大熊貓白血病抑制因子RNAi干擾載體的構建及應用

李非平,劉玉良,王神飛,張夢詩,胡賢彪,安俊輝,王東輝,張名岳,侯 蓉,蔡開來

(成都大熊貓繁育研究基地四川省瀕危野生動物保護生物學重點實驗室,四川 成都 610081)

大熊貓(Ailuropoda melanoleuca)是中國特有的珍稀瀕危動物.根據第四次全國大熊貓調查,全球野生大熊貓數量已達到1 864只,其中80%以上分布在四川.由于棲息地的縮小及破碎化,導致遺傳交流中斷,遺傳多樣性不斷缺失[1],經過我國的不懈努力使得大熊貓的數量明顯上升,雖然國際自然保護聯盟已將這一標志性物種從“瀕?！绷袨椤耙孜！?但是,大熊貓的保護仍需要持續努力,為了防止大熊貓重新面臨瀕危,我國已經進行了多方面的科學研究及管理工作.目前,大熊貓的研究主要集中在棲息地的分布[2]、腸道微生物[3]、疾病的預防和治療[4]及分類[5]等.本實驗室已經成功地從大熊貓的骨髓中分離了間充質干細胞(MSCs)[6],為大熊貓細胞生物學相關的基礎研究提供了新的資源.

骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)是存在于骨髓和身體大多數結締組織中的一類具有高度的自我更新能力的成體干細胞[7].因其來源豐富,在體外易分離和擴增,低免疫源性,且不存在倫理問題,可用于同種異體移植等特性成為繼胚胎干細胞后備受關注的細胞.BM-MSCs 可分化成多種細胞,如成骨細胞[8]、軟骨細胞[9]、脂肪細胞[10]、神經細胞[11]、心肌細胞[6]及肝細胞[12]等.同時,BM-MSCs 還因其獨特的增殖分裂模式使外源基因易于導入和表達[13],可作為基因治療載體[14],在組織損傷修復,如神經系統損傷后再生修復[15]、自身免疫疾病治療[16]中有廣闊的應用前景.

LIF 是白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)家族中的一個多效性細胞因子,是一種分子量介于38 kD～67 kD的分泌型糖蛋白.LIF的生物學活性主要有:(1)調節細胞的增殖、分化和表型;(2)抑制脂蛋白脂酶活性,降低3T3-L1脂肪細胞對游離脂肪酸的攝取;(3)促進骨的重吸收,這種作用可能是通過 LIF 刺激成骨細胞合成前列腺素所介導的;(4)誘導肝臟急性期蛋白的產生.同時,Oskowit等通過miRNA干擾hBMSCs的LIF表達發現,其成骨及成脂分化能力加強[17];體內 LIF 受體的缺失導致了胎兒骨組織和其他間葉組織分化異常則進一步說明了 LIF 對維持 MSCs 功能的重要性.

然而,到目前為止LIF對大熊貓干細胞生長及發育的調控作用還未有報道.因此,本研究擬通過構建LIFRNAi 慢病毒 pLKO.1 puro-LIF-down無擾質粒,以慢病毒感染的方式將其導入PDBM-MSCs 中,抑制LIF在PDBM-MSCs的表達,進而研究LIF抑制后對PDBM-MSCs生長及干性的影響,為大熊貓干細胞的體外培養及干性機制的研究奠定基礎.

1 材料方法

1.1 材料

low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (LG-DMEM 貨號:3160083,美國Gibco);胎牛血清(FBS 貨號:FSP500,美國 Prime);basic fibroblast growth factor (bFGF,貨號:PHG0026,美國 Gibco);Anti-antibiotic (貨號:15240052,美國 Gibco);青鏈霉素 (貨號:SV30010,美國 HyClone);Phosphate-Buffered Saline (PBS,貨號:C2012500BT,美國 Gibco);TrypLE Express (貨號:12604-013,美國Gibco);pLKO.1 puro載體 (貨號:LM-1792,上海 LMAI Bio );DNA凝膠回收試劑盒 (貨號:D0056,上海 碧云天);氨芐霉素 (貨號:ST007,上海 碧云天);LipofectamineTM2000 轉染試劑 (貨號:11668019,美國 Thermo);嘌呤霉素 (貨號: ST551,上海 碧云天 );Rneasy MiNi Kit(50) (貨號:163050725,德國Qiagen );PrimeScript RT reagent Kit(貨號:RR047A,日本TaKaRa);FastStart Essential DNA Green Master (貨號:6402712001,瑞士Roche) .

1.2 大熊貓骨髓間充質干細胞培養

MSCs 的分離參照劉玉良等[6]對PDBM-MSCs的分離方法.在無菌條件下,切除死亡后的大熊貓的股骨和脛骨,剔除骨頭上的所有結締組織.剪開骨頭的兩端,用20 mL的注射器抽滿完全培養基反復沖洗骨髓至60 mm培養皿中.完全培養基成分:LG-DMEM,10% FBS,1×Anti-antibiotic,10 ng/mL bFGF.輕輕吹打所得細胞制成單細胞懸液,將細胞在37 ℃,5% CO2下孵育.4 h后,移除培養基,用PBS溶液沖洗3次,再加入完全培養基培養貼壁細胞5 d,每2 d換液1次.細胞達到80%融合,用TrypLE Express消化,以5×103/cm2的細胞密度進行接種.

1.3 LIF RNAi 慢病毒載體的構建包裝與轉染

1.3.1LIFRNAi 載體的構建

設計3對大熊貓LIF基因靶點序列(siRNA1-3,如表1),并將其構建到pLKO.1 puro慢病毒載體,載體中含有Puro 抗性和Amp 抗性,酶切位點選用AgeI和EcoRI,雙酶切后用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離,從膠上切取目的載體,使用膠回收試劑盒回收純化目的載體.siRNA 經3′和5′的單鏈退火獲得shRNA后,與線性回收純化目的載體行連接反應后轉化DH5α感受態細胞,在含氨芐霉素的LB平板37 ℃培養過夜篩選重組克隆.平板挑選克隆接種至LB培養基37 ℃ 250 r/min搖菌14 h,將菌液送擎科生物技術有限公司測序.

1.3.2 HEK293T 細胞病毒包裝及滴度檢測

HEK293T細胞融合率達到60%～70%進行轉染,轉染體系:100 mm 平板中,加入 10 μg 慢病毒表達載體,10 μg 慢病毒包裝質粒,50 μL Lipofectamine2 000.4 h后除去含轉染試劑的培養基,加入10 mL HEK293T新鮮培養基,37 ℃ 孵育48 h,收集含病毒顆粒的上清.4 ℃ 2 000×g離心10 min,除去細胞碎片.用 0.45 μm 濾器過濾收集上清.通過熒光顯微鏡應用倍比稀釋法檢測病毒的滴度.

1.3.3 慢病毒轉染

將P2代 PDBM-MSCs 以 5×103/cm2的細胞密度接種于六孔板中,完全的培養基成分為 LG-DMEM,10% FBS,1×青鏈霉素,10 ng/mL bFGF,置于二氧化碳培養箱中培養24 h,分別加入3種 pLKO.1 puro-LIF-down 抑制表達慢病毒及陰性對照組pLKO.1-puro-Scramble,繼續培養 12 h 后更換新鮮培養液,繼續培養48 h后加入嘌呤霉素篩選陽性轉染克隆.應用 q-PCR 檢測LIFmRNA 表達水平.

1.4 q-PCR 檢測

選P2代PDBM-MSCs分別進行pLKO.1 puro-LIF-down抑制表達慢病毒及陰性對照組pLKO.1-puro-Scramble感染72 h后的細胞,使用Rneasy MiNi Kit 提取總 RNA,方法參照試劑盒說明書進行.PrimeScript RT reagent Kit試劑盒逆轉錄為cDNA,方法參照廠商說明書.FastStart Essential DNA Green Master 檢測LIF、CDK2、CCNB2、CCND3、P53、P16、P27、Caspase3等基因在 mRNA 水平的表達量,方法參照廠商說明書.q-PCR循環95 ℃變性3 min,95 ℃ 10 s、58 ℃～60 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s,循環 40 次.用于擴增的引物列于表 2 中.

表2 引物序列

1.5 統計學分析

所有結果均來自至少3個獨立的實驗.應用統計軟件 SPSS for Windows 13.0 t 檢驗來確定差異顯著性.P<0.05 時為差異顯著.

2 結果

2.1 LIF RNAi 慢病毒重組質粒構建與篩選

DNA測序結果證明 3 個重組質粒pLKO.1 puro-LIF-down中的目的片段均與預期的序列一致(圖 1),說明目的片段已成功克隆至慢病毒表達載體中.將重組質粒pLKO.1 puro-LIF-down與空質粒pLKO.1-puro-Scramble分別包裝至HEK293T細胞 48 h 后,分別對其病毒滴度進行測定,結果顯示重組質粒pLKO.1 puro-LIF-down-1的病毒滴度為(1×106TU/mL),pLKO.1 puro-LIF-down-2的病毒滴度為(1.5×106TU/mL),pLKO.1 puro-LIF-down-3的病毒滴度為(0.9×106TU/mL),對照組空質粒pLKO.1-puro-Scramble的病毒滴度為(3×106TU/mL).

圖1 重組質粒 pLKO.1 puro-LIF-down 中的目的片段測序

2.2 LIF RNAi 慢病毒轉染 PDBM-MSCs

將 PDBM-MSCs 分別用重組質粒 pLKO.1 puro-LIF-down 慢病毒與空質粒 pLKO.1-puro-Scramble 慢病毒進行感染,72 h 后空質粒 pLKO.1-puro-Scramble 組細胞增殖融合至 80%～90%,呈旋渦狀或簇狀有序排列(圖2-A),而LIF抑制組細胞增殖融合至 60%～70%,細胞排列不規則(圖2-A).采用 q-PCR 的方法檢測 pLKO.1 puro-LIF-down 慢病毒對 PDBM-MSCs 中LIF的抑制效果,結果顯示感染 3 種慢病毒后 PDBM-MSCs 的LIF在 mRNA 水平上的表達量相對于空質粒 pLKO.1-puro-Scramble 慢病毒均顯著降低(圖2-B),但是相比于 pLKO.1 puro-LIF-down-2(0.80±0.02)、pLKO.1 puro-LIF-down-3(0.74±0.17)的抑制作用 pLKO.1 puro-LIF-down-1(0.55±0.03)抑制效果更為顯著(圖2-B),因此本實驗后期均采用 pLKO.1 puro-LIF-down-1 慢病毒作為實驗材料.

(A)LIF抑制慢病毒感染后72 h后PDBM-MSCs生長狀態(200×);(B)抑制慢病毒感染后PDBM-MSCs的LIF在mRNA水平上的相對表達量

2.3 LIF 抑制后對 PDBM-MSCs 生長影響

將PDBM-MSCs分別用重組質粒pLKO.1 puro-LIF-down-1慢病毒與空質粒pLKO.1-puro-Scramble慢病毒進行感染,72 h后觀察空質粒組細胞融合率達明顯高于LIF抑制組細胞.用q-PCR的方法對LIF抑制后PDBM-MSCs關鍵周期基因檢測顯示CDK2(P=0.028 2)、CCNB2(P=0.000 1)及CCND3(P=0.008 4)等促周期基因在mRNA水平上顯著下調,而CCNYL1 也呈下降趨勢(圖3-A).同時對凋亡分子P53(P=0.001 8)、P16(P=0.000 1)、P27(P<0.000 1)、Caspase3(P=0.002 7)等進行檢測結果顯示這些分子均在mRNA水平上顯著提高(圖3-B).表明LIF抑制能夠顯著的抑制PDBM-MSCs周期,同時促進細胞發生凋亡.

(A)LIF抑制慢病毒感染后PDBM-MSCs周期基因的表達情況;(B)LIF抑制慢病毒感染后PDBM-MSCs凋亡基因的表達情況

2.4 LIF抑制后對PDBM-MSCs干性影響

為了研究LIF對PDBM-MSCs的干性是否產生影響,細胞同上述處理后,對PDBM-MSCs的干性分子表達進行檢測,結果發現,LIF抑制后PDBM-MSCs的干性分子KLF4(P=0.009 8)、SOX2(P<0.000 1)在mRNA水平上顯著下調(圖4),表明LIF對 PDBM-MSCs 的干性起到維持作用.

圖4 LIF 抑制后 PDBM-MSCs 干性基因的表達情況

3 討論

MSCs 具有跨系譜,甚至跨胚層分化的潛能,可分化成多種組織細胞[18].研究發現,MSCs 具有去分化和跨胚層轉分化能力,且在這種轉分化過程中,MSCs 分化的是首先進行去分化,回到原始狀態再轉分化為其他組織.而 BM-MSCs 由于具有強大的增殖能力和跨胚層分化潛能的同時也具有免疫調節功能等特性,在細胞治療中具有潛在的應用價值,是研究大熊貓等珍貴野生動物干細胞的寶貴資源.本研究篩選所得LIF表達抑制的 MSCs 為進一步研究大熊貓干細胞分化機制提供了數據及材料支撐.

LIF 是一種多效性細胞因子,具有廣泛的活性,其功能性受體存在于多種器官中,包括肝[19]、骨[20]、子宮[21]、腎和中樞神經系統[22]等.研究發現 LIF 在小鼠胚胎干細胞中起到抑制分化保持在全能狀態的作用,并能夠有效地促進其自我更新[23];Harris 等研究表明 LIF具有促進牛成纖維細胞重編程為多能干細胞的潛力,也證實了其在牛多能干細胞分離培養以及建系上的潛力[24];Oskowitz 等研究證明 LIF對維持 MSCs 功能具有重要作用,如維持 MSCs 的干性抑制成脂肪、成骨的分化[17],以上結果表明 LIF 是維持細胞干性的重要調控分子.本研究采取 RNAi 干擾的方式降低了PDBM-MSCs 的LIFmRNA 的表達水平,同時定量檢測結果顯示 BM-MSCs 的干性標記基因KLF4、SOX2 的表達量伴隨著LIF的下調呈現出顯著下調趨勢.說明本研究所得LIF抑制后 BM-MSCs 的干性下降這一結果與前人的研究相一致.同時 Jiang 等發現LIF對間充質干細胞的生長起促進作用[25],同樣在本次研究過程中發現,降低 BM-MSCs 的LIF表達水平后,相關周期調控基因CDK2、CCNB2、CCND3 顯著下調,關鍵凋亡基因P53、P16、P27、caspase3 的表達顯著上調,也證實了LIF對大熊貓間充質干細胞的生長起促進作用,這一結果與前人的研究結果也是一致的.進一步證明本研究構建的大熊貓LIFRNAi 質粒在 BM-MSCs 表達是成功的.

通過 q-PCR 的方法檢測LIF在 RNA 水平上的變化,結果顯示與空質粒 pLKO.1-puro-Scramble 對照組相比感染重組質粒 pLKO.1 puro-LIF-down-1 后PDBM-MSCs 的LIF在 RNA 水平上顯著下調.與小鼠子宮內膜細胞[26]LIF干擾效率相比,此次對 PDBM-MSCs 進行LIF干擾后其干擾效率較低,這可能是干擾位點、條件及方式不合適造成的,還需繼續探索.然而,感染重組質粒 pLKO.1 puro-LIF-down-1 病毒的細胞與空質粒 pLKO.1-puro-Scramble 對照組相比也表現出生長被抑制以及干性下降的趨勢,這說明該LIF抑制載體已經發揮了其生物學功能.本次研究由于沒有針對大熊貓的抗體,因此我們只能選取抗人或大鼠的 LIF 抗體進行 Western Blot 蛋白分析,但是無論是抗人或大鼠的抗體都未檢測出陽性特異結合(數據未給出),這可能是由于PDBM-MSCs 中 LIF 的肽段同源性與人或大鼠相差較大,因此開發大熊貓特異的 LIF 抗體進一步完善實驗結果是我們下一步研究所必須的.

4 結論

本研究成功構建了大熊貓的LIFRNAi 慢病毒載體,通過感染的方式成功轉入PDBM-MSCs 中.經試驗證明大熊貓LIF對 BM-MSCs 的生長及干性均起到調節的作用,為LIF在大熊貓干細胞中的功能研究提供了一定的技術及理論支撐.然而,LIF在大熊貓干細胞生長、分化過程中所涉及的具體調控機制目前尚不明確,還需進一步進行研究.