犬羊膜有效成分的測定及保存條件的篩選

張佳韌，李 慧，王瑛琪，張 備，薛沾枚，趙 燦，生樹新，鄔立剛*

（ 1. 黑龍江農業職業技術學院動物科學系，黑龍江 佳木斯 154002；2. 黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005 ）

羊膜是一種起源于胚胎外胚層的多功能組織，位于胎膜最內層，具有抗炎、抗新生血管生成、免疫調節、抗菌、抗纖維化、組織相容性良好等特性。羊膜是具有運輸功能的上皮細胞，常作為上皮基底膜替代物廣泛應用于眼部上皮組織修復，特別是眼表化學燒傷的治療[1-4]。人羊膜中存在轉化生長因子-β1（TGF-β1）、神經生長因子受體、肝細胞生長因子、表皮生長因子、堿性成纖維生長因子等潛在的有效成分[5-7]。同時，人羊膜中存在的羊膜上皮干細胞和人羊膜間充質干細胞具備分化成成纖維細胞的能力[8]，生物羊膜具備廣闊的臨床應用背景[9]。新鮮羊膜由于不易獲取、難以長期保存、手術縫合操作復雜等因素限制了其在眼病治療領域的應用。因此，羊膜上清液成為新鮮羊膜重要的替代產品。羊膜上清液對角膜損傷具有良好效果。蔣愛華[10]研究證明，羊膜提取液治療鼠角膜堿燒傷與羊膜覆蓋效果相當。也有研究發現，羊膜上清液可促進犬角膜潰瘍后角膜愈合，減少角膜瘢痕，但羊膜有效成分還未進行進一步測定[11]。本研究從3種羊膜上清液的制備方式中篩選最佳制備條件，同時從不同的保存條件中篩選最佳保存條件，并通過試驗檢查羊膜的一些有效成分，以期為揭示羊膜作用機制提供思路，為進一步利用羊膜及羊膜制品奠定基礎，為羊膜上清液制備及動物臨床試驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 新鮮犬羊膜

試驗所用的10 份新鮮羊膜（健康犬剖腹產的胎盤組織）來自校外實訓基地動物醫院。術前對所有孕犬進行血液常規檢查、血液生化檢查、犬瘟熱抗原檢測、犬細小病毒抗原檢測、犬冠狀病毒抗原檢測和犬布魯氏桿菌抗體檢測，檢查結果均未見異常。

1.1.2 儀器與試劑

臺式高速離心機、低溫多樣品組織研磨儀、微量組織勻漿研磨儀均購自天根科技有限公司；超凈工作臺購自中國檢測儀器；酶標儀購自賽默飛世爾科技有限公司。

慶大霉素、兩性霉素購自上海源葉生物科技有限公司；DMEM 液購自?？寺∩锘瘜W制品（北京）有限公司；生理鹽水購自青州堯王制藥公司；犬血管內皮細胞生長因子（bFGF）、基質金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP）、肝細胞生長（HGF）、TGF-β1 ELISA試劑盒以及BCA法蛋白含量測定試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 犬羊膜上清液制備

通過剖腹產取出的新鮮胎盤被放置在無菌容器內，在超凈工作臺內使用含有抗生素的生理鹽水對新鮮胎盤進行徹底清洗，反復進行3次以去除胎盤及相關附屬組織，僅剩羊膜及絨毛膜組織。使用組織剪鈍性剝離羊膜及絨毛膜，剔除羊膜中間的血管，完成剝離后使用含有抗生素的生理鹽水對羊膜進行反復沖洗3次。滅菌濾紙吸干羊膜上的水分，處理好的新鮮羊膜按照濕重5 g/份的標準進行統一剪切，隨機混合，為試驗1和試驗2提供羊膜樣品庫。

1.2.2 試驗設計

1.2.2.1 試驗1：處理方式對羊膜有效成分的影響

試驗分為常溫研磨組（C組）、低溫研磨組（D組）、干燥研磨組（G組）。每組均取10份羊膜樣本，C組和D組均使用高速組織研磨儀對每份羊膜樣本進行研磨，其中C組常溫研磨，D 組研磨過程中加入液氮，保證低溫環境研磨；G組羊膜樣本在35 ℃下低溫烘干24 h后再進行常溫研磨。高速研磨儀按照12 000 r/min 研磨5 min。充分研磨后加入離心管，按照質量比1∶1加入PBS磷酸鹽緩沖液進行稀釋。稀釋后樣本在搖床上充分振蕩20 min 后置于4 ℃高速離心機中8 000 r/min離心10 min，取上清液。

1.2.2.2 試驗2：保存方式對羊膜有效成分的影響

試驗分為DMEM研磨組、DMEM濕重組和凍干粉組，每組均取10份羊膜樣本。其中DMEM研磨組的新鮮羊膜均參考試驗1 的低溫研磨組（D 組）方式進行研磨，之后將新鮮羊膜直接制備成凍干粉；DMEM研磨組將凍干粉按質量比1∶1與DMEM液混合，使用細菌濾膜過濾后封裝在無菌的0.5 mL離心管內；凍干粉組未加DMEM液，其余步驟按照DMEM 研磨組無菌保存在離心管內；DMEM 濕重組直接將新鮮羊膜儲存在DMEM 液中，使用時再進行低溫研磨，開展檢測或應用。

1.2.3 犬羊膜上清液中相關成分含量檢測

將羊膜上清液制備當天記為第0 d，試驗1按要求每組隨機選3 份樣品，同試驗試劑一同置于室溫自然回溫1 h。試驗2于第0、20、40、80 d，每組分別隨機取出3份樣品，同試驗試劑一同置于室溫自然回溫1 h。

1.2.3.1 犬羊膜上清液中的有效成分含量

將50 μL不同濃度的標準品及試驗樣品加入包被好的孔板中。之后在每個標準品孔和羊膜上清液孔添加辣根過氧化酶（HRp）100 μL，使用封板膜封板后，置于恒溫箱孵育60 min。去除孔板液體，拍干，使用350 μL 清洗液洗板5次。徹底洗凈后，添加底物A和底物B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。最后加入終止液50 μL，15 min 內用酶標儀在波長為450 nm 測定各孔中的吸光度（OD）值，根據不同濃度的標準品所測的OD值繪制標準曲線。再根據各樣品的OD值，依據標準曲線測算相關有效成分含量。

1.2.3.2 蛋白含量

配置工作液，根據需要量按要求將試劑A和試劑B按50∶1的比例混合，蓋緊后充分混合；酶標儀預熱30 min，調節波長562 nm，蒸餾水調零。工作液60 ℃水浴預熱30 min。按照蒸餾水4 μL、標準品4 μL、待測液4 μL、工作液200 μL的劑量將對應試劑添加到96孔板中測定。

1.3 數據統計與分析

采用SPSS 20.0 軟件對數據進行統計分析。結果以“平均值±標準差”表示，P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 制備方法對犬羊膜上清液中有效成分含量的影響（見表1）

表1 制備方法對犬羊膜上清液中有效成分含量的影響Tab.1 Effect of preparation methods on the concentrations of active ingredient in canine amniotic membrane supernatant

由表1 可知，D 組犬羊膜上清液中bFGF 含量為73.58 ng/L，G 組的bFGF 含量為69.36 ng/L，D 組極顯著高于G 組（P＜0.01）；D 組犬羊膜上清液中TIMP、HGF、TGFβ1的含量均顯著高于G組（P＜0.05）。

2.2 保存條件對犬羊膜上清液中有效成分的影響

2.2.1 保存條件對犬羊膜上清液中bFGF 含量的影響（見表2）

表2 保存條件對犬羊膜上清液中bFGF含量的影響Tab.2 Effect of storage conditions on bFGF concentrations in canine amniotic membrane supernatant 單位：ng/L

由表2可知，第0 d，3組羊膜上清液中的bFGF含量在兩個保存溫度下差異不顯著（P＞0.05）；第20 d時，在4 ℃和-18 ℃條件下，凍干粉組bFGF 含量顯著低于DMEM 研磨組和DMEM 濕重組（P＜0.05）；第40 d 時，在4 ℃和-18 ℃條件下，凍干粉組bFGF含量極顯著高于DMEM研磨組和DMEM 濕重組（P＜0.01）；第80 d，在4 ℃和-18 ℃條件下，凍干粉組bFGF 含量極顯著高于DMEM 研磨組和DMEM濕重組（P＜0.01）。在-18 ℃條件下，第80 d 時凍干粉組犬羊膜上清液中bFGF含量顯著高于4 ℃（P＜0.05）。

2.2.2 保存條件對犬羊膜上清液中TIMP 含量的影響（見表3）

表3 保存條件對犬羊膜上清液中TIMP含量的影響Tab.3 Effect of storage conditions on TIMP concentrations in canine amniotic membrane supernatant 單位：ng/L

由表3 可知，第0、20 d，3 組羊膜上清液中TIMP 含量在兩個保存溫度下差異不顯著（P＞0.05）；第40 d時，-18 ℃條件下，凍干粉組羊膜上清液中TIMP 含量顯著高于DMEM 研磨組和DMEM 濕重組（P＜0.05）；第80 d，凍干粉組羊膜上清液中TIMP 含量極顯著高于DMEM 研磨組和DMEM濕重組（P＜0.01）。

2.2.3 保存條件對犬羊膜上清液中HGF 含量的影響（見表4）

表4 保存條件對犬羊膜上清液中HGF含量的影響Tab.4 Effect of storage conditions on HGF concentrations in canine amniotic membrane supernatant 單位：μg/L

由表4 可知，第0 d，3 組羊膜上清液HGF 含量在兩個保存溫度下差異均不顯著（P＞0.05）；第20 d 時，相同保存溫度下，凍干粉組羊膜上清液HGF 含量極顯著低于DMEM研磨組和DMEM濕重組（P＜0.01）。

2.2.4 保存條件對犬羊膜上清液中TGF-β1 含量的影響（見表5）

表5 保存條件對犬羊膜上清液中TGF-β1含量的影響Tab.5 Effect of storage conditions on TGF-β1 in canine amniotic membrane supernatant 單位：μg/L

由表5 可知，第0、20 d，3 組羊膜上清液中TGF-β1 含量在兩個保存溫度下差異均不顯著（P＞0.05）；第40 d 時，-18 ℃條件下凍干粉組犬羊膜上清液中TGF-β1含量顯著高于4 ℃條件（P＜0.05）；第80 d 時，在相同保存溫度下，凍干粉組-18 ℃條件下均極顯著高于DMEM 研磨組和DMEM濕重組（P＜0.01）。

3 討論

羊膜制品作為羊膜組織制備得到的潛在治療藥物，已在犬、兔子、大鼠等動物上進行了大量的試驗，研究顯示了羊膜制品安全性良好，具備促進傷口愈合，特別是角膜愈合的能力。王艷[12]發現，采用羊膜移植術治療角膜堿燒傷，羊膜具有抑制炎癥反應、抑制血管新生和瘢痕的形成、促進角膜損傷愈合的作用，對犬角膜堿燒傷具有一定臨床療效。蔣愛華[10]發現，羊膜提取液治療鼠角膜堿燒傷，可以有效抑制炎癥和后期新生血管再生，促進角膜上皮愈合，減少角膜混濁，對堿燒傷角膜具有綜合療效，效果與羊膜移植相當。但是目前對羊膜有效治療成分的研究較少，作用機制尚不明確。

本試驗采用3種不同制備方式對羊膜中潛在成分進行測定，結果發現，羊膜中含有較高成分的蛋白，蛋白質作為實現生物功能的重要物質，為羊膜制品發揮治療效果提供了可能。同時，本試驗檢測了羊膜上清液中bFGF、TIMP、HGF、TGF-β1 的含量，并顯示存在較高的組織濃度，與Dua等[13]和Choi等[14]的研究結論相符。

bFGF 是調控創面愈合的重要細胞因子，可增強細胞的有絲分裂活性，促進細胞快速分裂增殖。羅文娟等[15]研究表明，相對濃度為10 μg/L的bFGF具有促進貓角膜內皮細胞增殖的作用。本試驗檢測結果已經達到此濃度，因此，bFGF 可能在羊膜制品促進傷口愈合過程中發揮了重要作用。TIMP 作為基質金屬蛋白酶的抑制劑，可有效降低基質金屬蛋白酶（MMP）的濃度，改善創傷部位炎癥反應，以避免出現“呼吸爆發”。趙平等[16]研究發現，羊膜移植治療角膜堿燒傷術后，角膜中MMP 含量降低，TIMP 升高，表明羊膜可能通過提高角膜表達TIMP 的水平抑制MMP。本試驗繼續補充了這一結果，提示羊膜不僅能夠提高角膜中TIMP 的表達，羊膜上清液作為外用滴眼液還可以提供一定的補充，但檢測到的TIMP濃度較低，其在治療過程中發揮的作用還需繼續研究。

HGF作為一種多效生長因子，能夠促進角質細胞的增殖和遷移，以劑量依賴的方式促進毛細血管出芽生長和創面的再上皮化，發揮促進損傷修復的作用[17]。本試驗發現，隨著保存時間延長，HGF下降非常明顯，表明現有保存條件不足以維持HGF含量長期穩定，需要繼續尋找適宜保存條件。TGF-β1 是一種多效能生長因子，具有促血管生成、調節內皮細胞基因表達、增加包括膠原蛋白、纖維蛋白在內的細胞外基質形成等功能[18]。本試驗在羊膜中檢測到了較高濃度的TGF-β1，側面證明了羊膜治療角膜損傷時早期出現大量新生血管，TGF-β1可能發揮了重要作用。

本試驗發現，現階段保存條件下，隨著保存時間延長，羊膜中潛在有效成分出現不同程度的衰減，添加DMEM液對減緩早期有效成分含量下降起到了一定作用。但是中期保存時間不佳，可能是水溶液的環境加速了生物活性物質的降解。凍干粉作為一種重要的保存形式，雖然保存前期有效成分含量依然會有下降，但中期保存穩定性更好，可能相對干燥低溫的環境延緩了生物活性物質降解。在相同保存液條件下，-18 ℃更有利于保存。4、-18 ℃是大多數使用場景可提供的保存環境，普通使用場景難以提供-80 ℃或更低的溫度。此外，是否研磨對保存在DMEM液中的羊膜的有效成分的影響不顯著。由于DMEM保存液中存在一定濃度的蛋白質，但本試驗未對蛋白質含量進行檢測，待后續發現更好的檢測蛋白質含量手段，再對蛋白保存過程中的含量變化進行記錄。

4 結論

本試驗發現，犬羊膜存在一定含量的蛋白成分，同時存在不等含量的bFGF、TIMP 和TGF-β1 等具備生物學活性的有效成分，可能通過以上有效成分的作用路徑實現其作用效果。添加DMEM保存液成分的羊膜制品適合短期保存，凍干粉劑型適合中期保存，低溫冷凍（-18 ℃）可有效延緩相關有效成分的降解。本研究結果為犬羊膜中短期保存提供了一定參考。