棉花細胞質雄性不育的胞質效應研究現狀及未來展望

李博，張夢，張學賢，郭立平，戚廷香，唐會妮，王瑞杰，王海林，喬秀琴，吳建勇，邢朝柱

（中國農業科學院棉花研究所/ 棉花生物育種與綜合利用全國重點實驗室/ 農業農村部棉花生物學與遺傳育種重點實驗室，河南安陽 455000）

棉花作為一種重要的經濟作物，是紡織工業的主要原料，在我國國民經濟中占有重要地位[1]。同其他作物一樣， 棉花具有明顯的雜種優勢，強優勢雜交組合的F1可比常規棉品種增產15%左右[2-3]。 目前，生產上大面積推廣種植的棉花雜交種大多數是由人工去雄授粉獲得。 近年來，由于勞動力成本不斷上漲，生產上推廣人工去雄制備雜交種難以為繼，給棉花雜種優勢利用研究帶來了新的機遇和挑戰[4]。

細胞質雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）是一種經濟且有效的授粉控制系統。 利用CMS 雜交制種技術不但能夠省去人工去雄成本，而且可有效提高大面積制種的純度。 目前該技術已經在水稻、玉米、棉花、油菜、高粱、辣椒等作物中取得較大的進步[5-6]。 棉花CMS 系主要有哈克尼西棉（Gossypium harknessii）[7-9]、三裂棉（G.trilobum）[10]、陸地棉（G.hirsutum）[11]、海島棉（G.barbadense）[12]和異常棉（G.anomalum）[13]不育胞質等多種類型。 目前，只有哈克尼西棉、陸地棉和三裂棉的胞質不育系實現了不育系、 保持系和恢復系 “三系” 配套， 其中哈克尼西棉不育胞質（CMS-D2）是生產上推廣種植的棉花“三系”雜交種的主要胞質來源[14]。隨著棉花不育系、保持系和恢復系的成功創制、回交改良和“三系”配套，我國在胞質不育“三系”雜交棉研究與育種應用方面均走在了世界前列[15]。近年來，國內棉花育種家已成功培育出一系列強優勢的“三系”雜交棉品種，如國審棉銀棉2 號[16]、邯雜98-1[17]、邯雜301[18]、中棉所99[19]、魯雜2138[20]以及省審棉浙雜2 號[21]、中棉所83[22]和運B259[23]等。然而，由于棉花CMS 恢復源狹窄以及不育細胞質對F1的產量性狀等具有一定的負效應等問題，“三系” 雜種棉在我國主產棉區推廣應用進展緩慢。 此外，CMS-D2 恢復系的花藥發育易受外界環境影響[1,24-26]。如夏季持續高溫脅迫會引起棉花授粉受精能力下降、蕾鈴脫落，最終導致產量銳減，這大大限制了“三系”雜交種在生產上的大面積推廣應用。因此，本研究通過系統分析棉花雄性不育細胞質對主要性狀的影響及其負效應產生的分子基礎， 探討克服甚至消除棉花雄性不育細胞質負效應的潛在育種對策，從而為選育優良的棉花細胞質雄性不育系、恢復系和強優勢的“三系”雜交種提供理論依據。

1 棉花雄性不育細胞質對主要性狀的影響

1.1 農藝性狀

棉花苗期主要以營養生長為主，進入蕾期后處于營養生長和生殖生長的并進時期。 有學者報道，CMS-D2 不育胞質對棉花苗期生長及生物量積累無明顯影響[27]。 趙存鵬等[28]也認為陸地棉雄性不育細胞質對棉花株高無顯著影響，但使生育期延長、果枝數增加。 此外，華金平等[29]以具有8個不同棉種細胞質的中棉所7 號（陸地棉）同核系為研究材料發現，與陸地棉胞質系相比，哈克尼西棉胞質系花蕾瘦小，而異常棉胞質系和亞洲棉胞質系的花蕾則表現為尖削、瘦長。王學德等[30]研究表明，與可育胞質雜交組合的F1相比，不育胞質雜交組合F1的單?；ㄋ幤骄w積變小，百?；ㄋ幍母晌镔|質量降低。 綜合來看，雄性不育細胞質對棉花農藝性狀無明顯的負效應，但異源細胞質對陸地棉花器官的形態具有一定影響[31]。

1.2 葉片光合特性

光合作用對植物生長發育和作物產量形成至關重要，目前關于雄性不育細胞質對棉花光合特性影響的研究報道較少。 左志丹等[27]在河南安陽和江西九江試驗點系統研究了CMS-D2 不育胞質對棉花全生育期主莖功能葉光合特性的影響，發現在苗期不育胞質能顯著促進棉花的光合作用；進入花鈴期以后，不育胞質對光合作用的負效應開始顯現，主要表現為不育胞質恢復系在花鈴期和吐絮期的葉片凈光合速率顯著降低，這可能間接影響棉花產量形成。 趙海燕[32]認為在光合特性方面，從蕾期到吐絮期，棉花CMS 系亞棉A 的葉片凈光合速率均顯著低于相應的保持系亞棉B；與保持系相比，不育系葉片的氣孔導度在蕾期和吐絮期均明顯較高，而在開花期和結鈴期較低；除蕾期外，在其他生育時期不育系葉片的蒸騰速率和胞間CO2濃度均顯著低于保持系。這些差異可能是由于該不育系的不育細胞質與細胞核存在互作，使與光合調控相關基因的時空表達及其功能發生了一定變化。

1.3 花藥發育狀況

棉花CMS 系的育性恢復能力直接關系著“三系”雜交棉收獲期的成鈴數和最終產量。 已有大量研究報道，棉花花藥發育和花粉育性易受夏季高溫脅迫影響，主要表現為花藥不開裂、花粉敗育以及萌發活力降低[1,26-27,33-34]。 棉花CMS-D2不育胞質恢復系和“三系”雜交種的花藥發育過程不僅受不育細胞質、恢復基因和育性增強基因的調控[35-36]，而且受細胞核遺傳背景和外界環境條件（如夏季高溫）影響[1,24-26]。 前人對此也開展了諸多研究。 例如，王學德等[30]發現CMS-D2 不育細胞質對不育系與恢復系雜交F1的育性具有一定程度的負效應，主要是引起雄配子敗育和降低雌配子育性[37]。 張學賢等[38]選用3 個CMS-D2 不育胞質型恢復系及其同質異核的3 個可育胞質型恢復系進行研究發現，在高溫脅迫下不育胞質型恢復系的多粉花率和籽棉產量均顯著低于可育胞質型恢復系，并且指出籽棉產量與多粉花率直接相關。 另有研究報道，在高溫脅迫下CMSD2 不育胞質恢復系的多粉花率、 可育花粉率和花粉體外萌發率均極顯著低于陸地棉可育胞質恢復系，尤其在長江流域棉區表現更為明顯[27]，這說明夏季溫度越高，不育胞質對盛花期花藥發育的負效應更加凸顯[24-25,38]。此外，在高溫脅迫下，三裂棉CMS（CMS-D8）恢復系花粉育性比孢子體不育的CMS-D2 恢復系表現更為穩定[1,26,39-40]，這說明棉花CMS-D8 胞質雜種F1的花藥發育過程可能具有更好的高溫耐受性。

1.4 產量性狀

早期國內外學者關于雄性不育細胞質對棉花產量及其構成因素的研究結果分歧較大[41-42]，但后續大量研究報道表明， 不育胞質對籽棉產量、皮棉產量和衣分均有顯著的負效應[19,27,30,46-47]。利用哈克尼西棉不育系及恢復系配制的雜種F1平均減產5%～8%[44]。 王江林等[46]的研究結果表明，三裂棉（D8）不育胞質對籽棉和皮棉產量具有極顯著的負效應， 同時對衣分也表現出負效應。有學者研究發現不育胞質對棉花單株鈴數無明顯不利影響[28,46]，但是王學德等[30]、左志丹等[27]和周曙霞等[48]認為不育胞質對棉花單株鈴數具有顯著的負效應。 王江林等[46]認為D8 不育胞質對棉花的鈴重表現為負效應，但另有研究發現不育胞質對棉花鈴重的影響并不顯著[27-28]。 這些差異可能是由于不同棉種CMS 的胞質效應對產量性狀的影響不盡相同，并且這種胞質效應還受細胞核遺傳背景和外界環境條件（如溫度）的影響[24-26]。

1.5 纖維品質性狀

近年來，研究人員就雄性不育細胞質對棉花纖維品質性狀的影響進行了大量研究[27-28,46,48-49]。趙存鵬等[28]以轉基因抗蟲棉常規品種冀2658 及其同核異質不育系冀2658A 為母本、以6 個恢復系為父本，配制了12 個雜交組合，結果表明陸地棉雄性不育細胞質對棉纖維的斷裂比強度及斷裂伸長率具有顯著負效應，而對纖維上半部平均長度、 長度整齊度指數和馬克隆值無顯著影響。周曙霞等[48]以陸地棉保持系和哈克尼西棉胞質不育系為親本配制42 個雜交組合， 研究表明哈克尼西棉的胞質效應廣泛存在，主要對雜交F1棉纖維的2.5%跨距長度、馬克隆值有顯著負效應。 另有學者發現CMS-D2 不育胞質對雜種F1的纖維長度具有一定的正效應[49]。 左志丹等[27]為排除細胞核背景影響，選用2 套同核異質的哈克尼西棉恢復基因近等基因系為材料，發現CMS-D2 不育胞質總體上對棉花纖維品質性狀無明顯的不利影響。 此外，王江林等[46]認為三裂棉D8 不育胞質對纖維上半部平均長度和長度整齊度指數無顯著影響，但可顯著提高纖維斷裂比強度和斷裂伸長率，并降低馬克隆值，說明三裂棉不育胞質對棉纖維品質性狀無明顯不利影響，還可在一定程度上改善纖維細度和強度。

1.6 抗逆性

相比親本， 棉花雜交種具有更強的抗逆性，但目前關于雄性不育細胞質對棉花抗逆性影響的研究報道較少。 趙存鵬等[28]的研究結果表明陸地棉雄性不育細胞質對黃萎病發生具有一定的抑制作用，但對枯萎病的發生無顯著影響。 另有研究報道， 與CMS-D2 不育胞質型恢復系相比，陸地棉正常胞質型恢復系的花藥發育具有更強的耐高溫性能[27,38]。

2 棉花不育胞質效應產生的分子基礎

2.1 生理生化變化

正常的生理生化過程是植物生長發育的基礎。 目前關于棉花雄性不育胞質對植株生理生化指標的影響已有大量研究[28,32,50-51]。 例如，趙存鵬等[28]利用同核異質的F1探究冀2658A 雄性不育細胞質對棉籽粗蛋白和粗脂肪含量的影響，結果表明冀2658A 雄性不育細胞質對棉籽粗脂肪含量有顯著負效應，而對棉籽粗蛋白含量無顯著影響。黃晉玲[50]對與線粒體有關的過氧化物酶、細胞色素氧化酶、超氧化物歧化酶和琥珀酸脫氫酶的活性進行分析，發現晉A 不育系在花粉發育各個時期的酶活性與其保持系相比，均明顯降低，這說明酶活性變化可能與雄性不育發生有關。馮義軍等[51]的研究結果表明，與同核異質的F1材料相比，含有哈克尼西棉不育胞質的F1在開花期葉片的葉綠素含量、可溶性蛋白質含量、淀粉含量以及光合強度均顯著升高，而可溶性糖含量和呼吸強度顯著降低，這說明含有CMS-D2 不育胞質的F1具有較高的光合強度和較低的呼吸強度，從理論上來說有利于光合產物的積累。 此外，含有哈克尼西棉不育胞質的F1在開花期葉片中的淀粉酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性均顯著低于其同核異質F1材料，但多酚氧化酶活性顯著高于其同核異質F1材料。王學德[52]發現從造孢細胞增殖期至花粉成熟期，不育花藥中的淀粉和可溶性糖含量未發生明顯變化，與保持系的可育花藥中的淀粉和可溶性糖含量的變化趨勢明顯不同。 此外，解海巖等[53]發現保持系、恢復系和雜種F1的可育花藥的內源激素含量無顯著差異；與可育花藥相比，不育花藥中吲哚乙酸、赤霉素和玉米素核苷的含量均降低，而脫落酸含量升高，這種差異在花粉母細胞敗育時期達到最大，說明花藥中內源植物激素含量異常與雄性不育密切相關。 但目前關于植物激素如何精確調控棉花雄性不育發生的具體機制仍知之甚少。

2.2 轉錄和代謝水平的變化

基于CMS 的雜交后代通常比常規雜交種表現出更明顯的細胞質效應，“三系”雜交種產量形成主要取決于作物CMS 育性恢復能力的強弱。近年來，關于不育胞質在轉錄、轉錄后和代謝等水平上如何影響花藥發育已有一些研究報道[54-56]。 在大豆中， 糖信號- 光敏色素互作因子（phytochrome interaction factor,PIF）-生長素信號轉導途徑可能是高溫脅迫下導致不育胞質雜種F1雄性育性不穩定的潛在原因。 此外，GmHSFA2作為一個正調節因子，可能直接參與高溫脅迫下大豆CMS 雜種F1花粉育性保護機制的激活[56]。Ding 等[55]通過小RNA 和轉錄組測序分析發現，在大豆中21 個差異表達的微小RNA（microRNA,miRNA）和15 個差異表達的靶基因之間存在負調控關系，如gma-miR397a/ 漆酶2、gma-miR399a/無機磷酸鹽轉運蛋白1-4 和gma-miR4413a/PPR蛋白基因可能在高溫脅迫下參與調控大豆不育胞質雜種F1的雄性育性穩定性。 研究發現gmamiR156b 負調控其靶基因GmSPL2b的表達，并且gma-miR156b 過表達擬南芥在高溫脅迫下表現為雄性不育[57]。 近期中國農業科學院棉花研究所的專家團隊通過對保持系NB、 同核異質近等基因恢復系NH 和SH 在河南安陽和江西九江環境下的成熟花粉進行非靶向代謝組學和轉錄組學聯合分析，發現CMS-D2 不育胞質對花粉育性的負效應主要是由于質核互作效應誘導關鍵轉錄因子如WRKY22、WRKY53和ARF18等的上調表達，使脂質代謝特別是不飽和脂肪酸的代謝平衡被破壞，引起茉莉酸含量降低，最終導致花粉育性下降，但具體的調控機制尚不清楚，有待進一步深入研究。 同時，在CMS-D2 不育胞質存在的情況下，細胞質- 細胞核的相互作用產生了大量的黃酮類化合物，可能參與花粉育性恢復過程[54]。

3 克服棉花不育胞質負效應的潛在途徑

棉花不育胞質的負效應主要集中在花藥發育和產量等性狀上， 尤其是在高溫脅迫下棉花CMS 育性恢復穩定性直接決定最終的成鈴數和產量[27]。 目前生產上推廣利用棉花CMS-D2 胞質不育“三系”雜交種F1的主要限制因素是由于其花粉育性較差（總花粉量偏少，可育花粉率和花粉萌發活力偏低），進而影響棉花雙受精過程，引起結鈴率低、不孕籽率高，最終表現為單株鈴數減少、鈴重降低，導致籽棉產量下降，這種現象在夏季溫度更高的長江流域棉區表現更為明顯[25-27]。因此，明確不育胞質效應及其影響因素，可為棉花“三系”雜交種的選育與改良奠定重要理論基礎。 對此，可以采取常規育種與生物育種相結合的方法來選育和改良親本（不育系和恢復系），輔助一定的栽培技術措施緩解高溫脅迫下不育胞質對雜交種花藥發育的負效應，并加強棉花新型配子體胞質不育類型CMS-D8 相關的基礎研究及育種價值評估等，從而推動“三系”簡化制種技術在我國雜交棉生產中的進一步推廣應用。

3.1 選擇適宜的生態區推廣種植“三系”雜交種

已有研究報道，棉花CMS-D2 不育胞質對產量等性狀存在一定的負效應，在高溫脅迫下表現更為明顯[27]。具體來說，CMS-D2 胞質負效應在夏季溫度相對較低的黃河流域棉區表現較弱，但長江流域棉區盛花期極端高溫會引起不育胞質恢復系和“三系”雜交種的花藥不開裂、總花粉量減少和花粉育性降低，具體表現為授粉受精能力下降、棉鈴結實率降低，最終直接導致棉花產量銳減[25-26]。 因此，可在不同生態環境下對“三系”親本和特定雜交組合進行系統育種評價，在適宜的生態區篩選出一些較人工去雄授粉雜交種具有增產潛力的“苗頭”雜交組合[15]。近年來，國內育種家已陸續培育出了一系列適于黃河流域棉區種植綜合性狀表現較好的國審 “三系” 雜交棉品種[18-20]，但適于長江流域棉區推廣種植的“三系”雜交種的選育尚比較困難。

3.2 通過置換細胞核遺傳背景改良恢復系

不育胞質效應與核基因型密切相關，相同胞質型與不同核基因型結合，對棉花同一性狀的遺傳效應可能不盡相同[15,37]。 利用遠緣雜交和回交等手段， 目前已獲得了恢復基因分別來自三裂棉、異常棉和瑟伯氏棉（G.thurberi）的恢復系，并從海島棉品種Pima S-4 中發現了育性增強基因E[35]。 因此，可通過有性雜交方法將多個恢復基因Rf和海島棉育性增強基因E聚合到高產優質抗蟲棉品種（系）中，從而培育出對多種胞質不育類型均具有強恢復力的新型恢復系[58]。此外，利用中國農業科學院棉花研究所歷經多年研究成功建立的“三系” 分子標記輔助選擇（marker-assisted selection,MAS）育種體系對不育基因和恢復基因進行跟蹤[7,9,39-40,58,60]，引入耐高溫等優異棉花種質資源對“三系”雜交種雙親（尤其是恢復系）的細胞核遺傳背景進行回交改良和多年多環境交叉選擇。 通過不育系與恢復系的廣泛測交，盡量減少甚至消除不育胞質對“三系”雜交組合主要經濟性狀的負面影響，最終選育出適于我國主產棉區推廣種植的“三系”雜交種是切實可行的[15]。

3.3 通過細胞質置換降低不育胞質的負效應

在棉花中，除了生產上推廣種植的CMS-D2胞質不育“三系”雜交種外，還有陸地棉[11]（通過種間雜交獲得）、海島棉（利用外源基因導入）[12]以及三裂棉[10]和異常棉[13]（通過遠緣雜交獲得）等多種胞質不育類型被成功創制。 其中通過陸地棉與海島棉種間雜交獲得的陸地棉胞質不育系已經實現了“三系”配套[61]和雜交棉品種審定，如國審棉銀棉2 號[16]、邯雜98-1[17]和邯雜301[18]。此外，趙存鵬等[28]的研究也發現陸地棉不育細胞質對雜種F1的單株鈴數和鈴重等產量性狀無顯著影響。 因此，以陸地棉胞質不育系為母本、以優良CMS-D2保持系為父本，利用有性雜交和多代回交方法將對應CMS-D2 不育系的細胞質替換為陸地棉不育胞質類型， 并利用MAS 育種技術追蹤不育基因和改良不育系，也是降低CMS-D2 不育胞質負效應的潛在有效途徑。

3.4 利用細胞工程育種技術定向增強“三系”親本的耐熱性

蛋白質組學分析表明，熱休克蛋白70-17（heat shock protein 70-17,HSP70-17）和結合蛋白5（binding protein 5,BiP5）通過減少花藥中活性氧的積累提高高溫脅迫下棉花雄性育性[62]。 在CMS-D2 胞質存在的情況下，質核互作效應可能增加參與育性恢復過程的類黃酮的合成，并誘導關鍵轉錄因子如WRKY22、WRKY53和ARF18的上調表達，破壞下游脂質代謝的平衡，最終導致恢復系花粉育性下降[54]。近期，中國農業科學院棉花研究所成功建立了跨越棉屬種間/ 種內、無基因型限制的棉花高效遺傳轉化體系——種子頂端分生組織細胞介導的轉化（shoot apical meristem cell-mediated transformation,SAMT），轉化周期縮短至2～3 個月， 這為加速棉花功能基因研究和基因工程育種進程提供了重要技術保障[63]。因此，可利用SAMT 轉化體系在已審定“三系”雜交種（如優質棉中棉所99）親本中過表達耐高溫轉錄因子（如HSPs）或通過基因編輯敲除溫度敏感型轉錄因子（如WRKY53）等，增強花藥發育對高溫的耐受性，從而降低高溫脅迫下不育胞質的負效應。

3.5 通過栽培管理措施緩解高溫脅迫下不育胞質的負效應

植物花藥發育對高溫的響應機制十分復雜，其中內源植物激素包括生長素[34,64]和茉莉酸[65]等參與調控花藥發育對外界高溫的響應過程。 在棉花中，高溫引起花藥不開裂和花粉敗育，主要是由于過度激活的生長素信號[34]以及茉莉酸合成和代謝平衡受到破壞[54,65]。 因此，在極端高溫天氣來臨前，可對盛花期的棉株噴施適宜濃度的茉莉酸甲酯或生長素抑制劑等，在一定程度上緩解高溫脅迫下不育胞質對“三系”雜交種花藥發育的負效應，以增加成鈴數和產量。

3.6 加強棉花新型配子體胞質不育的基礎研究及育種應用

三裂棉CMS（CMS-D8）是一種新型的棉花胞質不育類型，目前也已經實現了“三系”配套，其恢復系的育性相比孢子體不育類型的CMSD2 胞質恢復系在高溫下表現更為穩定[26,39-40]。 此外，CMS-D8 屬于配子體不育類型， 不育胞質雜種F1自交所得F2群體中不會出現不育株[66]，因此在當前新疆主產棉區機械化密植條件下具有潛在的育種應用價值[1]。 關于棉花CMS-D8 系統，中國農業科學院棉花研究所近年來在不育基因和恢復基因定位以及分子標記開發等方面已取得一系列進展[39-40,60,67]。 當前，應繼續加強棉花CMS-D8 不育及其育性恢復機理研究，同時通過常規育種與MAS 育種技術相結合， 加快推進CMS-D8 不育系和恢復系的回交改良以及 “三系”雜交棉新品種選育工作。

4 前景展望

利用雜種優勢可以顯著提高棉花產量、改善纖維品質和增強抗逆性等[68]。 目前生產上推廣種植的主要是人工去雄授粉獲得的棉花雜交種，其種植面積僅占我國植棉面積的10%左右。 勞動力成本逐年攀升，為生產上大面積推廣利用人工去雄授粉制種技術獲得的雜交種帶來了不利影響[4]。因此，簡化、高效、低成本的棉花制種方法已成為我國雜交棉發展的必然要求。 利用CMS-D2“三系法” 開展雜交制種可以很好地解決這一問題，既能免去人工去雄成本，又能通過大面積制種有效提高雜交種純度。 我國棉花CMS 研究與利用起步較晚，仍有較多問題有待解決，但可以借鑒水稻、油菜、白菜和蘿卜等作物中CMS 研究與利用的成功經驗， 加強對現有 “三系” 材料CMS-D2 胞質效應產生的分子基礎研究，采取常規育種、MAS 育種和細胞工程育種等相結合的方法選育和改良強優勢的“三系”親本和雜交種，并輔以適宜的栽培技術措施等盡量減輕甚至消除不育細胞質帶來的負效應，從而拓寬胞質不育“三系” 雜交種在我國夏季溫度較高的長江流域棉區的推廣種植。 近年來，已有一些強優勢的棉花“三系”雜交種如邯雜301、優質棉中棉所99 和魯雜2138 等在黃河流域棉區和新疆植棉區示范種植，表現出顯著的增產潛力和適應性，說明不育系簡化制種技術在我國未來雜交棉生產中具有廣闊的應用前景。 因此，選育和改良棉花“三系”雜交種并在我國主產棉區推廣應用，有望大幅度增加植棉效益并提高棉農的收入。