9周負重爬梯訓練對絕經后骨質疏松癥大鼠的影響及作用機制分析

黃興裕,梅 贊,張帥軍

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于卵巢功能衰退引發的代謝性骨病[1],屬原發性骨質疏松癥最常見的類型,嚴重影響著中老年女性的身心健康。藥物是緩解和治療PMOP的最有效措施,但長期服用有副作用。Hedgehog-Gli通路是生物體的一條重要信號通路,由Hedgehog(Hh)蛋白、Ptched (Ptc)、Smoothened (Smo)受體、Gli轉錄因子及下游靶基因組成,參與多種類型細胞的分化、增殖和器官的發育,在胚胎發育和組織穩態中具有重要作用。近年來的研究表明,Hedgehog-Gli信號通路在骨發生、發育和生長中扮演著重要角色,其受體和關鍵因子的激活或過表達可以促進骨形成,而阻斷該通路可以導致骨形成的能力下降[2]。運動是骨健康促進的一種有效手段,在骨質疏松的臨床管理和骨折預防中扮演著重要的角色[3]。文獻研究發現,國內外鮮有抗阻運動是否能夠通過Hedgehog 信號通路改善絕經后大鼠骨質疏松發生發展的研究報道。因此,本研究通過建立PMOP大鼠模型,觀察負重爬梯訓練對去勢大鼠骨的作用以及對Hedgehog-Gli信號通路相關因子表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

采用試劑包括:堿性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)、骨保護素(osteoprotegerin,OPG)、骨鈣素(osteocalcin,OC)試劑盒(上海江菜生物有限公司);核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司);Shh、Ihh、Ptc、Smo試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)。

1.2 儀器與設備

使用儀器和設備包括:InAlyzer小型動物雙能X射線儀(深圳柏安諾科技有限公司)、KW-GU小動物骨骼強度測試儀(南京卡爾文生物科技有限公司)、LD-96A型全自動生化分析儀、熒光定量PCR儀(山東萊恩德智能科技有限公司)、DYCZ-40K型轉印電泳儀和WD-9413B型凝膠成像分析系統(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 方 法

1.3.1 分組與建模

適應性喂養1周后,采用隨機數法將40只大鼠分為假手術組(S,8只)和手術組(O,32只)。參照去勢法[4]造模,S組僅切除卵巢周圍脂肪組織,O組摘除卵巢,期間有2只大鼠死亡。術后2個月末,依據世界衛生組織推薦的絕經后骨質疏松大鼠模型的研究標準,從O組隨機選取6只進行骨小梁和骨密度檢測,結果顯示,骨小梁稀疏,形態結構完整性差,骨陷窩間隙增大,骨細胞減少,密度降低,說明建模成功。再將成功建模的大鼠隨機分為模型組(M)、戊酸雌二醇陽性對照組(P)和負重爬梯組(R),每組8只。

1.3.2 給藥與運動

1.4 指標檢測

1.4.1 取 材

1.4.2 骨密度的檢測

取待測股骨,PBS清洗后在雙能X射線儀上檢測不同區段的骨密度值。

1.4.3 血清骨代謝指標的檢測

取全血,以2 000 r/min轉速離心10 min,分離血清,在生化分析儀上檢測血清中ALP、RANKL、OPG、OC等的代謝物水平。

1.4.4 骨力學性能的檢測

將股骨的前、中、末端依次置于材料試驗機上,采用三點彎曲實驗法,加載速度2 mm/min,跨距20 mm,記錄載荷-變形曲線,換算最大載荷、彈性載荷和破壞載荷等指標強度。

1.4.5 Hedgehog-Gli信號通路相關因子蛋白表達的檢測

1.4.6 Hedgehog-Gli信號通路相關因子基因表達的檢測

RT-PCR法[8]:Trizol法提取總RNA,利用反轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為單鏈cDNA。參照陳祥和等[9]設計的基因引物序列(見表1),按試劑盒說明,反應條件為95 ℃、30 s,95 ℃、5 s,60 ℃、30 s,共40個循環,在PCR儀上檢測Hedgehog-Gli信號通路相關因子基因的表達。以β-actin作為內參,計算相對量,以2-ΔΔCt法分析。

表1 Real-time PCR引物序列表

1.5 數據處理與分析

2 實驗結果與分析

2.1 各組大鼠骨密度的檢測

大鼠股骨不同部位的骨密度顯示,與S組相比,M組股骨不同部位的骨密度值降低(P<0.01)。與M組相比,P組和R組股骨不同部位的骨密度值升高(P<0.01)。與P組相比,R組股骨不同部位的骨密度降低,但差異沒有統計學意義(P>0.05)。上述研究說明負重爬梯能夠增加骨質疏松大鼠的骨量,提升骨密度(見表2)。

表2 各組大鼠股骨區域性骨密度值表

2.2 各組大鼠血清骨代謝指標的檢測

大鼠血清骨代謝指標顯示,與S組相比,M組ALP3、RANKL水平升高(P<0.01),OC、OPG水平降低(P<0.01)。與M組相比,P組和R組ALP3、RANKL水平降低(P<0.01),OC、OPG含量升高(P<0.01)。與P組相比,R組ALP3、RANKL水平升高(P<0.05),OC、OPG水平降低(P<0.05)。上述研究說明負重爬梯能夠調節骨質疏松大鼠的骨代謝(見表3)。

表3 各組大鼠血清骨代謝指標水平表

2.3 各組大鼠骨力學性能指標的檢測

大鼠股骨力學性能結果顯示,與S組比較,M組最大載荷、彈性載荷和破壞載荷各指標下降(P<0.01)。與M組比較,P組和R組最大載荷、彈性載荷和破壞載荷各指標升高(P<0.01)。與P組相比,R組最大載荷、彈性載荷和破壞載荷各指標升高,但差異沒有統計學意義(P>0.05)。上述研究說明負重爬梯能夠提升骨質疏松大鼠骨的抗壓、抗彎和抗扭曲能力(見表4)。

表4 各組大鼠骨力學性能水平表

2.4 各組大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相關因子蛋白表達的檢測

Hedgehog-Gli信號通路Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli蛋白表達結果顯示,與S組相比,M組蛋白表達降低(P<0.01)。與M組相比,P組和R組蛋白表達升高(P<0.01)。與P組相比,R組蛋白表達升高(P<0.05)。上述研究說明負重爬梯能夠上調Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli蛋白的表達(見表5和圖1)。

表5 各組大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相關因子蛋白的表達表

圖1 各組大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相關因子蛋白的表達圖Figure 1 Expression of Hedgehog-Gli pathway related factor protein in rats in each group 注:A. Western blotting檢測結果;B. Western blotting檢測半定量分析結果。

2.5 各組大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相關因子基因表達的檢測

Hedgehog-Gli通路Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli 基因表達結果顯示,與S組相比,M組mRNA表達下降(P<0.01)。與M組相比,P組和R組mRNA表達升高(P<0.01)。與P組相比,R組mRNA表達升高(P<0.05)。上述說明負重爬梯能夠上調Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli基因的表達(見表6和圖2)。

表6 各組大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相關因子mRNA的表達

圖2 各組大鼠骨骼Hedgehog-Gli通路相關因子mRNA表達圖Figure 2 mRNA expression of Hedgehog-Gli pathway related factors in rats in each group

3 討 論

3.1 9周負重爬梯訓練對絕經后骨質疏松癥大鼠骨密度的影響

骨密度在骨質疏松臨床診斷和治療效果評價中具有重要意義。隨著年齡的增長,骨質的丟失,骨密度逐漸下降。夏夢嘉等[10]的研究指出,女性絕經后普遍存在骨密度降低的現象;Rathnayake等[11]的研究指出,女性絕經后的骨密度與骨質疏松的發生率具有負相關性。本研究中,M組骨密度顯著下降,提示雌激素在維持女性骨密度方面具有積極的作用。運動在維持骨密度穩定方面具有積極的作用,持續規律運動對絕經后女性骨密度水平具有積極的改善作用[12]。本研究中,負重爬梯訓練能夠顯著提升骨密度,其作用除了與應力有關外,還可能與Hedgehog-Gli信號通路有關。陳祥和等[9]的研究發現,運動訓練可上調小鼠Ihh、Shh的mRNA表達,進一步激活Hedgehog-Gli信號通路;Levi等[13]的研究表明,激活的Hedgehog-Gli信號通路可上調促骨形成因子的表達,提高成骨細胞活性;成骨活性提高,可促使成骨細胞合成分泌的Ⅰ型膠原蛋白增加,促進礦質沉積,增加骨密度[14]。本研究中,R組Shh、Ihh表達水平最高,說明負重爬梯訓練能夠激活Hedgehog-Gli信號通路提升成骨活性,促進礦物質的沉積,維持骨密度。

3.2 9周負重爬梯訓練對絕經后骨質疏松癥大鼠骨代謝的影響

骨代謝指標能夠及時反映骨轉換的狀態。根據骨代謝生化指標臨床應用專家的共識[15],以OC、OPG作為骨形成標志物,RANKL、ALP3作為骨吸收標志物。生理狀態下,成骨細胞和破骨細胞調控骨的形成和吸收,通過骨的改建和重建,維持骨量動態平衡。本研究中,M組血清ALP、RANKL水平升高,OC、OPG水平降低,提示骨質疏松狀態下破骨細胞活性增強,骨吸收增加。運動是調節骨代謝平衡的重要措施之一。陳彤丹等[16]的研究指出,運動有助于降低骨轉換水平,提升血清25-羥基維生素D,促進骨形成。本研究中,R組血清成骨細胞合成蛋白增多,破骨細胞分化因子下降,說明負重爬梯訓練能夠調節骨代謝,其作用可能與負重爬梯訓練對骨面應力的高沖量有關。有研究[17]顯示,高沖量的機械力能夠上調骨LKBI蛋白;LKBI蛋白可激活Hedgehog信號通路,上調Shh的表達[18];而Shh在骨髓間充質干細胞向成骨分化中具有顯著的正向調控作用[19]。本研究中,R組Shh表達顯著升高,說明負重爬梯訓練可激活Hedgehog-Gli信號通路上調Shh的表達,調節骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化,促進成骨細胞的生成。

3.3 9周負重爬梯訓練對絕經后骨質疏松癥大鼠骨力學性能的影響

骨力學性能是骨內在質量和結構的綜合表現,受年齡、健康狀況以及運動等的影響。絕經后,雌激素水平顯著下降,導致骨代謝紊亂,引發骨量減少、骨組織微結構退化。本研究中,M組最大載荷、彈性載荷和破壞載荷能力顯著下降,提示骨抗壓、抗彎和抗扭曲等性能下降,骨折易發風險上升,說明雌激素在骨結構維持方面具有重要的作用。運動能夠改善骨結構,提升骨的強度和韌性。馬濤[20]的研究指出,跑臺訓練能夠抑制骨吸收,改善骨結構。Lauren等[21]的研究顯示,蹦床運動能夠改善骨結構,增強骨強度。肌肉力量也是決定骨強度的重要因素,肌張力能夠通過Hedgehog信號通路促進骨的形成。Carbone等[22]通過對大鼠行屈肌肌腱前交叉韌帶重建模型后,給予10 N的預張力干預,發現Ihh蛋白及下游Gli、Ptc蛋白表達增加,同時,應用Hedgehog信號通路阻斷劑可使骨形成受損,提示Hedgehog信號通路與骨結構發生方面有一定的關聯。本研究中,R組最大載荷、彈性載荷和破壞載荷能力顯著提升,Shh、Ihh、Smo、Gli表達顯著升高,說明負重爬梯訓練能夠通過Hedgehog信號通路介導Ihh、Gli、Ptc蛋白的表達,促進骨的形成,改善骨結構。

3.4 9周負重爬梯訓練改善絕經后骨質疏松癥的作用機制

運動作為一種應激源,在細胞信號分子及細胞信號轉導途徑中具有重要的作用。本研究中,負重爬梯訓練能夠增加礦物質沉積,維持骨密度、促進成骨細胞分化、增殖和成熟,進而改善骨的結構,其作用可能與激活Hedgehog-Gli信號通路有關?？箯垜Υ碳ぷ饔糜诠悄け韺有用}外部骨形成細胞的原纖毛,可激活Cilia[23],活化的Cilia能夠觸發Hh蛋白N-末端發生變構,激活Hh蛋白,活化的Shh、Ihh與細胞膜上Ptc受體結合形成受體復合物,受體復合物可移位到胞漿與囊泡結合,觸發囊泡里激活性受體Smo的抑制解除,Smo以一種未激活的構象出泡云集到胞膜上,其N-末端胞外域上的半胱氨酸富集區共價結合成二聚體,激活構象形態,活化的Smo與胞膜上的Kif7結合,泛素連接酶水解,引起Kif7、Fu、Sufu形成的復合物變構,觸發Gli從胞漿中逸出來,Gli結構蛋白C-末端的轉錄激活域變構成轉錄激活子GliA,GliA與下游蛋白結合,通過骨髓間充質干細胞調控成骨細胞的增殖、分化及活性,改善骨質疏松。

4 結 論

綜上所述,9周負重爬梯訓練能夠促進絕經后骨質疏松癥大鼠骨鹽的沉積、成骨細胞的分化,以及上調Shh、Ihh、Ptc、Smo、Gli的表達,從而改善骨結構,提升骨力學性能,其機制可能與激活Hedgehog-Gli信號通路有關。