轉基因豬骨髓間充質干細胞的分離及與豬胰島的共培養研究

朱淑芳 曲澤澎 陸贏 潘登科 牟麗莎

胰島移植被認為是治療1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes mellitus，T1DM）的一種潛在方法[1-3]。然而，廣泛應用胰島移植來治療T1DM 面臨著一系列巨大挑戰，包括供器官短缺、胰島培養過程中β 細胞死亡、移植后即刻經血液介導的炎癥反應，以及與宿主免疫細胞攻擊或免疫抑制藥毒性有關的炎癥相關免疫排斥反應等[3-7]。間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）具有出色的免疫調節和血管生成等特性，已經在異種胰島移植中表現出令人滿意的效果[8-10]。但人類來源的MSC 需要從有限的人體組織（如臍帶、骨髓、脂肪）中獲取，供者相對短缺，且MSC質量受供者年齡影響，以及可能引發排斥反應[11-13]。另外，人類MSC 還涉及倫理問題[14]。豬MSC 來源廣泛，適合大規模研究和生產，且豬MSC 獲取和培養成本相對較低，不涉及倫理和法律爭議；豬MSC具有跨物種適應性，可在不同宿主動物中移植，有利于跨物種研究和治療模型的建立[15-17]。

通過多年的研究和實驗，豬被認為是最適合作為異種移植的供體動物[18-20]。豬器官的構造、大小和生理特征與人類相似，而且豬的供應充足[21-22]。然而，豬體內存在可引起外源性排斥反應的α-1,3-半乳糖（α-1,3-galactose，αGal）、N-羥乙酰神經氨酸（Nglycolylneuraminic acid，Neu5Gc）和Sd 血型抗原，分別由α-1,3-半乳糖基轉移酶（α-1,3-galactosyltransferase，GGTA1）、單磷酸胞嘧啶-N-乙酰神經氨酸羥化酶（cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）和β-1,4-N-乙酰半乳糖氨基轉移酶2（β-1,4-N-acetyl-galactosaminyltransferase 2，β4GALNT2）基因編碼的酶催化生成，在人體內能夠被人類抗異種活性抗體識別[23-25]。通過CRISPRCas9 基因編輯技術來有針對性地敲除GGTA1、CMAH 和β4GALNT2 基因，可以最大限度地減少或完全消除異種移植引起的排斥反應，提高異種移植的療效[25]。此外，作為人體補體調節蛋白的一員，人補體調節蛋白hCD46 能夠保護異種移植物免受系統補體激活引起的排斥反應[26-28]。

為了評估豬MSC 中與異種抗原相關的基因對異種移植的應用效果，需要建立豬MSC 的分離方法以及與豬胰島的共培養體系。本研究通過建立綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的GGTA1 基因敲除（GTKO）、GGTA1 基因敲除并hCD46 插入（GTKO/hCD46）以及CMAH 和G G T A 1 雙基因敲除（N e u 5 G C/G a l）豬骨髓MSC（bone MSC，BMSC），進行豬BMSC 與胰島細胞的共培養實驗，以評估其對胰島細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

GTKO、GTKO/hCD46 以及Neu5GC/Gal 基因修飾豬由潘登科教授團隊構建。DMEM 培養基、胎牛血清、胰蛋白酶以及鏈霉素購自美國Gibco 公司；多聚甲醛采購自美國Sigma 公司，藻紅蛋白（phycoerythrin，P E）-C D 2 9、異硫氰酸熒光素（f l u o r e s c e i n isothiocyanate，FITC）-CD44、PE-CD105、PE-CD166和PE-CD73 抗體購自美國BD 公司。油紅O、茜素紅以及阿利新藍均購自美國Sigma 公司。本研究經深圳市第二人民醫院倫理委員會批準同意（倫理編號：2 017 070 607）

1.2 實驗方法

1.2.1 BMSC 的分離和培養 GTKO 巴馬豬經麻醉后于無菌條件下穿刺豬股骨上端，抽取骨髓液5 mL。將骨髓液置于離心管中，加入15 mL 紅細胞裂解液，輕輕吹打混勻并作用10 min，200×g離心5 min，棄去上層紅色清液，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌離心去上清液，重復3 次。用含體積分數10%胎牛血清的DMEM/F12 培養液重懸沉淀細胞接種于T25 培養瓶中，水平放入37℃ 5% CO2培養箱內靜置培養。48 h 后用MEMα+10% 胎牛血清培養液進行首次換液，并在倒置顯微鏡下觀察細胞形態及生長狀況，以后每隔2 d 換液、觀察。待貼壁細胞達到80%～90%融合或出現生長抑制細胞不再有明顯擴增時，按1∶2 進行傳代，第3 代凍存備用。

采用同樣的方法分離培養野生型外三元豬、野生型巴馬豬、野生型五指山豬、野生型藏豬、GTKO/hCD46 五指山豬、GTKO 五指山豬、Neu5GC/Gal 五指山豬的BMSC。

1.2.2 BMSC 形態學觀察 于倒置生物顯微鏡下觀察并拍照記錄原代及多次傳代細胞的形態、貼壁、密度、融合度及融合時間等生長狀況。

1.2.3 BMSC 表面標志物鑒定 取第3 代GTKO 五指山豬BMSC，0.25%胰蛋白酶消化，PBS 洗滌2 次，4 ℃200×g離心5 min，棄上清，PBS 重懸。再以200×g離心 5 min，棄上清， PBS 洗滌 3 次后重懸，調整細胞濃度為1×106/mL，以100 μL 分裝于流式管中，向各管中加入相應抗體，于冰上或4 ℃避光條件下孵育30 min 后離心棄上清，用500 μL PBS 重懸細胞后進行流式鑒定。

1.2.4 BMSC 誘導分化 當第3 代GTKO 五指山豬BMSC 融合度達80%～90%時，將傳代培養液更換為相應BMSC 成骨誘導分化培養基，培養基每3 d 更換1 次。成骨誘導分化分別于4、8 d 進行堿性磷酸酶染色和茜素紅染色，染色均按試劑盒說明書進行操作，然后使用倒置顯微鏡觀察細胞成骨分化情況。

當第3 代GTKO 五指山豬BMSC 融合度達80%～90%時，將傳代培養液更換為相應BMSC 成脂誘導分化培養基，培養基每3 d 更換1 次。誘導10 d后，按試劑盒說明書進行油紅O 染液染色，并使用倒置顯微鏡觀察細胞成脂分化情況。

當第3 代GTKO 五指山豬BMSC 融合度達80%～90%時，將傳代培養液更換為相應BMSC 成軟骨誘導分化培養基，培養基每3 d 更換1 次。誘導10 d后，按試劑盒說明書進行阿利新藍染色，然后使用倒置顯微鏡觀察細胞成軟骨分化情況。

1.2.5 BMSC 標記示蹤 取生長狀態良好第3 代GTKO 五指山豬BMSC，0.25% 胰蛋白酶消化，200×g離心5 min，棄上清，PBS 重懸，制成單細胞懸液，稀釋至5×104/mL 后接種于24 孔板中，每孔200 μL，靜置培養24 h，待細胞達到30%～50%融合后，以感染復數（multiplicity of infection，MOI）為50 的劑量加入攜帶GFP 的慢病毒載體液。共培養72 h后，用PBS 進行沖洗3 遍，換為不含慢病毒的完全培養基繼續培養，此后每3 d 換液1 次，并在熒光顯微鏡下進行觀察GFP 表達情況，拍照記錄。

1.2.6 胰島細胞的分離 野生型外三元豬經麻醉后開腹，采用外科手術方法經主動脈放血至接近完全時，經4 ℃預冷生理鹽水沖淋胰腺使其快速降溫，使用無菌手術剪剝離胰腺周圍組織取出完整胰腺，置于預冷的 Hank’s 平衡鹽溶液中，應保證熱缺血時間不超過10 min 和冷缺血時間不超過30 min。在無菌超凈工作臺低溫條件下左手持無齒鑷、右手持無菌手術剪將胰腺表面脂肪及結締組織等修剪干凈后進行稱重。將膠原酶經胰管灌注進豬胰腺直至充盈，然后將灌注充盈的豬胰腺剪成大小一致體積進行消化，消化期間間隔相同時間進行取樣，雙硫腙（dithizone，DTZ）染色（胰島β 細胞可被DTZ 染為猩紅色），當在顯微鏡下看到較為完整的猩紅色胰島β 細胞時終止消化。使用含10%胎牛血清的1 640 培養基對收集的消化后組織進行洗滌，通過不連續密度梯度法純化組織，從而得到離心管底部沉淀的胰島細胞。將純化得到的胰島細胞按1×104胰島當量（islet equivalent quantity，IEQ）/30 mL 的接種密度到Ham’s F10 培養基進行后續培養。

1.2.7 胰島細胞與BMSC 共培養 取第3 代GFP 轉染標記的GTKO 五指山豬BMSC，將BMSC 與胰島進行共培養，24 h 后觀察胰島形態變化。分別用MSC 條件培養基（HamCDM）和非條件培養基（Ham）培養胰島48 h，然后進行活細胞（CalceinAM）和死細胞（PI）染色。

1.3 研究內容

觀察豬BMSC 原代細胞及多次傳代細胞的形態與生長特點，鑒定GTKO 五指山豬BMSC 表面標志物，分析GTKO 五指山豬BMSC 成骨、成脂及成軟骨細胞分化效果。分析GFP 轉染標記GTKO 五指山豬BMSC 的生物學特性，觀察豬胰島與GTKO 五指山豬BMSC 共培養時的形態及生長特點。

2 結果

2.1 豬BMSC 的分離、鑒定和標記

體外培養的BMSC 呈梭形，在細胞生長的對數期，BMSC 的倍增時間約為30 h。細胞特性穩定，擴增1 代和2 代后的細胞同質性均達到95% 以上。BMSC 連續傳代培養和冷凍保存后仍能具有多向分化潛能。不同豬BMSC 形態見圖1。

圖1 豬BMSC 形態學表現（×100）Figure 1 Morphological findings of BMSC of pig

分離培養的GTKO 五指山豬BMSC 具有成脂、成骨、成軟骨分化能力（圖2）。流式細胞術結果顯示，豬BMSC 表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105 及CD166（陽性率＞85%），不表達CD34、CD45（陽性率＜15%）（圖3）。標記示蹤后的GTKO 五指山豬BMSC 培養36、48 h 后表達特異性GFP（圖4）。

圖2 GTKO 五指山豬BMSC 的三系分化結果（×100）Figure 2 The trilineage differentiation results of BMSC of GTKO Wuzhishan pig

圖3 GTKO 五指山豬BMSC 表面標志物表達情況Figure 3 Expression of cell surface markers of BMSC of GTKO Wuzhishan pig

圖4 GTKO 五指山豬BMSC 標記示蹤結果（×100）Figure 4 Labeling and tracing results of BMSC of GTKO Wuzhishan pig

2.2 BMSC 對胰島細胞的保護能力

胰島細胞與GTKO 五指山豬BMSC 共培養3 d后，細胞生長良好，形成細胞聚集體，共培養條件下的胰島聚集體比僅胰島培養條件下的增大（圖5）。用MSC 條件培養基培養的豬胰島細胞比非條件培養基培養的豬胰島細胞活力更強，細胞死亡較少（圖6）。

圖5 豬胰島與GTKO 五指山豬BMSC 的共培養結果（×100）Figure 5 Co-culture results of porcine pancreatic islets and BMSC of GTKO Wuzhishan pig

圖6 不同培養條件下豬胰島細胞活力Figure 6 Viability of porcine pancreatic islet cells under different culture conditions

3 討論

在異種移植中，豬具有供應充足的優勢，被認為是最合適異種移植的供體動物。然而，豬細胞表面存在的αGal、Neu5GC 和Sd 血型抗原能被人抗異種活性抗體識別，在豬異種移植中引起排斥反應[29-31]。通過對豬異種抗原基因進行敲除，如使用CRISPR/Cas9技術產生的GTKO 豬BMSC，可以減輕異種移植排斥反應，提高豬BMSC 在T1DM 胰島移植治療中的效果[32]。

既往研究表明，使用CRISPR/Cas9 基因編輯技術產生的GTKO 豬BMSC 不表達與異種移植排斥反應有關的αGal 抗原，并可以表現出與野生型豬BMSC 相似的特征[29]。此外，hCD46 在敲除了Gal 抗原基因GGTA1 的豬主動脈內皮細胞上的表達可保護細胞免受排斥反應損傷[26]。通過轉基因修飾在GTKO/hCD46 豬中繼續敲除CMAH，可以顯著減輕異種灌注豬肺中抗體介導的排斥反應[33]。這為在利用轉基因豬預防排斥反應的臨床應用中提供了新的啟示。

本研究對GTKO、GTKO/hCD46 和Neu5GC/Gal三種不同轉基因修飾豬的BMSC 進行了分離培養，并將GTKO 豬BMSC 與豬胰島細胞共培養。結果顯示這些BMSC 在體外誘導時能夠分化為脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞。雖然在培養條件方面與之前的研究存在差異，但豬BMSC 的生長特性仍與人BMSC相似，且倍增時間約為人BMSC 的一半。

由于胰島移植后的免疫排斥反應，胰島移植在T1DM 治療中面臨挑戰[34-36]。近年來，MSC 被廣泛應用于自身免疫性疾病的治療，如T1DM[37-38]。本研究通過對野生型外三元豬胰島和不同轉基因修飾豬的BMSC 共培養，評估了豬BMSC 對胰島的保護作用，發現共培養條件下，豬BMSC 能夠通過分泌因子保護胰島免受炎癥免疫排斥反應的損害，這對胰島的功能和活力的保持至關重要。

綜上所述，本研究建立的方法對解決胰島短缺和豬體內抗原引起的免疫排斥反應問題具有一定參考意義，為未來基因修飾豬BMSC 在異種胰島移植研究中的應用提供了實驗基礎，也為異種胰島移植策略在治療T1DM 中的應用提供了有益的啟示。但本研究存在一定的局限性：（1）初步實驗性質，本研究是初步實驗，尚未全面探討不同來源MSC 的潛在差異；（2）數據量化不足，在某些實驗中，未能提供足夠的量化數據，僅提供了代表性圖表，導致結論代表性不足；（3）資源限制，由于資源、時間和技術限制，我們未能進行更廣泛的實驗或考慮更多的變量，這可能會影響研究的全面性和深度。未來將進行更廣泛、深入的研究，進一步探索異種胰島移植策略在治療T1DM 中的應用。