具有三光子性質的碘代咔唑基三吡啶錳（Ⅱ）配合物的合成及光動力學活性

張 瓊，李雅琴，劉玲玲，蔡昌婷，喬 瑞，宣 俊*

(1.安徽大學化學化工學院，功能無機材料化學安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230601；2.阜陽師范大學 化學與材料工程學院，安徽 阜陽 236037)

配合物非線性光學材料在上世紀八十年代以后迅速發展,成為科研人員關注的熱點課題[1]。由于金屬原子本身具有不同的d 或f 電子數、不同的氧化數和配位數，配體結構也具有多樣性，這使得形成的非線性光學材料具有獨特的光電性能。因此相對于單純的無機或者有機非線性光學材料有著更多的優勢[2]。除此之外，配合物的吸收譜帶較多，分子內部存在著光子從配體到中心金屬離子的躍遷以及從中心金屬離子到配體的躍遷，這使得配合物的基態偶極化和極化率較大，基態與激發態之間的能級差則相對較小。這一特點可以提高配合物非線性光學材料光電響應的速度，通過將配體設計成具有一定結構特征的新型配體，使這一類型的材料得到進一步的發展[3-5]。

光敏劑是指在光化學反應中，通過將光能轉移到一些對可見光不敏感的反應物上來提高感光性能的物質[6]。性質優良的光敏劑通常具有以下特點：1）純度較高的單一化合物；2）穩定性良好；3）熒光一般處在近紅外區；4）三重態量子產率比較高；5）分子的暗毒性小，光毒性大；6）具有較好的靶向性，并且容易被人體組織吸收[7-11]。本文引入鹵素離子來修飾配體，目的在于增加配合物分子的光敏活性，讓配合物更好的應用于光動力學治療中。

錳是第四周期的過渡金屬，是生物體必須的微量元素之一，它的最外層電子結構是d5，5 個單電子分別占據五個3d 軌道，處于半充滿的狀態[12]。近年來，錳（Ⅱ）配合物由于其優越的光電性能引起了科研人員的廣泛關注，對比銥（Ⅲ）、鉑（Ⅱ）、金（Ⅰ）等貴金屬配合物，錳（Ⅱ）配合物表現出類似的長壽命磷光發射和高發光量子效率，并且具有成本低，毒性小的優點，在光電功能材料領域逐漸占據一席之地[13-17]。

本文圍繞一種咔唑基三吡啶錳（Ⅱ）配合物MB3 進行了一系列探討。具體的設計思路如下：1）咔唑基三吡啶作為一種三齒配體，可以與Mn螯合形成穩定的配位化合物，使得形成的配合物表現出較好的非線性光學性質[18-19]。2）引入碘原子，可以改善分子間體系的交叉過程，使得配合物的ROS 產率得到提高[20]。3）金屬中心的引入可以促進配合物的非線性光學性質[21]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

試劑：2-乙?；拎?、乙醇、氫氧化鉀、中間體A3、氨水、飽和MnCl2溶液等。所有溶劑均為分析純，并且已按照標準方法進行了純化和干燥。

儀器：核磁共振譜儀（JNM-ECZ400S,TMS 為內標）；傅立葉紅外顯微系統（Vertex80+Hyperion 2000，KBr 壓片）；液相色譜質譜聯用儀（LTQ Orbitrap XL）；紫外分外光度計（U-3900 Spectrophotometer）；熒光分光光度計（F-7000 FL Spectrophotometer）；超高分辨率激光共聚焦顯微鏡（TCS SP8 STED 3X）；全自動協調飛秒激光器Coherent Astrella+TOPAS Prime (1 100-2 600 nm,1 kHz,120 fs)。

1.2 配體B3 及配合物MB3 的合成路線

圖1 配體B3 及配合物MB3 的合成路線

配體B3 的合成：稱取2-乙?；拎ぃ?.6 g，0.022 mol）加入500 mL 的圓底燒瓶中，用適量的乙醇溶液溶解，稱取氫氧化鉀（1.2 g,0.023 mol），用少量的水溶解后加入上述圓底燒瓶，常溫攪拌30 min。稱取A3（4.4 g，0.01 mol），用乙醇溶液溶解后加入體系，攪拌15 min，用恒壓滴液漏斗將40 mL 左右的氨水逐滴滴入體系中，80 ℃回流4 h，停止加熱，旋干溶劑，用乙醇分散后即可析出棕黃色固體。1H NMR (400 MHz,d6-CD3COCD3) δ 8.92 (s,2H),8.79 (dd,J=1.9,0.5 Hz,1H),8.75(dd,J=1.8,0.9 Hz,1H),8.74 (t,J=1.0 Hz,1H),8.73-8.72 (m,1H),8.04 (dd,J=8.6,1.9 Hz,1H),8.01-7.95 (m,2H),7.73 (ddd,J=9.0,8.6,1.1 Hz,2H),7.67-7.59 (m,1H),7.57 (s,1H),7.47-7.41(m,3H),4.30 (d,J=7.6 Hz,2H),1.45-1.18 (m,15H).13C NMR (100 MHz,d6-CDCCl3) δ 156.67,155.95,150.88,149.24,141.79,140.09,136.94,129.70,128.70,125.93,124.78,123.84,123.51,122.45,121.49,119.57,118.82,112.13,110.74,109.67,39.45,31.11,28.87,28.60,24.45,23.09,14.10,11.12.IR (KBr,cm-1): 2952,2630,1647,1397,1010,834,705.ESI-MS m/z: calcd for: M:636.17,found:637.18[M+H+].

配合物MB3 的合成：稱取配體B3（63.7 mg，0.10 mmol）于無水乙腈中，加熱使其溶解，將上述配體溶液逐滴滴加到溶于無水乙腈的飽和MnCl2溶液中，常溫攪拌20 min 后收集黃色固體。Mp:357-359℃。IR (KBr,cm-1): 3427，2936，2364，1600，1473，1100，864，800，717，673.MALDITOF-MS m/z:calcd for:M:761.05,found:761.27.

2 光物理性質

2.1 紫外-可見吸收光譜與單光子熒光光譜

選取DMSO 作為溶劑，測定MB3 的單光子吸收和發射光譜，探究配合物MB3 吸收能量后的電子躍遷行為以及激發態回落時的發光現象。測定結果如下：

如圖2（a）所示，配合物MB3 在280～300 nm處表現出較高的吸收，此峰歸屬于配合物分子內部的π-π*躍遷；在300～350 nm 處表現出相對較弱的吸收，此峰歸屬于配體分子內電荷轉移（ICT）；在380 nm 附近的吸收是配合物的中心金屬離子Mn(Ⅱ)到配體的電荷轉移（1MLCT）。如圖2（b）所示，MB3 在440 nm 左右表現出較強的熒光。

圖2 （a）MB3 的紫外-可見吸收光譜（b）MB3 的單光子熒光光譜（測試濃度：10-5mol/L）

2.2 三光子熒光光譜

實驗采用熒光對比法在1 150～1 550 nm 的飛秒激光激發下測試了配合物的三光子熒光光譜，進一步研究配合物MB3 的非線性光學性質。以羅丹明6 G 作為標準樣品進行對比，計算公式如下：

下標“s”和“r”分別代表樣品和參比（參比溶液是溶于乙醇的10-3mol/L 的羅丹明6 G）。f 為光纖光譜儀采集到的熒光信號的整體熒光收集效率強度。Q,n,c 分別為熒光的量子產率，溶劑的折射率，溶液的濃度。測試結果如下：

由圖3（a）可知，配合物MB3 在1 150-15 50 nm 的激發下具有明顯的三光子熒光信號。隨著激發波長增加，配合物的熒光先增強后又減弱。在激發波長為1 450 nm 時，配合物的三光子熒光強度達到峰值。將配合物MB3 的三光子發射位置與單光子發射位置對比后，發射位置出現了接近100 nm 的紅移。根據上述公式計算得到MB3在1450 nm 激發下，其的三光子吸收截面達到2.2×10-79cm6s2photon-2，表明配合物MB3 具有較強的三光子吸收性質。

圖3 (a)MB3 的三光子激發熒光光譜；（b）三光子吸收截面（a/b,測試濃度10-3mol/L）

3 生物應用探索

3.1 活性氧檢測與細胞毒性測試

考慮到碘原子引起的重原子效應，研究了配合物MB3 的活性氧（ROS）生成能力。2,7-二氯二氫熒光素二乙酸（H2DCF-DA）是商用指示劑，本身是不帶有熒光的，但經過氫氧化鈉活化半個小時后會水解產生HDCF，HDCF 與ROS 反應生成DCF,發出熒光。如圖4（a）和（b）所示，光照條件下，指示劑在520 nm 左右發出強烈的綠色熒光，隨著時間推移熒光強度逐漸變大，表明配合物MB3 能夠生成ROS，并且生成ROS 的速度較快。繼續探索了生成活性氧的種類，使用Bruker NanoX 波段光譜儀，在298 K 條件下對配合物MB3 進行了ESR 測定。如圖4（c）所示，光照條件下，MB3 在空氣飽和的水溶液中記錄了特征信號，沒有光照則未能檢測到特征信號。光照后在3 600 G 和3 460 G 之間觀察到相對強度為1:1:1的特征單線態氧三元組信號，表明光照條件下，配合物MB3 產生的ROS 的種類為1O2。

圖4 （a）在525 nm PBS 光照射下，MB3 存在下的H2DCFDA 的熒光強度（b）525 nm PBS 光照射下，MB3 產生的ROS（c）光照前后，TEMP 捕獲MB3 的ESR 信號(c=1.0×10-3 mol/L)（d）配合物在HeLa 細胞中的毒性測試

上述測試結果表明，MB3 有作為光敏劑的潛力，進一步進行了相關細胞毒性實驗。如圖4（d）所示，黑暗條件下，不同濃度的MB3 與HeLa 細胞孵育培養24 h 后細胞的存活率仍然保持在80%以上，表明配合物MB3 暗毒性較低；光照條件下，細胞的存活率則有著明顯的下降趨勢，細胞存活率隨著MB3 濃度增大而逐漸減小。由此可知，配合物MB3 具有較低的暗毒性和較高的光毒性，具有良好的光動力學應用前景。

3.2 細胞內的ROS 檢測

利用商用ROS 熒光探針2,7-二氯-氫熒光素（DCFH-DA）觀察ROS 的產生。DCFH-DA 進入細胞后，被細胞內存在的酯酶水解，生成對ROS敏感的探針DCFH，DCFH 與ROS 快速反應生成熒光化合物2,7-二氯熒光素（DCF）。因此，可以通過DCF 的熒光強度來評估細胞內活性氧的水平。DAPI 是一種可以穿過細胞膜，與DNA 緊密結合的熒光染料，在358 nm 激光下，復合物DAPI-DNA 發出藍色熒光，可以用于標記細胞核。如圖5 所示，將MB3 和DCFH-DA 孵育HeLa 細胞30 分鐘，光照條件下，隨著時間的推移，觀察到明顯的熒光增強現象，表明細胞內具有有效的ROS生成，生物測試結果與化學測試結果相一致。

圖5 （a）以DCFH-DA 為指示劑進行共聚焦顯影在HeLa細胞內檢測ROS 的產生；（b）AM/PI(5 μm)處理MB3(10 μm)體外PDT 療效觀察不同處理后的HeLa 細胞。

以鈣黃素（AM）和碘化丙啶（PI）為指標，直觀評價MB3 作為光敏劑時對癌細胞的殺傷效果，以證實PDT 的高效率。當出現鈣黃素的綠色熒光時，說明細胞狀態良好；但當出現碘化丙啶的紅色熒光時，說明細胞已經死亡。如圖5（b）所示，MB3 孵育HeLa 細胞30 分鐘后進行AM/PI 染色。Vc 能夠抑制ROS 產生過程，光照后加入Vc組出現綠色熒光，說明細胞未死亡；而PDT 組出現紅色熒光，說明癌細胞已死亡。綜上所述，MB3誘導細胞死亡的機制結果表明，MB3 產生的ROS破壞癌細胞使得細胞死亡。

4 結論

本文設計合成了一種碘原子修飾的咔唑三吡啶錳配合物MB3，配合物具有良好的非線性光學性質，最大三光子吸收截面可達到2.2×10-79cm6s2photon-2。ROS 生成和細胞成像表明MB3 在細胞內和細胞外均具有優異的單線態氧生成能力，其細胞毒性測試顯示MB3 具有較高的光毒性和較低的暗毒性，光照條件下能夠在細胞內產生活性氧誘導癌細胞死亡，具有應用于光動力學治療的潛力。