響Fig.1 Effect of camellia seed addition on the quality of camellia seed meal soy sauce

2.1.2 鹽水質量分數對油茶籽粕醬油品質的影響

適宜質量分數的鹽水可有效抑制發酵過程中腐敗微生物的生長，促進分解蛋白質和產酶米曲霉的生長[24]。由圖2可知，隨著鹽水質量分數在11%～15%范圍內的增加，氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物和感官評分呈現先升后降趨勢，總酸含量呈現則先降后升趨勢。當鹽水質量分數為11%～15%時，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物隨之增高，總酸有所下降；當鹽水質量分數為15%時，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物最高，分別為82.30分、0.53 g/100 mL、11.50 g/100 mL；當鹽水質量分數＞15%之后，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物隨之下降，總酸有所增高。高濃度鹽水（鹽水質量分數＞15%）可通過抑制米曲霉生長速度和蛋白酶活力，降低成品醬油的氨基酸態氮和可溶性無鹽固形物含量；同時為耐鹽微生物的生長提供良好的生活環境，促使醬醪內風味物質形成和有機酸的快速積累，但最終形成的酸性環境則會進一步抑制米曲霉生長和蛋白酶活力[25]，導致決定醬油風味的氨基酸態氮含量下降[26]。因此，最適鹽水質量分數為15%。

圖2 鹽水質量分數對油茶籽粕醬油品質的影響Fig.2 Effect of brine mass fraction on the quality of camellia seed meal soy sauce

2.1.3 鹽水添加量對油茶籽粕醬油品質的影響

發酵期間的鹽水添加量是影響米曲霉生長和產酶的關鍵因素之一[27]，由于低鹽環境下（鹽水質量分數15%，鹽水添加量65%）的醬醅易受腐敗微生物和病原體的污染而致使有機酸大量積累，進而抑制米曲霉的生產代謝和蛋白酶活性[28]。由圖3可知，隨著鹽水添加量在65%～105%范圍內的增加，油茶籽粕醬油的氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物和感官評分均先升后降，總酸則呈下降趨勢。當鹽水添加量為65%～95%時，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物隨之增高，總酸有所下降；當鹽水添加為95%時，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物最高，分別為82.80 分、0.62 g/100 mL、13.20 g/100 mL；當鹽水添加量＞95%之后，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物、總酸隨之下降。因此，最適鹽水添加量為95%。

圖3 鹽水添加量對醬油油茶籽粕品質的影響Fig.3 Effect of brine addition on the quality of soy sauce tea seed meal

2.1.4 發酵時間對油茶籽粕醬油品質的影響

油茶籽粕醬油內的氨基酸態氮和可溶性無鹽固形物是決定其風味、質地的關鍵因素之一[29-30]。由圖4可知，隨著發酵時間在12～20 d范圍內延長，油茶籽粕醬油的氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物和感官評分均呈先升后降趨勢，總酸則呈先降后升趨勢。當發酵時間為12～14 d時，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物隨之增高，總酸有所下降；當發酵時間為14 d時，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物最高，分別為81.90分、0.53 g/100 mL、11.50 g/100 mL；當發酵時間＞14 d之后，油茶籽粕醬油感官評分、氨基酸態氮、可溶性無鹽固形物有所下降，總酸有所增高。因此，最適發酵時間為14 d。

2.2 油茶籽粕醬油釀造工藝響應面試驗

2.2.1 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，固定發酵時間為14 d，選擇油茶籽粕含量（A）、鹽水添加量（B）、鹽水質量分數（C）3個對醬油質量影響較為顯著的因素作為自變量，以-1、0、1作為水平進行編碼，以氨基酸態氮（Y1）和綜合感官評分（Y2）作為響應值，油茶籽粕醬油感官評價結果表7，響應面試驗結果見表8。

表7 油茶籽粕醬油感官評價結果Table 7 Results of sensory evaluation of camellia seed meal soy sauce

表8 油茶籽粕醬油釀造工藝優化Box-Benhnken試驗設計及結果Table 8 Design and results of Box-Benhnken experiments for brewing technology optimization of camellia meal soy sauce

2.2.2 回歸方程的建立與方差分析

利用Design-Expert 8.0.6對表8中的試驗數據進行分析，以油茶籽粕醬油的氨基酸態氮（Y1）和感官評分（Y2）為響應值，進行回歸擬合，得到的回歸方程如下：

利用Design-Expert 8.0.6建立模型，分別得到氨基酸態氮和感官評分的多元二次回歸響應面模型，對試驗結果進行二項擬合和多元線性回歸分析，驗證因素與回歸模型的顯著性，方差分析結果見表9。

表9 回歸模型方差分析Table 9 Variance analysis of regression model

由表9可知，以氨基酸態氮為響應值的回歸模型P＜0.000 1，模型極顯著；失擬項P=0.175 4＞0.05不顯著，則表示該回歸方程可靠；回歸模型決定系數R2=97.76%＞85%，模型試驗誤差小，用此回歸方程能夠代替試驗真實點，來描述響應值與各變量之間的關系；校正決定系數R2Adj=0.9487表明該模型可解釋94.87%油茶籽粕醬油氨基酸態氮的變化。由P值可知，一次項A、B和二次項A2、B2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項C和交互項AB、BC對結果影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，據3個因素對油茶籽粕醬油氨基酸態氮影響強弱排序為油茶籽粕添加量＞鹽水質量分數＞鹽水添加量。

由表9亦可知，以感官評分為響應值的回歸模型極顯著（P＜0.000 1），模型差異不顯著（P=0.179 0＞0.05），回歸方程可靠且模型試驗誤差?。≧2=98.56%＞85%），用此回歸方程可解釋96.71%感官評分的變化（R2Adj=0.967 1）；由感官評分的P值可知，一次項A、B，交互項AB和二次項A2、B2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項C交互項BC和二次項C2對結果影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，3種因素對油茶籽粕醬油感官評分影響強弱順序為：鹽水質量分數＞油茶籽粕添加量＞鹽水添加量。

2.2.3 各因素交互作用

由圖5可知，隨著A和B、B和C、A和C的增大，氨基酸態氮呈先增高后降低的趨勢。其中AB、BC交互作用響應面坡度陡峭，等高線趨于橢圓形，表明AB、BC交互作用對氨基酸態氮影響顯著（P＜0.05），AC交互作用響應面坡度平緩，等高線趨于圓形，表明AC交互作用對氨基酸態氮影響不顯著（P＞0.05），這與方差分析結果一致；隨著A和B、B和C、A和C的增大，感官評分呈先增高后降低的趨勢。其中AB、BC交互作用響應面坡度陡峭，等高線趨于橢圓形，表明AB、BC交互作用對感官評分影響顯著，AC交互作用響應面坡度平緩，等高線趨于圓形，表明AC交互作用對感官評分影響不顯著（P＞0.05），這與方差分析結果一致。

圖5 各實驗因素交互作用對油茶籽粕醬油氨基酸態氮及感官評分影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between various factors on amino acid nitrogen and sensory scores of camellia seed meal soy sauce

2.2.4 驗證試驗

利用Design-Expert 8.0.6預測油茶籽粕醬油最佳釀造工藝條件為油茶籽粕添加量為41%、鹽水質量分數16%、鹽水添加量99%。在此條件下，氨基酸態氮的含量預測值為0.62 g/100 mL，感官評分預測值為81.97分。

為驗證模型具有可行性，在最佳釀造工藝參數條件下進行3次平行驗證試驗，得到油茶籽粕醬油氨基酸態氮的含量實際值為0.65 g/100 mL，同模型預測值的相對誤差為4.84%（＜5%），感官評分實際值為82.30分，同模型預測值的相對誤差為0.40%（＜5%），表示響應面法對油茶籽粕醬油的工藝條件優化所得結果可靠合理。

3 結論

本試驗結合模糊數學感官評價法和響應面法，以油茶籽粕和黃豆作為主要原料釀造油茶籽粕醬油，探究油茶籽粕添加量、鹽水質量分數、鹽水添加量和發酵時間對油茶籽粕醬油質量的影響，最終確定油茶籽粕醬油的最佳發酵工藝條件為油茶籽粕添加量41%，鹽水質量分數16%，鹽水添加比例99%，發酵時間14 d。在此優化工藝條件下，油茶籽粕醬油氨基酸態氮為0.65 g/100 mL，總酸為0.52 g/100 mL，可溶性無鹽固形物為15.80 g/100 mL，感官評分為82.30分；油茶籽粕醬油色澤鮮亮，組織均勻，滋味鮮美，有濃郁的醬香和酯香。