3D 生物打印
——骨組織再生的新工具

■文/ 張 華 李積宗 馮心宜 孟海華

骨組織再生是一個備受關注的領域，對骨損傷、骨疾病和骨缺陷的治療具有重要意義。傳統的骨組織再生方法受到供體限制、手術風險和功能恢復困難等問題的限制。隨著3D 生物打印技術的快速發展，骨組織再生領域迎來了一個全新的前景。

3D 生物打印的主要特點與工作流程

3D生物打印技術是一種創新性的制造技術，結合了3D 打印技術和生物學原理，旨在通過逐層堆疊生物材料來構建具有特定結構和功能的生物組織和器官。與傳統的生物制造方法相比，3D生物打印技術具有更高的精度、復雜性和個性化定制能力。傳統的3D 打印技術使用塑料或金屬等材料打印物體，而3D 生物打印技術則使用生物材料，如細胞、細胞培養基、生物支架等。這些生物材料可以根據特定需求和目標組織的特性進行定制，以制造出模仿自然組織特征的生物醫學部件。

3D 生物打印技術的工作流程一般包括以下4 個步驟。一是設計模型。使用計算機輔助設計（CAD）軟件創建目標組織或器官的三維模型，這個模型可以根據需要進行個性化定制，以適應不同患者的需求。二是準備生物墨水。根據目標組織的類型和特性，制備適當的生物墨水。生物墨水通常由生物材料（如細胞）和生物支架（提供結構支持）組成。三是打印過程。將生物墨水加載到3D 打印機中，并按照預定的CAD 模型進行打印。打印機按照逐層堆疊的方式，將生物墨水逐漸轉化為具有特定結構和功能的生物組織。四是細胞培養和成熟。打印完成后，生物組織需要進行細胞培養和成熟的過程。在適宜的培養條件下，細胞將自行分化和生長，形成完整的組織結構。

3D 生物打印的先進材料

墨水材料的選擇是生物打印成功與否的關鍵。在骨科組織的生物打印中，選擇合適的墨水材料可以確保打印出具有所需力學性能和生物相容性的組織結構。常用的墨水材料包括合成聚合物、水凝膠基等。在組織打印過程中應考慮其流變性、機械性能、仿生性、生物降解性等關鍵特性。

●合成聚合物作為生物墨水

合成聚合物作為生物墨水在生物打印中具有廣泛的應用。合成聚合物的選擇應考慮其生物相容性、可加工性、力學性能和生物降解性等關鍵特性。常見的合成聚合物包括聚乳酸（PLA）、聚乙二醇（PEG）、聚己內酯（PCL）等。這些聚合物具有良好的生物相容性和生物降解性，可用于打印組織工程支架和修復材料。此外，還有一些具有特殊功能的合成聚合物，如溫敏聚合物、光敏聚合物和電活性聚合物，可用于實現具有響應性和智能性的生物打印，通過選擇合適的合成聚合物，可以實現精確控制的組織構建和功能性生物材料的制備。

●水凝膠作為生物墨水

水凝膠生物墨水是一種重要的生物打印材料，它能夠在生物打印過程中提供支撐和保護細胞，并為細胞提供適宜的生長環境。水凝膠是由水和高分子聚合物交聯形成的3D 網絡結構，具有優異的生物相容性和可調控的物理性質，因此被廣泛應用于組織工程、藥物輸送系統、生物傳感器和仿生材料等領域。一些常見的天然來源水凝膠有海藻酸鹽、明膠、膠原蛋白、脫細胞基質（dECM）等。

dECM 生物墨水的生物相容性和生物活性使其成為組織工程和再生醫學領域中的重要材料。它由去細胞化的細胞外基質制成，通常來自動物組織，如心臟、肝臟等，可以用于制備具有生物活性和生物相容性的復雜生物醫學結構，為組織工程、再生醫學和個體化醫療領域提供了重要的解決方案。

3D 生物打印在骨組織工程中的應用

肌肉骨骼系統由多種組織組成（如骨骼、軟骨、骨骼肌、肌腱/韌帶和其他組織組成），它們結合在一起同步工作，為身體提供支撐和穩定性并保護重要器官。骨科手術常用于治療肌肉骨骼創傷、損傷和退行性疾病。在許多病理性疾病中，移植術是恢復組織功能最可行的選擇之一。目前，自體移植物仍然是骨科臨床的金標準。然而，它們的局限性如資源有限、供體部位的移動性、疾病傳播和功能喪失等，可能會限制其臨床使用。由于組成、組織和機械行為的復雜性，尋找具有合適的生物材料和生物制造方法的理想植入體，以實現最佳的再生結果是具有挑戰性的。因此，3D 生物打印技術引起了人們的廣泛關注，并成為推進再生醫學發展的重要工具。

基于3D 生物打印的生物制造為3D 功能組織等價物的生產開辟了新的途徑，以鼓勵受損組織的再生，如骨骼、軟骨、骨骼肌、肌腱/韌帶及其相關的多組織界面。

●3D 生物打印在骨組織方面的應用

由于老化、創傷、腫瘤、感染和關節置換術失敗而引起的骨丟失和損傷通常需要手術干預，以協助骨缺損和骨折的愈合。在臨床治療方案中，自體移植是目前修復骨病變的金標準，但往往由于缺乏替代品而受到限制，還面臨供體部位發病率高和可能的病原體傳播等問題。3D 生物打印是生產骨組織工程定制支架的一個有吸引力的策略。許多研究已經探索了3D 生物打印在工程再生生物支架中的潛力，這項技術允許以一種逐層堆疊的方式創建復雜的生物組織和結構，從而為組織工程和再生醫學領域提供新的可能。大多數3D 打印支架將生物陶瓷，如羥基磷灰石（HA）和β-磷酸三鈣（β-TCP），結合到合成材料中，以提高其骨導電性和成骨能力。例如，2016 年美國西北大學的拉米列·沙阿（Ramille Shah）和阿達姆·亞庫斯（Adam Jakus）首次開發了一種超彈性骨（HB）墨水用來打印一種用于骨再生的彈性結構，目標是開發一種能夠模擬人體骨骼的高度彈性結構，以提供更好的骨組織再生支持。傳統的骨組織工程材料往往過于脆弱，無法承受骨骼的動態負荷，而HB 墨水通過其獨特的超彈性彌補了這一缺陷。

隨著3D 生物打印技術的發展，目前的研究主要集中在3D 生物打印結構中復制細胞外基質（ECM）和礦化骨環境。ECM 是一種復雜的三維支架結構，存在于細胞周圍，對細胞的生長、分化和功能發揮起重要作用。研究人員利用3D 生物打印技術，可以精確控制打印材料的排列和組織結構，以復制ECM 的特征。骨組織的礦化過程對骨骼的形成和維持至關重要。通過3D 生物打印技術，研究人員可以打印出類似骨骼中礦化環境的結構。例如，利用打印材料中含有鈣磷化合物，可以模擬骨骼中的礦化成分。這種方法可以為骨組織工程提供更逼真的仿生構建物，提供骨細胞生長和骨礦化所需要的適宜環境。此外，通過控制打印材料的成分和結構，還可以調節構建物的機械性能，使其更接近自然骨骼的力學特性。

目前，在生產具有臨床相關性和功能性的骨替代品方面還存在許多挑戰，包括生物相容性和生物降解性、結構和功能仿真、細胞源和細胞培養、血管化和供血、臨床驗證和監管要求等。3D 生物打印骨組織的臨床轉化在被廣泛使用之前需要克服這些關鍵障礙。

●3D 生物打印在軟骨組織方面的應用

軟骨組織可分為透明軟骨、彈性軟骨或纖維軟骨，它們根據給定的軟骨組織的特化來執行不同的功能。軟骨是一種缺乏血管和神經的結締組織，主要由被稱為軟骨細胞的特化細胞組成。由于缺乏血液供應，軟骨的新陳代謝和細胞更新速度較慢，細胞數量也相對較少。這導致了軟骨組織的自我修復和再生能力較弱。因此，局灶性軟骨病變很少愈合，通常會導致關節結構和功能的進行性和退行性改變。目前的手術治療效果有限，導致受傷部位的嚴重疼痛和活動能力受損。3D 生物打印技術在軟組織工程中的應用正在不斷發展。雖然軟組織與硬組織（如骨骼）相比具有不同的特性，但3D 生物打印提供了一種潛在的方法來構建和修復軟組織。

結合合成生物材料墨水和含細胞水凝膠生物墨水對混合結構的3D 生物打印已成為一種流行的再生方法，以提高軟骨組織工程結構的生物力學和生物性能。美國伊利諾伊理工學院生物醫學工程系副教授福爾格尼·帕蒂（Falguni Pati）等利用3D 生物打印技術開發了一種混合細胞負載結構，使用PCL 和dECM 生物墨水交替打印，形成一種多層結構。PCL 提供了結構支持和機械強度，而dECM 生物墨水則包含軟骨細胞所需的細胞信號分子和細胞黏附位點。通過這種方法，研究人員成功地構建了一個PCL 層和dECM 層交替排列的混合細胞負載的結構。這種結構能夠為軟骨細胞提供合適的生長環境，并促進軟骨組織的再生和修復。該研究展示了在3D生物打印中利用不同材料的交替層構建復雜的混合細胞負載結構的潛力。通過調控材料的組合和層次結構，為不同類型的細胞提供適當的支持和信號，從而更好地模擬和促進軟骨組織的生長和再生。2019 年，上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院周廣東教授和東華大學莫秀梅教授在《材料與設計》（Materials&Design）雜志上共同發表一篇題目為《用于軟骨再生的三維打印電紡纖維支架》（Three-dimensional printed electrospun fiber-based scaffold for cartilage regeneration）的文章。研究人員將靜電紡絲、3D 打印、冷凍干燥、交聯等技術相結合，成功地將靜電紡絲纖維制成了外觀形狀準確、大孔結構可控、力學性能良好的三維纖維支架。

總的來說，3D 生物打印技術通過將細胞、生物材料和/或生物活性蛋白等生物成分結合在一起，可以實現仿生構建的軟骨組織工程。然而，使用3D 生物打印技術的軟骨修復并沒有在臨床實踐中使用。生物打印組織在軟骨再生臨床轉化中面臨的挑戰包括細胞源和質量控制、生物墨水開發、結構復雜性、血管化和生物材料降解、安全性和效果評估等。通過不斷的研究和技術進步，3D 生物打印技術有望克服這些障礙，為軟骨再生提供更有效的治療手段。

●3D 生物打印在骨骼肌組織方面的應用

骨骼肌在維持其結構和促進運動中起著核心作用。骨骼肌具有復雜的結構和功能，包括肌纖維、肌束、肌肉腹、肌腱等組織。傳統的組織工程方法往往難以準確地重建這些結構，并且無法滿足骨骼肌再生和修復的需求。3D 生物打印技術可以通過將細胞、生物材料和生長因子等生物成分精確定位和分層堆疊，實現精細控制組織構建。

與其他骨科組織（如骨、軟骨、肌腱或韌帶）不同，骨骼肌是一種相對軟的組織。因此，聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）、膠原蛋白、明膠、海藻酸鹽、纖維蛋白和肌肉來源的dECM等水凝膠材料，由于其柔軟性和生物相容性，被廣泛應用于生物打印肌肉結構。

通過將神經細胞與生物打印的骨骼肌構建整合，研究人員能夠模擬正常肌肉的神經連接。這種神經輸入為肌肉結構的再生提供了額外的刺激和指導，有助于促進其恢復和重建。在實驗中，將細胞和生物打印材料相結合，通過合適的生長環境和條件，細胞能夠成長和發育。通過模擬神經輸入，這些細胞可以在構建的肌肉結構中形成新的神經連接，并與周圍的組織相互作用。生物打印的骨骼肌結構中的神經輸入對結構和功能的恢復起到了關鍵作用。這種細胞和神經整合的方法有望幫助人體肌肉損傷的治療和恢復。

●3D 生物打印在肌腱/韌帶及其界面組織方面的應用

肌腱和韌帶是人體中的重要結締組織，對維持關節的穩定性和促進肌肉骨骼組織之間的平滑負荷傳遞起著關鍵作用。3D 生物打印技術在肌腱/韌帶及其界面組織工程中具有廣泛的應用前景，包括生物材料打印、結構支架打印、生物打印細胞等。

一是生物材料打印。傳統的組織工程材料往往難以滿足復雜的組織結構和功能需求，而生物材料打印提供了一種定制化制備的解決方案。例如，可以被精確地定位和排列生物可降解聚合物、生物陶瓷和生物纖維素等材料可以根據需要進行選擇，以滿足不同肌腱/韌帶組織的特性和性能要求。這些材料在3D生物打印過程中，可以構建具有類似自然組織結構的肌腱/韌帶工程。

二是結構支架打印。3D 生物打印技術可以制造肌腱/ 韌帶的支架結構，為細胞提供生長和擴散的空間，同時也提供力學支持。支架的孔隙結構也是一個關鍵因素。3D 生物打印技術可以設計出具有特定孔隙率和大小的支架結構，以促進細胞遷移、營養輸送和新生組織形成。此外，支架材料的力學性能也可以根據需要進行調整，以提供適當的剛度和彈性。

三是生物打印細胞和因子。3D 生物打印技術可以精確地定位細胞和生物因子，以促進肌腱/韌帶組織的再生和修復。例如，通過打印預定位置的細胞，可以模擬自然組織中的細胞排列和分布，促進組織的完整修復。

總的來說，目前3D 生物打印技術在骨組織工程中的應用已經取得了顯著的進展，并展示出巨大的潛力。未來，通過與合成生物學、基因編輯等其他前沿技術相結合，3D 生物打印技術在骨組織工程領域的應用將實現進一步的突破和創新，為臨床實踐帶來更大的益處。