三七皂苷血清外泌體對腦出血大鼠炎癥損傷干預的研究*

王 鶴 周青云 戴關海 陳 佳#

1 杭州市臨平區中醫院 浙江杭州 311106

2 浙江中醫藥大學 浙江杭州 310053

3 浙江省中醫藥研究院 浙江杭州 310007

腦出血（ICH）是最常見的腦卒中亞型，是腦血管病中極為危重的病變之一，具有較高的致死率和致殘率，占卒中的10%～15%[1]。血瘀是貫穿ICH 整個過程的特點，活血化瘀是該病的總治法。三七皂苷（Panax Notoginseng Saponin，PNS）是中藥三七的提取物，多項研究表明其對腦缺血再灌注、腦血腫吸收、腦組織及神經損傷修復均有明顯療效[2，3]。但三七皂苷分子量大，脂溶性低，不易透過血腦屏障（blood brain barrier，BBB），影響其藥效的發揮[4]。外泌體是一類直徑40～160nm 的納米級囊泡小體，作為信息的載體，可以靶向性傳遞生物學信息，通過表面粘附蛋白的相互作用轉運到周圍或者遠程的受體細胞從而影響受體細胞的生物功能[5],在炎癥、損傷、腫瘤、免疫等疾病治療方面的作用已被公認，同時，外泌體具有特殊的脂質雙層膜結構，可作為治療藥物的載體，高效地透過血腦屏障，更好地發揮中藥的療效[6]。本研究采用自體血注射構建ICH大鼠模型，給予三七皂苷血清外泌體干預，觀察其對ICH 大鼠腦組織炎癥的影響，為中藥治療ICH 提供新的思路。

1 實驗材料

1.1 動物：雄性Wistar大鼠40只，體質量（200±20）g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2021-0006，實驗動物使用合格證號：SCXK（浙）2019-0010。本研究經浙江省中醫藥研究院倫理委員會審批，倫理審批號：浙中研動物倫理審字第〔2022〕049號。

1.2 藥物：三七皂苷，購于廣西梧州制藥股份有限公司。

1.3 主要儀器及耗材：全自動立體定向儀（71000，瑞沃德）、超高速離心機（Optima XPN-100，貝克曼）、透射電子顯微鏡（JE-OL）、納米粒徑檢測儀（ZetaView PMX 110）、Wes 全自動蛋白質印跡定量分析系統（Protein Simple）、Anti-CD63 抗體、Anti-TSG101 抗體和Anti-Hsp70 抗體（abcom），PrimeScript RT reagent Kit 和TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（TaKaRa）。Rat IL1β ELISA Assay Kit（Proteintech）、Rat IL-6 ELISA Assay Kit、Rat NF-κB ELISA Assay Kit（CUSABIO）。

2 實驗方法

2.1 三七皂苷血清外泌體制備、提取及鑒定：三七皂苷100mg/kg·day 連續腹腔注射7 天后，收集血清。采用經典差數超速離心法獲取三七皂苷血清外泌體。離心速度分別為：300×g，4℃，10min 取上清；3000×g，4℃，15min取上清；10000×g，4℃，15min取上清，過0.22μm濾器；繼續離心100000×g，4℃，120min，取沉淀重懸至50～200μL PBS 中，此為外泌體混懸液，-80℃冰箱保存備用。通過透射電子顯微鏡觀察外泌體形態、納米顆粒跟蹤分析平臺分析外泌體濃度和粒徑、全自動Western Blot分析儀檢測外泌體標志性蛋白表達。

2.2 腦出血大鼠模型構建及分組：Wistar 大鼠稱重，以0.3mL/100g 的10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后將動物俯臥固定在立體定位儀上：沿頭皮正中作一長10mm 切口，暴露前囟，定位（前囟前0.2mm，中線右旁開3mm，垂直進針5.5mm為大鼠右側尾殼核區），用小型牙科鉆，鉆透顱骨至硬腦膜處；微量注射器穿刺尾動脈，抽取自體動脈血，采用“兩次注血法”（進針至尾狀核，先注入10μL，停針2min，繼續緩慢均勻注入40μL）；局部用醫用骨蠟封閉，皮膚逐層縫合；術后大鼠單獨飼養，觀察自由活動及進食水，根據Zea Longa 評分方法，以評分大于3 分為造模成功。將造模的大鼠隨機分成三七皂苷血清外泌體組（三七皂苷血清外泌體，20μg/day）、三七皂苷組（三七皂苷，100mg/kg）、模型組（等體積生理鹽水），另設正常大鼠（等體積生理鹽水）作為對照組。干預方式均采用尾靜脈注射，連續10天。

2.3 指標檢測：病理：實驗結束，麻醉大鼠后解剖取材，標本為全腦組織。每組取3只大鼠腦組織在福爾馬林中充分固定、石蠟包埋及切片，蘇木素染色及中性樹膠封片，通過光學顯微鏡觀察，采集圖像并分析。RT-PCR 檢測腦組織中炎癥因子核酸水平：使用Trizol 試劑提取腦組織損傷部位總RNA；采用Prime Scrip RT試劑盒逆轉錄為cDNA；通過TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒檢測炎癥基因NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α 的表達水平。引物委托上海生工生物有限公司設計合成引物，內源性參考基因為β-actin?；蛐蛄袨椋篘F-κB（FTGTGGTGGAGGACTTGCTGAGG；RAGTGCTGCCTTGCTGTTCTTGAG）NLRP-3（FCTGCTGTGCGTGGGACTGAAG；R-AGAACCAATG CGAGATCCTGACAAC）IL-6（F-ACTTCCAGCCAGTTGCCTTCTTG；R-TGGTCTGTTGTGGGTGGTATCCTC）TNF-α（FCACCACGCTCTTCTGTCTACTGAAC；RTGGGCTACGGGCTTGTCACTC）β-actin（FGGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA；R-GACTCATCGTA CTCCTGCCTGCTG）。ELISA 檢測腦組織勻漿中NF-κB、IL-6、IL1β水平：取腦出血周圍組織100mg勻漿處理，按照ELISA試劑盒操作方法檢測。

3 統計學方法

數據由SPSS 25 軟件處理。各組間計量資料以均數±標準差表示，差異分析比較采用ANOVA單因素方差分析或秩和檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

4 結果

4.1 外泌體鑒定：采用經典的差速超速離心法提取血清外泌體，通過透射電子顯微鏡檢測呈典型的雙層脂膜的類圓形囊泡結構（見圖1A）；納米顆粒追蹤分析（NTA）實驗顯示直徑為113.1nm 外泌體的比例為96.6%，顆粒濃度為2.8×1010個/mL（見圖1B）；全自動Western Blot蛋白表達分析儀分析結果顯示外泌體特征性標志蛋白TSG101、CD63、Hsp70 均呈陽性表達（見圖1C）。證實所提取的微囊泡為血清外泌體。

圖1 外泌體鑒定結果

4.2 對各組腦組織病理影響：對照組的腦組織結構完整，無炎性細胞浸潤；模型組出血部位腦組織結構嚴重紊亂，可見大量紅細胞，炎癥細胞浸潤嚴重，水腫明顯；三七皂苷組及三七皂苷外泌體組腦出血部位表現紅細胞及炎癥細胞呈不同程度的減少，以三七皂苷血清外泌體組最為顯著。見圖2。

圖2 腦組織病理結果（HE染色，200×）

4.3 對腦出血損傷周圍組織中炎癥核酸水平表達影響：RT-PCR 結果顯示，與對照組比較，模型組腦出血周圍腦組織中炎癥因子NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α mRNA 因子核酸水平表達明顯上調，而經過三七皂苷及三七皂苷血清外泌體治療后，兩組的炎癥因子NF-κB、NLRP-3、IL-6、TNF-α mRNA 均有下調，其中，三七皂苷血清外泌體組的作用效應顯著優于三七皂苷組。見表1。

表1 三七皂苷血清外泌體對腦組織中炎癥因子mRNA表達的影響（±s，2-△△ct）

表1 三七皂苷血清外泌體對腦組織中炎癥因子mRNA表達的影響（±s，2-△△ct）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

分組對照組模型組三七皂苷組三七皂苷血清外泌體組n6 6 6 6 NF-κB 1.33±0.19#4.83±1.62*3.07±1.22*1.55±0.35#NLRP-3 1.56±0.34#3.00±0.94*2.61±0.53*1.95±0.30#IL-6 1.74±0.63#3.16±1.08*2.94±1.16*1.93±0.66#TNF-α 0.59±0.35#1.62±0.19*1.28±0.26*0.73±0.13#

4.4 對腦出血損傷周圍組織中炎癥蛋白水平表達影響：ELISA 結果顯示，與對照組比較，模型組腦出血周圍腦組織中NF-κB、IL-1β及IL-6含量顯著增加。經過三七皂苷及三七皂苷血清外泌體治療后，兩組的NF-κB、IL-1β及IL-6含量均明顯降低，其中，以三七皂苷血清外泌體組下降最為顯著。見表2。

表2 三七皂苷血清外泌體對腦組織中炎癥因子蛋白水平影響（±s，pg/mL）

表2 三七皂苷血清外泌體對腦組織中炎癥因子蛋白水平影響（±s，pg/mL）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

分組對照組模型組三七皂苷組三七皂苷血清外泌體組n6 6 6 6 NF-κB 1.41±0.35#3.97±0.67*3.02±0.55*1.97±0.51#IL-1β 31.35± 8.17#102.50±16.15*77.32±15.33*46.15±15.84#IL-6 33.08±5.70#75.53±7.36*55.20±3.88*39.32±3.94#

5 討論

研究顯示ICH 逐年增高的發病率，高昂的醫療費用，患者勞動及自理能力的缺失，造成了我國嚴重的社會和家庭負擔，早期有效的防治是減少并發癥的有效手段[7]。ICH 是一種出血性卒中，其特征是血管中的血液破入腦實質，ICH 發生后，局部中樞系統和全身免疫應答相繼被激活，血腫、促炎癥反應及氧化應激等造成了腦組織損傷[8]。促炎癥細胞因子NF-κB、NLRP-3、TNFα和IL-6等增加以及白細胞浸潤導致內皮和細胞外基質的功能障礙，與腦損傷和長期殘疾密切相關[9，10]。促進血腫吸收，減輕炎癥水平對腦組織及神經系統恢復極為重要[11]。

ICH 中醫上歸屬于中風范疇，病位在腦，由于多種因素導致血行滯緩，腦血脈運行不暢，血溢出脈外，瘀阻腦絡而病。故從形態學及病理學上不難得出“瘀血”為該病常見證型[12]。針對血瘀證，要以活血化瘀為其主要治療方法。三七素有“止血不留瘀，活血不傷正”的美名，為傷科用藥之首選。在神經系統疾病治療血瘀證有著一定的臨床基礎。本研究著眼于腦組織炎癥及病理改善，采用三七有效成分三七皂苷制備血清外泌體，在治療形式上是一種創新。通過研究發現，三七皂苷血清外泌體可更好地改善腦出血導致的血腫、炎癥、損傷等，這與外泌體在治療神經系統疾病相關研究的結果一致[5]。這可能與其跨血腦屏障的治療藥物的輸送，更好發揮腦組織內藥效有關。為中藥治療神經系統疾病提供了新手段。

綜上，本研究表明三七皂苷血清外泌體作為生物活性物質可有效改善大鼠腦出血后腦組織炎癥水平，緩解病理損傷，對腦出血損傷具有一定保護作用。