酸櫻桃離體快繁體系研究

楊囡君

(商丘職業技術學院,河南 商丘 476100)

園藝學上的核果類是指植物分類學上薔薇科李亞科Drupaceae(Prunoideae) 李屬(PrunusLinn)果實為核果的一類果樹[1],通常包括櫻桃、桃、李、杏等,屬于我國的果樹生產方面重要的種類,其在生產上常采取種子繁殖和無性繁殖.種子繁殖簡單易行、成本低廉,但苗木生產速度較慢,苗質較差,且易出現品種變異問題,這已成為制約核果類果樹生產發展的限制因素[2].此外,核果類果樹種質資源的保存采用田間保存的方法,占地面積大、管理經費高,而且一旦遇到環境的威脅或危害性病蟲害,可能導致種質資源的丟失,而利用組織培養的方法可以克服上述的缺點.

櫻桃的離體培養研究始于20世紀80年代[3-4],經過20多年的發展,目前已在莖尖和莖段培養、葉片離體培養、不定根培養、胚培養等許多領域都有較為關鍵的突破.

提升櫻桃繁殖率可以運用莖尖、莖段進行培養,這在較短的時間內即可完成,還能夠根據其特點進行分化而取得植株再生.總之,這一優勢在無土苗木領域處于非常關鍵的地位.

本試驗的目的是以我國核果類果樹常用的砧木酸櫻桃為試材,建立并完善其離體快繁體系,并保存這些果樹的種質資源,為未來基礎理論研究提供所需的批量化性狀相同的試驗苗木.同時,有助于苗木砧木生產方面的推廣應用,給轉基因工程打下良好的基礎,也為合理保護核果類果樹的種質資源及研究其離體保存技術做出貢獻.

1 材料與方法

1.1 材料

酸櫻桃 ‘CAB’砧木可以使接穗的花期推遲,從而可以避開晚霜期,使接穗不受凍害.其耐寒性、耐旱性較強,對土壤條件要求不高,實生繁殖時,根系發達,與甜櫻桃品種的嫁接親和力很強,且有矮化作用.

酸櫻桃品種‘CAB’于2020年5月初由北京市的農業科學院林業果樹研究所提供.

1.2 方法

1.2.1 外植體處理

外植體是來自于酸櫻桃根蘗苗的莖尖以及帶腋芽的莖段部分外植體,經自來水沖洗完成后,分別剪制1 cm左右莖段,然后放置超凈工作臺中采用2種殺菌方法:1)75%乙醇30 s+0.1%升汞5 min;2)75%乙醇30 s+0.1%升汞7 min,再用無菌水沖洗5次,多余水分用無菌濾紙吸干[5-6].統計接種成活率:

成活率=接種成活外植體數/接種外植體總數×100%.

1.2.2 培養基及培養條件

初代培養基選擇櫻桃組織培養常用的MS[7-8](瓊脂6 g·L-1、蔗糖30 g·L-1、pH5.8)和F14(瓊脂6 g·L-1、蔗糖20 g·L-1、pH5.4)培養基[1],[3].將培養基分裝到100 ml三角瓶中,每瓶分裝大約50 ml,在1標準大氣壓121℃下,保持壓力15 min,高壓滅菌.培養設定的光照強度是1800 lx-2000 lx,一天的光照時間是10 h,溫度設定的是23±2℃.培養基配制、滅菌方法以及培養條件,下同.

1.2.3 增殖培養

增殖培養基以篩選出的初代培養基為基本培養基,添加不同濃度配比的生長素和細胞分裂素,共12種處理組合.其中,IBA設3個水平,分別為0.1 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1;6-BA設4個水平,分別為0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1.

每個處理均接種10株,完成3次的重復,培養時間為1個月,再仔細察看,計算其增殖的系數、所產出的新梢的有效數量(指那些分化苗的長度是大于1 cm的植株)及所生長出的有效新梢的所占比的概率.

增殖的系數=參與進行的分化苗的總數量/實驗所用接種的數量.

產出的有效新梢占比的概率=生產出的有效新梢的數量/參與進行的分化苗的總數量×100%.

1.2.4 生根培養及移栽基質的篩選

本試驗主要運用了2種方式來開展具體的生根測試:

1) 采用高濃度的生長素苗基浸蘸的方式.用經過高壓滅菌濃度分別為100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1的IBA浸蘸無菌植株的基部5 min、10 min、15 min、20 min、30 min,后將其接種到1/2MS空白培養基中,共15種處理.

2) 給1/2MS培養基添加濃度分別為0 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1的IBA,共5種處理.

平均每種的接種數量都是30株.通過一個月的培育,計算其生根的數量(即參與生根的植株的數目數值)、產出生根的所占比概率、所參與生根的平均的根長度.

產出生根的所占比概率=所生根的數量/參與進行接種的總數量值×100%.

所生根的平均的根長度=總根共有的長度之和/所有的根數量.

挑選出長度大概為2 cm,并且根的長勢大致相同的所生根苗,再進行3-5天的開蓋煉苗后,再把苗拿出來,將根上面的瓊脂清洗干凈,隨后將其放置進通過高壓滅菌的河砂、蛭石以及營養土與蛭石比例是1∶1的基質里面.移入栽植的成活率與移栽后1周的溫度及濕度有很大關系,因此在移栽時要保持溫度適宜,且在移栽的第1周要注意保濕和通風,以提高成活率.

以上數據處理采用DPS數據處理分析軟件進行分析.統計方法及數據處理方法,下同.

2 結果與分析

2.1 不同消毒方法和培養基對成苗的影響

通過濃度0.1%升汞對外植體加以消毒處置.由于升汞對外植體存毒害,用此點進行了預檢.預檢測結果顯示:消毒時間為5 min、7 min時,外植體成活的概率分別是66.9%和83.2%,所以消毒時間確定為7 min.

圖1 不同培養基的初代培養

將選用的植株培養30天,這樣其頂芽與莖段可以不再需愈傷組織的時間,就能直接長出新的不定芽.而被放置在MS培養基里面的那些無菌苗,呈現出翠綠的色澤,成長茂盛.處于F14培養基中的無菌苗,呈現出較重的玻璃化情況(如圖1所示),生長點褐化死亡.F14也是比較經常采用的櫻桃組織培養基,可在此次酸櫻桃培育生長的時候,選用F14當作初代的培養基,這也造成呈現出莖尖的生長點形成了褐化死亡,以及還有玻璃化的嚴重情形,造成這些情形的原因是酸櫻桃的基因類型跟其他的櫻桃的品種屬性可能存在差異性.另外,楊振國等[9]的酸櫻桃玻璃化苗研究結論表明:蔗糖濃度為20 g·L-1時,約有1/5的酸櫻桃出現了玻璃化苗,而且蔗糖濃度與玻璃苗的數量呈負相關,可見蔗糖含量的降低是導致F14培養基試管苗出現玻璃化的主要因素.因此,本試驗所篩選出的MS培養基更適宜于培養初代酸櫻桃.

2.2 不同濃度外源激素對酸櫻桃增殖的影響

Wilkins[10]以前記載過BA與IBA均為酸櫻桃的擴大繁殖十分適合采用的激素,所以本試驗也把側重點放在了濃度不一樣的BA與IBA激素方面,主要分析它們分別在酸櫻桃的實際生長以及擴大繁殖過程中所起到的成效,結果如表1所示.酸櫻桃增殖培養基采用12個處理組合,結果表明,編號為1、2、3、4(其BA的濃度不一樣,分別是0.5 mg·L-1、1.0 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1,而IBA的濃度一樣,都是0.1 mg·L-1)的培養基在進行培養時,植株矮小,增殖系數低,且有黃化和死亡的情況發生;相反,在編號為7、8、11、12(其BA的濃度較高,BA濃度分別為1.5 mg·L-1、1.5 mg·L-1、1.5 mg·L-1、2.0 mg·L-1)的培養基內培養得酸櫻桃,則增殖的系數很高.這一結果在編號為12(BA濃度是2.0 mg·L-1,IBA濃度是0.3 mg·L-1)的培養基內最為明顯,其增殖的系數達到6.1,但因為該培養基的分裂素濃度也比較高,其分化苗也均呈現出程度不一的玻璃化.而在編號分別為5、6、9、10(其IBA濃度分別是0.2 mg·L-1、0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.3 mg·L-1)的培養基內,酸櫻桃的分化苗生長勢良好.其中,編號5的培養基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1)中的酸櫻桃的增殖系數的數值達到了4.5,所產生出的有效的新梢(主要是指那些新梢長度在1 cm以上)的數值占比概率則是83.6%.可見,編號5的培養基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1)是酸櫻桃增殖的最優培養基(如圖2所示).編號是9的培養基(MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.3 mg·L-1)內的植株生長最是茁壯,都是節間產生的分化苗,將其同其他的培養基進行對比便會發現,這一培養基是最佳的適用酸櫻桃健壯生長的培養基.

圖2 離體增殖的酸櫻桃苗

2.3 不同生根方式對酸櫻桃生根的影響

苗基浸蘸方法對于酸櫻桃生根產生的影響.酸櫻桃苗基在100 mg·L-1IBA里分別浸泡20 min、30 min,以及在200 mg·L-1IBA浸泡5min后(如表2所示),生根效果均較好,生根率可達100%,平均根長5.1 cm-8.9 cm(如圖3所示),即低濃度長時間浸蘸和高濃度短時間浸蘸均可達到較好的效果.但是當IBA濃度達到200 mg·L-1,處理時間20 min以上時,則無法生根,只形成大的愈傷組織.其原因可能是生長素可以促進根原基形成,而幼根的生長則不需要高濃度的生長素,否則會起到抑制根系的生長作用[11].

表2 苗基浸蘸方法對于酸櫻桃生根產生的影響

圖3 苗基浸蘸法生根苗

不同的IBA濃度對于酸櫻桃生根產生的影響,如表3所示.酸櫻桃以1/2 MS為基本培養基時,均有生根現象產生.在1/2 MS培養基上不添加任何生長調節劑也可以生根,說明酸櫻桃較易產生根系.隨著生長素IBA濃度的增加,產生根的概率也開始增加,IBA濃度繼續增加后生根概率開始減少,平均根長也隨之變短,出現大量的愈傷組織,即在高濃度生長素IBA的作用下,產生了大量的根原基.當IBA濃度為0.5 mg·L-1時,酸櫻桃平均生根率達到了76.7%,根長平均為2.1 cm(如圖4所示).比較兩種生根方式可以發現:第一種苗基浸蘸法,比較容易生根而且根系也有較快的生長速度,這可以減少生根以及移植栽培的時間,但是操作過程比較繁雜;第二種普通生根法,操作過程比較容易,但生根的概率比較小,根系的生長速度也相對緩慢,需要一個月才能正常移植栽培.所以,選擇哪一種生根的方法,可根據具體的情況和需求來定.

表3 不同的IBA濃度對于酸櫻桃生根產生的影響

圖4 普通生根法生根苗(1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1 )

2.4 不同移栽基質對酸櫻桃試管苗成活率的影響

在移栽植株的生長狀況、根長、移栽環境的溫度都保持一致的情況下,各種基質中植株的移入栽植的成活概率也存在著較大的差別,如表4所示.如果基質是河砂的時候,移入栽植的成活概率最小,可達到20%;在蛭石∶營養土(1∶1)中,移栽成活率可達60%;蛭石中移栽成活率最高可達80%.由此可以得出,因河砂保水性太差,使剛剛移栽的新植株得不到充分的濕度,致使植株移栽成活率最低;蛭石∶營養土(1∶1)基質環境的透氣性比單獨使用蛭石差,使移栽新植株的根得不到更好的呼吸,可能導致根部腐爛,從而致使植株死亡.移栽30天后,長出新葉的植株移入溫室,可全部成活.

表4 不同的基質對于酸櫻桃的成活概率產生的影響

3 結論與討論

3.1 結論

以酸櫻桃春季根孽苗的莖尖和帶腋芽的莖段為外植體,用濃度75%乙醇浸泡30 s,濃度0.1%升汞處理7 min,成活率可達83.2%;適合酸櫻桃初代培養的基本培養基為MS培養基;最佳增殖培養基為MS+BA 0.5 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1,增殖系數為4.5;最佳生根方式為 200 mg·L-1IBA浸蘸無菌苗基部5 min,生根率高達100%,平均根長8.6 cm;最佳移栽基質為蛭石,成活率可達80%.

3.2 討論

3.2.1 植體的選擇及殺菌處理

在組織培養的過程中,得到無菌株系是建立離體快繁體系最基礎,也是最關鍵的一步.外植體本身的情況,例如品類特征、培育的階段、年齡與生理情況、大小情況和其處在樹體以及枝條部分的具體位置等等,都可以對外植體本身的細胞的全能屬性以及組織部分的器官再生屬性的表現產生影響.所以,篩選出比較適用的外植體,在繁殖微體的成功與否上有著非常關鍵的意義.

外植體常選用幼年型材料或成年樹上的幼態部分,如靠近基部的萌生枝條、根孽條等[12].取本試驗的酸櫻桃的實生苗或者新生枝條等幼嫩材料作為外植體均能較快地建立起無菌培養體系.

常用的植物消毒滅菌劑有次氯酸鹽、升汞、漂白粉、過氧化氫及抗生素.升汞滅菌效果最好,但其殘留最難除去,而且對植物的組織來說傷害也較為明顯,所以需要對它的消毒時長加以嚴格管控,通常不能讓其消毒時長多于10 min,且使用濃度為0.1%-0.2%.針對不同時期、種類的外植體,應選擇合適的消毒劑和消毒方法.

3.2.2 培養基的選擇

酸櫻桃和山杏的基本培養基為MS培養基,山桃和‘麗春’的基本培養基為G培養基,光核桃的基本培養基為MS-R培養基.

本試驗選用常規F14培養基作為酸櫻桃的初代培養基,但出現了死亡和玻璃苗,這可能是因為酸櫻桃特殊的基因型所引起的.但楊振國等[9]的研究表明,蔗糖濃度為20 g· L-1時,可使1/5的酸櫻桃出現了玻璃化苗,而且蔗糖濃度與玻璃苗的數量呈負相關.所以,也可以認為,出現玻璃苗的原因是F14培養基蔗糖含量低.

本試驗篩選出了適合酸櫻桃快繁的初代培養基和增殖培養基,實現了試驗預期目標,為建立酸櫻桃快繁體系打下了良好基礎.但是,在試驗中發現的一些問題還亟待解決,例如培養基易被污染的問題,這需要廣大同仁們持續努力,不斷優化試驗程序步驟.