跑臺運動對慢性應激大鼠抑郁行為及內質網應激介導的細胞凋亡和BDNF/TrkB表達的影響

崔建梅,宋艷麗,蘇英敏,周琛斐,楊子欣,李中華,蘇曉云,王曉鵬

近年來,運動療法在抑郁癥治療領域發展迅速,作為一種非藥物的方式,具有運動強度可控、無毒副作用且成本相對較低等優點[7]。經前期研究證實,連續28天CUMS可誘導大鼠焦慮及抑郁行為和前額葉皮質神經元損傷增強,而中等強度跑臺運動可以緩解這一趨勢[8]。并且Li等[9]的研究發現,腦卒中后24 h中等強度跑臺運動可顯著降低腦組織GRP78、PERK(蛋白激酶RNA樣內質網激酶)及CHOP蛋白(環磷酸腺苷反應元件結合轉錄因子同源蛋白)表達,神經缺損及腦水腫均顯著改善,提示跑臺運動可能通過降低內質網應激發揮神經保護作用。此外據鄧鈺等[10]研究可知,BDNF/TrkB通路在運動抗抑郁作用中起著重要的調節作用。Wang等[11]研究發現,抗抑郁藥硫化氫可在CUMS暴露大鼠中通過激活BDNF/TrkB通路抑制海馬內質網應激發揮抗抑郁樣作用。然而,長期運動能否通過激活前額葉皮質BDNF/TrkB通路及降低前額葉皮質內質網應激誘導的細胞凋亡改善CUMS大鼠抑郁樣行為還有待探討。PERK/eIF2α(真核翻譯起始因子2α)/CHOP是調控內質網應激的重要信號通路[12]。因此,本研究通過觀察4周中等強度跑臺運動對CUMS大鼠抑郁樣行為的影響,并通過測量前額葉皮質內質網應激蛋白(PERK、eIF2α、CHOP)及凋亡蛋白(Bax、Bcl-2)表達和BDNF、TrkB表達的影響,探討PERK /eIF2α/CHOP信號通路、Bcl2/Bax及BDNF/TrkB通路參與跑臺運動改善CUMS大鼠抑郁樣行為的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.2 試劑及儀器

兔抗大鼠PERK、eIF2α、CHOP、Bax、Bcl-2、BDNF及TrkB多克隆抗體,羊抗兔IgG二抗,兔抗鼠β-actin蛋白抗體,BCA試劑盒均購于武漢博士德生物有限公司;石蠟撈片機、石蠟切片機、恒溫展片機、Leica DM2500顯微鏡購于德國Leica公司;Himac CF15R高速低溫離心機購于日本Hitachi公司;圖像分析軟件ImageProPlus6.0購于美國Media Cybernetics公司;數字切片閱片軟件K-Viewer 1.5.3.1、Western印跡電泳、轉膜系統、Chemi DocTM XRS凝膠圖像分析系統購于美國Bio-Rad公司;Hitachi HT7800電子顯微鏡購于日本Hitachi公司;KFBIO(KF-PRO-005)數字切片掃描儀、動物跑步機(FT-200)。

1.3 方 法

根據Zheng等[19]描述的慢性溫和應激程序稍作修改制備大鼠CUMS應激程序,CUMS及CUMS+E組大鼠接受7種不同的應激刺激,大鼠每天接受一種應激(同種應激源不連續出現)(見表1),每周應激源隨機安排,連續4周。

表1 CUMS應激安排表

1.3.2 中等強度跑臺運動干預訓練方案

CUMS+E組大鼠從第2周開始,每天上午接受為期4周的CUMS,下午按Zielinski等[14]描述的運動方案進行4周中等強度的跑臺運動。跑臺訓練時大鼠跑速18～20 m/min(第1周18 m/min,第2周19 m/min,第3、第4周20 m/min),跑臺運動4周(60 min/天/6天/周,周一到周六,周日休息1天),跑臺訓練時不能對大鼠使用電擊裝置驅趕。

1.3.3 行為學測試

(1)強迫游泳實驗。實驗第37天對大鼠進行強迫游泳實驗(forced swimming test,FST),FST根據Porsolt等[15]詳細描述的方案進行了一些修改,是一種專門評估嚙齒類動物抑郁樣行為的測試方法。大鼠被禁食16 h后單獨放在塑料桶中(水深30 cm,直徑18 cm,高50 cm),水溫控制在21 ℃～23 ℃,并保證大鼠的尾巴不能到達塑料桶底部,強迫游泳6 min,用攝像機記錄大鼠后4 min內的靜止不動時間(大鼠停止掙扎或呈漂浮狀態,四肢有輕微動作以保持頭部在水面,s)、靜止潛伏期及攀爬持續時間(s)。

另外，得了帶狀皰疹不要焦慮，飲食宜清淡，避免過度勞累及鍛煉。盡量避免接觸免疫功能低下者，如老人、兒童，以免傳染。

(4)新奇抑制攝食實驗。實驗第41天參考以往學者的研究采用新奇抑制攝食實驗[17](Novelty suppressed feeding test,NSFT)評估大鼠禁食后在饑餓狀態下新奇的環境中產生攝食和對新環境恐懼的矛盾沖突。測試前,大鼠被放置在不同于飼養環境的實驗環境中,實驗時要求光線充足(光線強度大于飼養環境)。禁食24 h后將大鼠放置在方形敞箱(76 cm×76 cm×76 cm)的角落,敞箱中心放入9段大小相等的餌料,記錄5 min內大鼠第一次開始咬食(不是嗅或玩弄餌料)餌料的時間,記作攝食潛伏期(s)。為消除食欲差異對大鼠攝取餌料的影響,將大鼠放回原來的飼養環境及飼養籠后再次記錄大鼠5 min咬食餌料的潛伏期(s)。

1.3.4 Western blot法檢測前額葉皮質內質網應激蛋白及BDNF、TrkB表達

1.4 統計學分析

所有數據采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。數據表示為mean±SD,大鼠體重的變化采用重復測量方差分析,其他指標3組之間數據的統計比較采用單因素方差分析,以P<0.05表示有統計學意義,P<0.01表示有極顯著差異。

圖1 實驗流程圖Figure 1 Protocols of the experiment 注:FST,強迫游泳實驗;OFT,開場實驗;SPT,糖水偏愛實驗;NSFT,新奇抑制攝食實驗。

2 結果與分析

2.1 跑臺運動對CUMS大鼠體重的影響

重復測量方差分析顯示,組別及時間對大鼠體重有顯著影響(F=11.129,P=0.000)。CUMS及跑臺運動開始前[F(2,27)=1.135,P=0.336]及第1周[F(2,27)=0.367,P=0.696]、第2周[F(2,27)=2.902,P=0.072]三組大鼠體重無顯著差異,第3周[F(2,27)=16.626,P=0.000]及第4周[F(2,27)=12.143,P=0.000]三組大鼠體重差異顯著。CUMS 組大鼠在慢性應激2周后體重開始顯著低于對照組(P=0.023),并且一直延續到慢性應激的第3周(P=0.000)和第4周(P=0.000);跑臺運動從慢性應激第3周開始顯著改善CUMS大鼠體重的增長緩慢,CUMS運動組大鼠第3周(P=0.006)及第4周(P=0.015)體重顯著高于CUMS組大鼠,第1周(P=0.649)、第2周(P=0.193)兩組體重無顯著差異。而與對照組比較,CUMS+E組大鼠表現為慢性應激第3周(P=0.009)及第4周(P=0.021)體重均顯著降低,第1周(P=0.696)及第2周(P=0.294)兩組大鼠體重無顯著差異(見圖2)。

2.2 跑臺運動對CUMS大鼠抑郁樣行為的影響

2.2.1 跑臺運動對CUMS大鼠開場實驗的影響

圖2 各組大鼠第0～4周體重比較圖Figure 2 Comparation of the body weight of rats at 0～4 week in each group 注:**P<0.01,*P<0.05,與對照組比較;##P<0.01,#P<0.05,CUMS運動組與CUMS組比較。下同。

表2 各組大鼠開場實驗中跨格次數、直立 次數及中央格時間結果表Table 2 Results of crossing numbers, vertical numbers and time of staying in center in OFT in various n=30)

2.2.2 跑臺運動對CUMS大鼠強迫游泳實驗的影響

單因素方差分析,組別對強迫游泳實驗靜止潛伏期[F(2,27)=20.772,P=0.000]、靜止時間[F(2,27)=16.910,P=0.000]及攀爬時間[F(2,27)=11.454,P=0.000]均有顯著影響。與對照組(靜止潛伏期:78.80±11.00 s;靜止時間:53.90±8.99 s)比較,CUMS(靜止潛伏期:51.20±8.79 s;靜止時間:82.30±11.08 s)及CUMS+E(靜止潛伏期:68.60±9.11 s;靜止時間:67.50±12.42 s)組大鼠靜止潛伏期顯著縮短、靜止時間顯著增加(P=0.000,P=0.026;P=0.000,P=0.010)。與CUMS組比較,CUMS+E組大鼠靜止潛伏期顯著延長、靜止時間顯著縮短(P=0.000,P=0.005)。與對照組(59.80±8.90 s)比較,CUMS(42.60±5.60 s)及CUMS+E組(48.10±9.56 s)大鼠攀爬時間顯著縮短(P=0.000,P=0.004)。而與CUMS組比較,CUMS+E組大鼠攀爬時間無顯著統計學差異(P=0.146)(見圖3)。

圖3 各組大鼠強迫游泳實驗中靜止潛伏期、 靜止時間及攀爬時間比較圖Figure 3 Comparation of the latency of immobility, immobility time and climbing time in the forced swimming test of rats in each group

2.2.3 跑臺運動對CUMS大鼠糖水偏愛實驗的影響

2.2.4 跑臺運動對CUMS大鼠新奇抑制攝食實驗的影響

單因素方差分析顯示,組別對新奇抑制攝食實驗大鼠新環境攝食潛伏期有顯著影響[F(2,27)=13.765,P=0.000],但對原飼養籠攝食潛伏期無顯著影響[F(2,27)=1.950,P=0.162]。與對照組(102.50±17.32 s)比較, CUMS組(151.40±21.85 s)大鼠新環境攝食潛伏期顯著延長(P=0.000)。CUMS+E組大鼠新環境攝食潛伏期與對照組比較均無顯著差異(P=0.095),但與CUMS組大鼠比較顯著縮短(P=0.002)。原飼養籠三組攝食潛伏期之間無顯著差異(P>0.05)(見圖5)。

圖4 各組大鼠糖水偏愛實驗中糖水攝入量、總攝入量及糖水偏愛率比較圖Figure 4 Comparation of the sugar water intaking, total intaking and sugar water preference rate in sucrose preference test of rats in each group

圖5 各組大鼠新奇抑制攝食實驗新環境攝食潛伏期 及原飼養籠攝食潛伏期比較圖Figure 5 Comparation of the latency of feed in new environment and the latency of feed in original cage of rats in novelty suppressed feeding test in each group

2.3 跑臺運動對CUMS大鼠前額葉皮質內質網應激及凋亡蛋白表達的影響

圖6為3組大鼠前額葉皮質PERK、eIF2α、CHOP、BAX、Bcl-2、BDNF及TrkB蛋白表達情況。單因素方差分析顯示,組別對大鼠前額葉皮質PERK[F(2,15)= 8.488,P=0.003]、eIF2α[F(2,15)=29.929,P=0.000]、CHOP[F(2,15)=16.316,P=0.000]、BAX[F(2,15)=7.369,P=0.006]、Bcl-2[F(2,15)=30.631,P=0.000]、BDNF[F(2,15)=19.294,P=0.000]及TrkB[F(2,15)=25.834,P=0.000]蛋白表達均有顯著影響。與正常組比較,CUMS組大鼠前額葉皮質內質網應激蛋白PERK、eIF2α、CHOP及促凋亡蛋白BAX(P=0.000,P=0.001,P=0.003,P=0.032)表達均顯著增加,抗凋亡蛋白Bcl-2及BDNF、TrkB蛋白表達均顯著下降(P均=0.000)與CUMS組比較,CUMS+E組大鼠前額葉皮質PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達顯著下降(P=0.039,P=0.002,P=0.047),Bcl-2、BDNF及TrkB蛋白表達顯著增加(P=0.001,P=0.013,P=0.029),而BAX蛋白表達無顯著差異(P=0.371)。

3 討 論

3.1 跑臺運動對CUMS大鼠抑郁樣行為的影響

多數研究認為,暴露于CUMS可導致動物出現類似抑郁的行為,如,行為絕望、快感缺乏、運動能力下降及對新環境產生恐懼等[18]。本研究表明,CUMS誘導了大鼠抑郁樣行為,表現為蔗糖偏好實驗中蔗糖消耗及糖水偏愛率下降,強迫游泳實驗中靜止時間增加、靜止潛伏期及游泳時間均縮短。然而有學者認為,強迫游泳實驗中CUMS大鼠靜止時間延長可能是一種習得反應[19]。本研究選擇的刺激不是固定不變的,而是每天一種、隨機選取、不可預測的,避免了大鼠對應激條件的習慣;并且本實驗中抑郁大鼠糖水消耗量的下降,也不能單純地解釋為大鼠的渴覺下降,因為與對照組比較,CUMS大鼠的總液體消耗量并未減少,這些數據可被解釋為CUMS模型大鼠出現行為絕望和對獎勵刺激的反應減少。此外本研究還發現,開場實驗中大鼠中央格時間顯著縮短、水平穿格次數和直立次數均顯著下降;新奇抑制攝食實驗中新環境中大鼠攝食潛伏期延長,提示CUMS模型大鼠表現出類似于人類抑郁癥的臨床表現特征,如,對外界事物缺乏興趣、絕望,探索行為、運動能力下降及在饑餓狀態下的新奇環境中產生攝食和對新環境恐懼的矛盾沖突等,與前期學者研究結果一致[20]?？傊?本研究中的4周CUMS誘導了大鼠的行為絕望和恐懼,以及誘發了體重、探索能力、蔗糖偏好率的顯著降低,這些都與重度抑郁癥患者的臨床癥狀相似。結果表明,本研究成功建立了大鼠抑郁模型。

圖6 各組大鼠前額葉皮質PERK、eIF2α、CHOP、BAX、Bcl-2及BDNF、TrkB蛋白表達圖Figure 6 The protein expression of PERK, EIF2α, CHOP, BAX, Bcl-2, BDNF and TrkB in the prefrontal cortex of rats in each group

研究已經證實,作為一種非藥物干預方式,有氧運動可以幫助緩解抑郁癥狀,其效果與藥物治療和其他心理干預相當[21]。并且Meta分析顯示,運動,尤其是中等強度的有氧運動可顯著改善抑郁癥患者的抑郁癥狀[22]。此外本課題組前期研究發現,4周中等強度跑臺運動可通過增強海馬CA1、CA3區NGF 的表達,改善CUMS大鼠的絕望及探索行為[23]。因此,本研究給予大鼠4周中等強度跑臺運動,結果發現,4周中等強度跑臺運動可顯著改善CUMS大鼠的抑郁樣行為,具體表現為與CUMS組比較,CUMS運動組大鼠糖水偏愛實驗中蔗糖偏好率增加,強迫游泳實驗中靜止時間、靜止潛伏期及新奇抑制攝食實驗中新環境中大鼠攝食潛伏期均縮短,開場實驗中中央格時間延長;但是與對照組比較,CUMS運動組大鼠蔗糖偏好實驗中蔗糖消耗降低,強迫游泳實驗中靜止時間及靜止潛伏期及新奇抑制攝食實驗中新環境中大鼠攝食潛伏期均延長,開場實驗中中央格時間顯著減少,說明4周跑臺運動可在一定程度上改善CUMS大鼠的抑郁樣行為,但卻不能完全逆轉。然而屈紅林等[24]研究發現,8周跑臺運動可逆轉CUMS誘導的大鼠抑郁樣行為。因此,后續研究可以考慮延長跑臺運動的干預時間。此外,食欲下降是抑郁動物的常見癥狀之一,因此體重減輕常被用作抑郁的輔助指標之一[25]。本研究發現,4周CUMS(7種應激,每天隨機接受一種應激)可導致大鼠體重增長速度下降,而4周中等強度跑臺運動可提高大鼠體重的增幅,與之前的學者的研究結果不一致。Luo等[26]認為28天CUMS可以降低慢性應激大鼠體重,而慢性應激后6周跑臺運動干預可以提高大鼠的體重,但是與CUMS大鼠比較運動后兩組之間無顯著差異。另外Zhuang等[27]發現,21天CUMS(11種應激源:第1周,每天施加1次應激;第2周,每隔1天使用兩種應激;第3周,每天隨機接受兩種應激)可導致大鼠體重顯著下降,同時21天中等強度跑臺運動會導致慢性應激大鼠體重的緩慢增加。針對不同研究CUMS運動組大鼠出現不同結果可能與應激程度及運動時機及干預方案不同有關。

3.2 跑臺運動對CUMS大鼠前額葉皮質內質網應激蛋白及凋亡蛋白的影響

越來越多的證據表明,內質網應激反應與神經精神障礙,如重度抑郁癥和雙相情感障礙之間顯著相關[28]。動物實驗研究結果表明,21天CUMS可導致小鼠海馬內質網應激蛋白GRP78及CHOP表達增加和細胞凋亡蛋白caspase-12被激活,而減少內質網應激可改善CUMS小鼠的抑郁樣行為,提示CUMS小鼠的抑郁行為與內質網應激有關[29]。PERK/eIF2α/CHOP是調節內質網應激的重要信號通路[30]。因此,本研究使用Western blot檢測了CUMS大鼠前額葉皮質PERK、eIF2α及CHOP蛋白表達水平,結果發現連續28天的CUMS后,前額葉皮質PERK、eIF2α及CHOP蛋白水平均顯著升高。結果提示CUMS可誘導前額葉皮質內質網應激,激活的PERK可導致eIF2α的磷酸化,使蛋白質合成受到抑制,誘導CHOP轉錄,而長期活化的CHOP可通過下調抗凋亡基因 Bcl-2,上調促凋亡基因 Bax 等凋亡反應蛋白,促進細胞凋亡、激活促凋亡蛋白的表達[31]。本研究發現,連續4周的CUMS后,除了前額葉皮質內質網應激通路PERK/eIF2α/CHOP相關蛋白水平提高外,CUMS大鼠前額葉皮質抗凋亡基因 Bcl-2表達顯著下降,促凋亡基因 Bax蛋白表達顯著增加,提示長期CUMS導致大鼠抑郁樣行為可能與CUMS增強海馬內質網應激調控的PERK/eIF2α/ CHOP信號通路介導的細胞凋亡有關,可能是治療抑郁癥的潛在靶點。

研究認為,運動是一把雙刃劍,既能誘發內質網應激,又能改善疾病狀態下的內質網應激,并且運動對內質網應激的有益影響與運動強度有關[32-33]。Ruan等[34]研究發現,與高(25～28 m/min,坡度10o)、低強度(15 m/min,0坡度)跑臺運動相比,中等強度運動(20～25 m/min,0坡度)在抑制非酒精性肝炎肝細胞凋亡方面效果更為顯著,其機制可能與中等強度運動降低內質網應激信號通路PERK-eIF2α-CHOP介導的細胞凋亡有關?；谏鲜鑫墨I可知,中等強度有氧運動對內質網應激的調控可能更有益處。因此本研究給予CUMS大鼠4周中等強度跑臺運動,發現長期跑臺運動可使CUMS運動組大鼠前額葉皮質內質網應激蛋白PERK、eIF2α及CHOP蛋白表達水平顯著下調,抗凋亡基因 Bcl-2表達增加。此外本研究還發現,CUMS+E組大鼠抑郁樣行為顯著改善,可能與此運動在一定程度上減輕慢性應激誘導的內質網應激PERK/eIF2α/CHOP通路介導的細胞凋亡有關,具體機制需進一步研究。

3.3 跑臺運動對CUMS大鼠前額葉皮質BDNF/TrkB表達的影響

BDNF是主要的神經營養因子之一,在內質網中,BDNF主要以前體蛋白存在,通過運輸分化,在高爾基體中形成成熟的BDNF,在神經元成熟、突觸形成和突觸可塑性等過程中發揮作用,是抑郁癥病理生理學和抗抑郁藥治療機制的重要組成部分[35]。且有研究表明,單次向腦室或直接向雙側海馬灌注BDNF足以誘導相對快速和持續的抗抑郁類作用,而BDNF受體TrkB抑制劑灌注到腦室及海馬可阻斷其抗抑郁作用,結果表明BDNF-TrkB信號通路在抗抑郁藥的治療作用中起關鍵作用[36]。本研究聚焦前額葉皮質,通過4周慢性不可預知應激發現,與正常大鼠比較,CUMS組大鼠前額葉皮質BDNF及TrkB 蛋白表達均顯著減少,提示前額葉皮質中BDNF-TrkB信號通路蛋白表達降低在CUMS誘導的大鼠抑郁樣行為中發揮重要作用。為了進一步研究長期跑臺運動對內質網應激介導的神經凋亡的神經保護作用機制,本研究測定了前額葉皮質BDNF/TrkB通路蛋白表達,通過western blot檢測發現,4周跑臺運動使CUMS+E組大鼠前額葉皮質BDNF及TrkB蛋白表達均顯著增加。同時本研究還發現CUMS增加了大鼠前額葉皮質內質網應激相關標志物的表達,而跑臺運動可減弱這些標志物的表達,提示削弱內質網應激誘導的凋亡及上調BDNF/TrkB 信號通路在運動改善CUMS大鼠抑郁樣行為中起重要作用。有研究表明,BDNF/TrkB通路在對抗內質網應激中發揮重要作用[37]。Wei 等[38]研究發現,硫化氫可通過上調BDNF-TrkB通路,減輕同型半胱氨酸處理的大鼠海馬內質網應激(GRP78、CHOP蛋白表達下降)和神經元凋亡(caspase-12蛋白表達下降),且進一步研究發現,K252a(BDNF/TrkB通路的抑制劑)可明顯增加上述蛋白的表達,削弱H2S對CUMS大鼠的神經保護作用,提示BDNF/TrkB通路介導的H2S對CUMS大鼠的神經保護作用可能與其抑制內質網應激誘導的凋亡有關[39]。并且有研究報道,腦神經保護藥物可降低內質網應激標志物mRNA和蛋白表達,增加BDNF和TrkB mRNA和蛋白表達,并且減少了腦卒中大鼠梗死面積、增加了神經元存活率,認為腦神經保護藥可通過BDNF/TrkB信號通路調節的內質網應激介導的細胞凋亡發揮神經保護作用[40]。因此,本研究中的前額葉皮質BDNF/TrkB通路可能在CUMS暴露大鼠跑臺運動的抗抑郁作用中發揮了重要的中介作用,其機制可能是通過抑制前額葉皮質內質網應激PERK/eIF2α/CHOP通路誘導細胞凋亡。但是由于本研究中未加入 BDNF-TrkB 通路的激動劑及阻斷劑,是本研究的一個缺陷。本研究只能說明前額葉皮質BDNF-TrkB 通路涉及到跑臺運動的抗抑郁作用,后續工作還有待進一步研究BDNF-TrkB 通路通過何種途徑介導抑制CUMS引起的內質網應激PERK/eIF2α/CHOP通路激活及凋亡蛋白的表達。

圖7 跑臺運動改善CUMS大鼠抑郁樣行為的機制圖Figure 7 The mechanism of treadmill exercise improving depressive-like behavior in CUMS rats

4 結 論

(1)4周 CUMS可導致大鼠抑郁樣行為,前額葉皮質內質網應激PERK/eIF2α/CHOP通路相關蛋白及凋亡蛋白表達增加,BDNF 及 TrkB 表達下降,提示前額葉皮質可能是CUMS引起大鼠行為學改變的作用腦區之一,且這一作用可能是由前額葉皮質內質網應激PERK /eIF2α/CHOP通路誘導的細胞凋亡及BDNF-TrkB 信號通路下調共同介導的。

(2)跑臺運動改善CUMS大鼠抑郁樣行為可能與此運動激活前額葉皮質BDNF-TrkB 信號通路及降低內質網應激誘導的凋亡,提示跑臺運動可能通過BDNF/TrkB信號通路抑制內質網應激PERK /eIF2α/CHOP通路介導的細胞凋亡發揮抗抑郁作用。