硫氧還蛋白還原酶小分子抑制劑研究進展*

王艷茹,王曉玲,段東柱

(寶雞文理學院 化學化工學院,陜西省植物化學重點實驗室,陜西 寶雞 721013)

目前,癌癥的發病率逐年增長,越來越多的癌癥病人遭受著病痛的折磨,且癌癥本身容易復發,傳統的化療方法對人體不可避免地產生毒副作用,尋找療效顯著的抗腫瘤藥物迫在眉睫。天然產物具有安全、副作用小等優點,在過去的幾十年中,科學家們已經從天然產物中發現了多種新的治療小分子,并且提出了用于癌癥治療的藥物新靶點[1]。

大量研究報道,硫氧還蛋白(Trx)氧化還原系統的表達水平與腫瘤細胞生長和存活有直接關系,許多化學小分子通過誘導活性氧水平的上升殺死腫瘤細胞,腫瘤細胞耐藥表型與抗氧化酶和Trx活性的增加密切相關[2]。因此,作為一種新的抗癌治療方式,干擾氧化還原穩態從而誘導氧化應激介導的細胞凋亡具有巨大的潛力。

1 Trx系統

Trx系統由Trx、硫氧還蛋白還原酶(TrxR)和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)組成。

1.1 Trx

Trx具有抗氧化作用,最早是作為核苷酶的供體被人們認識。Trx廣泛存在于原核生物、真核生物、植物和哺乳動物中[3],可以抵御細胞死亡導致的氧化應激,在氧化還原系統中有重要的作用。Trx的巰基和二硫鍵位于其保守的活化區域內,Trx的氧化還原活性使得其在細胞內具有不同的功能。Trx由α螺旋和β折疊連接而成,其分子量約為12 kDa,具有極高的熱穩定性。哺乳動物Trx的存在有3種方式:Trx1分布于細胞核和胞漿中;Trx2分布于線粒體中;Trx3在睪丸中高度表達。

1.2 TrxR

TrxR是Trx系統的主要組成部分,它是一種同源二聚體黃素蛋白。TrxR是一種具有廣泛底物特異性的酶,可以還原幾種不同的氧化底物。除了利用氧化Trx作為底物外,其他底物有蛋白質二硫異構酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫、脂質氫過氧化物、維生素K、泛醌、核桃酮、茚三酮、四氧嘧啶、脫氫抗壞血酸、硫辛酸/脂酰胺、S-亞硝基谷胱甘肽、亞硒酸鹽、甲基硒酸鹽、硒代半胱氨酸和二苯硒化物。TrxR作為目前已知唯一可以還原Trx的酶,由于TrxR碳末端的硒半胱氨酸(Sec)具有較低的pKa值,故其具有非常高的活性,容易和親電試劑發生邁克爾加成反應,并且TrxR和Trx在惡性腫瘤中高度表達,所以TrxR十分適合用來作為抗腫瘤藥物的靶點。

2 Trx系統與腫瘤的關系

Trx系統是細胞內十分重要的抗氧化系統,可以維持細胞內的氧化還原平衡,有效預防細胞產生氧化應激。根據癌細胞發展的不同時期,Trx系統發揮的功能也不同[4]。在癌癥早期,Trx可以抵擋由于致癌物引起的氧化應激,有助于防御癌癥。但是當細胞開始表現出癌癥表型時,由于Trx可以促進細胞生長、抵抗細胞凋亡,這時高水平的Trx將會有助于癌細胞的生長[5]。在癌癥發展的后期,Trx可能會與腫瘤血管的生成、轉移以及擴散相關。Trx系統通過電子的傳遞將硫氧還蛋白還原酶從還原態變為氧化態,氧化態的硫氧還蛋白還原酶還原二硫鍵生成抗氧化的巰基,從而維持氧化還原的平衡。從實驗研究和臨床觀察中積累的數據表明,Trx/TrxR的表達和功能與多種疾病的發生有關,如衰老相關疾病、心血管疾病、癌癥以及傳染病等,因此,Trx系統在疾病的治療中具有重要意義。

3 TrxR小分子抑制劑

近些年來,已經發現了許多從天然產物中分離得到或者合成的TrxR小分子抑制劑,并且已發現的TrxR抑制劑大多都具有抗腫瘤活性。本文總結了2017年以來具有代表性的TrxR抑制劑,可以分為天然產物(圖1,化合物1-16)和合成的小分子(圖2,化合物17-27)。

圖1 從天然產物中分離得到的硫氧還蛋白還原酶抑制劑Fig. 1 Natural products as thioredoxin reductase inhibitors

圖2 合成的硫氧還蛋白還原酶抑制劑Fig. 2 Synthetic inhibitors of thioredoxin reductase

3.1 從天然產物中分離得到的小分子抑制劑

豆甾醇(1)是一種植物甾醇,可誘導多種癌細胞系氧化應激介導的凋亡。RAJAVEL et al[6]研究發現豆甾醇對A549細胞生長有較強的抑制作用,可以引起活性氧水平升高,并且豆甾醇與TrxR活性位點的絲氨酸殘基有著十分穩定的相互作用。豆甾醇可以靶向TrxR并引起A549細胞的氧化應激,最終導致細胞大量凋亡。菜薊苦素(2)具有5-7-5融合三環骨架,具有2個羥基,4個外烯烴和6個立體中心。研究發現菜薊苦素具有顯著的抗腫瘤活性[7],菜薊苦素的α、β-不飽和羰基通過抑制TrxR影響硫氧還蛋白通路,促進氧化Trx積累和活性氧介導的人宮頸癌HeLa細胞凋亡。土木香內酯(3)是一種倍半萜內酯,YIN et al[8]發現土木香內酯在體內外均可抑制三陰性乳腺癌(TNBC)細胞中TrxR1的活性,從而抑制TNBC細胞生長,使得細胞內活性氧增加引起細胞凋亡。ZHANG et al[9]從青木香中分離到一種含有α-亞甲基-γ-內酯的倍半萜內酯桑塔馬林(4),研究發現桑塔馬林是一種新型TrxR抑制劑,其靶向細胞內TrxR促進活性氧積累,從而抑制HeLa細胞增殖,TrxR在細胞內的敲低或過表達分別加重或減輕了桑塔馬林對HeLa細胞的細胞毒性。天然產物羥基酪醇(5)屬于多酚類化合物,也是TrxR1的有效抑制劑[10]。羥基酪醇抑制TrxR1可抑制細胞增殖,導致人結直腸癌細胞活性氧積累,誘導細胞G1/S周期阻滯引起細胞凋亡。海松烷二萜(6)是從北極真菌Eutypellasp. D-1中分離出來的一種衍生的吡瑪烷二萜,對許多癌細胞顯示出較高的細胞毒性。通過研究其對人胰腺癌細胞的抗癌作用發現,海松烷二萜可以促進胰腺癌細胞凋亡[11]。機制研究表明,海松烷二萜對Trx系統有抑制作用,但對谷胱甘肽還原酶和谷胱甘肽影響不大,海松烷二萜通過偶聯Trx1中32位和35位的半胱氨酸(Cys32/Cys35)殘基和TrxR的Sec498殘基,導致細胞內谷胱甘肽水平降低和下游ASK1/JNK信號通路激活。WEN et al[12]研究表明,毛殼素(7)通過抑制TrxR1,隨后誘導細胞內ROS過度積累使得PI3K/AKT通路失活,最終導致胃癌細胞死亡。一葉秋堿(8)是植物葉底珠中主要的活性生物堿內酯,在治療神經系統疾病方面有著重要作用。ZHANG et al[13]報道了一葉秋堿在細胞中抑制純化的TrxR,引起活性氧的積累,氧化谷胱甘肽和Trx的升高,破壞氧化還原穩態,最終導致氧化應激介導的HeLa細胞凋亡。PENG et al[14]發現從生姜中分離出來的姜皂苷(9)具有較好的抗腫瘤活性。姜皂苷可以通過抑制TrxR的活性提高HeLa細胞內活性氧水平使得細胞凋亡,敲除TrxR可以增加姜皂苷的細胞毒活性。KALIN et al[15]發現地衣次生代謝產物vulpinic acid(10)可以誘導TrxR1表達,同時抑制其蛋白表達和酶活性,是一種潛在的TrxR抑制劑。β-拉帕酮(11)從具有癌癥化學預防屬性的重蟻木樹皮中獲得,ZHANG et al[16]發現β-拉帕酮通過抑制TrxR并進一步升高氧化應激誘導HL-60細胞凋亡。從木香中分離得到的木香內酯(12)可以與TrxR 498位的Sec共價結合,抑制TrxR的生物學功能,對細胞產生毒性從而誘導細胞凋亡[17]。從五角葡萄內生真菌中分離得到的格孢苝醇(13)通過靶向TrxR抑制人肝癌HepG2細胞生長,從而導致DNA損傷、G2/M細胞周期阻滯和線粒體裂變,最終誘導細胞鐵死亡[18]。本課題組[19]研究發現天然二萜類化合物毛萼乙素(14)可以共價修飾谷胱甘肽,并且通過靶向TrxR的Sec殘基選擇性抑制其活性;具有顯著生物活性的倍半萜類化合物去氧地膽草素(15)可以抑制TrxR活性而誘導活性氧介導的HeLa細胞凋亡,下調細胞內TrxR可以顯著增加細胞對去氧地膽草素的敏感性[20]。青藤堿(16)是臨床藥物正清風痛寧的有效成分,可以用來治療類風濕性關節炎;青藤堿是一種新的TrxR抑制劑,并且在體內外對腫瘤細胞的增值和生長都有抑制作用[21]。

3.2 合成的小分子抑制劑

水楊酸作為抗炎藥物阿司匹林的前體分子,也具有抗炎作用。水楊酸鹽是一種多功能配體,具有2個硬堿性和強堿性給電子體,可促進陽離子的螯合或金屬橋接。近幾十年來,越來越多的研究認為釕(Ru)配合物對于治療癌癥有很大的貢獻,目前已有3種Ru配合物進入臨床試驗階段。CHEN et al[22]合成并表征了3種以水楊酸鹽為配體的Ru(II)配合物,發現化合物(17)[Ru(phen)2(SA)]對腫瘤細胞具有明顯的活性,而對正常細胞株BEAS-2B具有較低的毒性。研究發現化合物14在G0/G1期通過誘導細胞凋亡和觸發細胞周期阻滯發揮抗癌作用?；衔?4可選擇性抑制Trx活性,促進活性氧的產生和積累,進而引發線粒體功能障礙和DNA損傷,最終導致人類非小細胞肺癌A549細胞凋亡。姜黃素可誘導癌細胞中不依賴caspase的程序性細胞死亡,但是其生物利用度和藥理動力學較差。CHEN et al[23]開發了一種新的姜黃素類似物(18)[1,5-雙(2-甲氧基苯基)五-1,4-二烯-3-酮],它可以抑制人類非小細胞肺癌細胞,還通過內質網應激介導的凋亡通路對肺癌細胞具有抑制作用,同時對正常細胞沒有任何可觀察到的毒性。HAN et al[24]發現依魯替尼(19)對各種B細胞惡性腫瘤有臨床活性,并且依魯替尼可以通過不可逆地抑制哺乳動物硫氧還蛋白還原酶來抑制人肝癌SMMC-7721細胞生長,從而引起活性氧升高、細胞凋亡。據報道,天然產物胡椒龍胺和川芎嗪通過上調活性氧水平對許多癌細胞有抑制生長作用。QIAN et al[25]發現一種新型胡椒龍胺/川芎嗪衍生物(20),并研究了其體內外藥理作用。其在耐藥Bel-7402/5-FU細胞中表現出抑制TrxR活性,增加活性氧水平,降低線粒體跨膜電位水平,發生DNA損傷和自噬,并且呈現濃度依賴性。YE et al[26]觀察并證實了乙烷硒啉(21)是逆轉對順鉑耐藥的白血病K562細胞的有效途徑。乙烷硒啉可特異性抑制TrxR活性,導致核因子κB (NF-κB)活性降低、Bax上調和Bcl-2下調。乙烷硒啉通過抑制TrxR而使順鉑耐藥的K562細胞中活性氧水平升高。酚嗪是一種含氮雜環化合物,其作為一種抗癌分子被廣泛報道。LIAO et al[27]對其類似物(CPUL1,22)具體的靶點進行研究發現,CPUL1可以和TrxR特異性結合,并且CPUL1在Trp-114,Val-118,Ala-495和Sec-498殘基之間形成了一個穩定的疏水區域。HU et al[28]設計并合成了一系列含硒tepotinib衍生物,并發現大多數含硒雜化體對c-Met和TrxR表現出強烈的雙重抑制活性。其中化合物8b(23)對人肝癌MHCC97H細胞的活性最強,半數抑制濃度(IC50)值為10 nM。通過對其作用機制的研究發現,化合物8b在G1期觸發細胞周期阻滯,并通過靶向TrxR引起活性氧積累,最終導致細胞凋亡。NI et al[29]建立了發現TrxR1抑制劑的高通量篩選試驗,并發現硫柳汞(24)是TrxR1的一種新型抑制劑。MENG et al[30]以胡椒龍葵胺為原料,設計合成了一系列單亞甲基環己酮和二亞甲基環己酮衍生物,并評價了其體內外藥理性質。其中化合物4f(25)表現出最高的抗癌效力,4f對TrxR的抑制作用比胡椒龍葵胺幾乎高出10倍。此外還發現4f可以增加活性氧水平,并且在體內對乳腺癌實體瘤也表現出較強的抑制作用。HE et al[31]報道了一系列bayis-hillman加合物的設計和合成,并鑒定了一種典型的加合物5f(26),該加合物對HepG2細胞具有優于其他類型癌細胞的細胞毒性。生物學研究表明,所選擇的加合物將細胞周期阻滯在G1/G0期,并且選擇性地靶向HepG2細胞中的TrxR,從而導致細胞內氧化還原穩態的崩潰。DONG et al[32]報道了一種新型TrxR抑制劑Au-24,可以通過降低線粒體膜電位和增加活性氧水平來抑制HepG2細胞的增殖,從而引起氧化應激、DNA損傷、自噬、細胞周期阻滯和凋亡。PACMA 31(27)的丙胺片段與TrxR的硒化半胱氨酸殘基共價相互作用[33],選擇性地抑制細胞中的TrxR活性,并進一步刺激低濃度下細胞內活性氧的產生,從而引發氧化硫氧還蛋白和氧化谷胱甘肽在細胞中的積累,誘導氧化應激介導的癌細胞凋亡。

4 展望

據報道,高水平的TrxR/Trx可在維持細胞表型的同時增強腫瘤增殖和侵襲,并與臨床耐藥性拓撲放化療相關,因此Trx系統很有可能是腫瘤治療的靶點。近年來研究表明,調節氧化還原機制對于治療特定腫瘤細胞有重要的作用,基于這一發現,我們認為特異性調節或干預氧化還原信號轉導途徑的分子在臨床的癌癥治療中顯示出巨大的潛力。調節或干擾氧化還原信號通路的分子在各種疾病的臨床研究以及臨床研究前期中顯示出巨大的前景。高度保守的Trx系統無處不在,參與各種細胞過程。它是細胞內主要的抗氧化防御系統,不僅調節細胞內氧化還原穩態,還影響能量代謝、調節免疫反應、控制細胞生長和存活,在調節細胞凋亡相關途徑中起著關鍵作用。盡管Trx/TrxR抑制劑作為多種疾病的治療藥物已引起廣泛關注,但該領域的未來研究仍存在一些挑戰。研究Trx/TrxR抑制劑的候選藥物和治療策略,進一步開發調節活性氧穩態的小分子用來治療癌癥有很廣闊的應用前景和重要意義。