UDP-糖基轉移酶GmSGT2催化金盞花苷E的半乳糖基修飾

孫秋艷,郭 芳,李 春,2,馮旭東

(1.北京理工大學 化學與化工學院 化學工程系 生物化工研究所 醫藥分子科學與制劑工程工業和信息化部重點實驗室,北京 100081;2.清華大學 化學工程系 工業生物催化教育部重點實驗室,北京 100084)

三萜化合物因其種類繁多、結構多樣以及具備豐富的生理藥理活性被廣泛應用于食品、醫藥和化妝品等領域,已經成為人類生活中不可缺少的一部分[1]。三萜化合物通過適度引入糖基修飾可增加化合物的水溶性,減少毒副作用;同時,因糖基種類及結構的多樣性,糖基修飾又可進一步豐富三萜化合物及其衍生物的種類,生成具有不同藥理學功能的化合物[2-3]。如,人參皂苷只有兩種苷元,即達瑪烷型和齊墩果烷型,但通過不同糖基修飾衍生出的人參皂苷在25種以上[4]。目前,三萜化合物及其糖苷衍生物主要由植物提取、化學合成以及生物合成等方式獲得。由于一些特定的三萜糖苷化合物在植物中含量低且植物生長周期長,所以植物提取法耗時費力,來源于甘草根中的甘草酸,需要挖根提取,嚴重破壞土壤生態和植被[5-6]?；瘜W法糖基修飾通常需要苛刻的反應條件、多步驟的保護/去保護過程來控制糖修飾的區域選擇性,所以存在反應過程煩瑣、產物定向性差、單糖修飾居多等缺點[7-8]。隨著糖基數量的增加,這些問題更加嚴重,無法實現綠色可持續性生產。近年來,通過生物酶法合成糖苷類化合物受到了越來越多的關注。特別是,利用UDP-糖基轉移酶(UGT)可以解決上述問題,因為酶催化反應條件溫和,以高區域選擇性將UDP-糖從供體轉移到受體,可實現高效合成糖苷衍生物[9-12]。

目前,越來越多的UGT被鑒定及表征,并作為綠色生物催化劑,用于合成高價值糖苷化合物[13-15]。如,UGT51催化原人參二醇糖基化生成潛在的抗癌藥物人參皂苷Rh2[16]。來源于烏拉爾甘草的UGT73C11,催化甘草次酸糖基化生成甘草次酸-3-氧-單葡萄糖(GLMG)[17]。來源于擬南芥的AtUGT78D2和AtUGT79B1催化槲皮素生成槲皮素-3-氧-葡萄糖基-木糖苷等[18]。目前報道的大多數UGT僅能實現單糖基修飾,對于可實現兩個或兩個以上糖基修飾的UGT研究報道較少,但利用UGT實現二糖或多糖修飾對合成糖苷衍生物具有重要意義。由于缺少實現二糖或多糖修飾的UGT,這限制了糖苷衍生物的多樣性,不利于挖掘具有更多價值的糖苷衍生物。

這個故事流傳非常廣，以至于“割席斷交”成了一個成語，在后世常被用來表示自己的高潔不愿意同流合污。金塊代表的是世人夢寐以求的財富，官員的豪華儀仗代表的是世人無限向往的尊貴。但是對于知識分子特別是古代士族來說，富和貴都和所謂的“清名”成了矛盾，正因為大多數世俗的人追求富貴，所以少數士族讀書人的特立獨行才有著“世人皆濁我獨清”的傲立于世的姿態，仿佛這是一種時尚一種無上的光榮。后人讀這個故事，大多在自覺不自覺地接受一種道德評判，即管寧是清高的，華歆是世俗的；管寧相對來說是正面的人物值得學習，華歆相對來說是反面人物，要接受世俗的唾棄與不屑。

金盞花苷E又稱去葡萄糖竹節參皂苷,是從竹節參中提取得到的五環三萜糖苷類化合物,在抑制HepG2細胞增殖擴散方面具有重要作用[19]。目前已報道的金盞花苷E糖基修飾類型僅有葡萄糖基修飾,特別是半乳糖作為一種重要的糖基修飾,在改善天然產物的藥理活性方面具有重要作用。如,在大豆皂醇B單葡萄糖醛酸(SBMG)的3號位葡萄糖醛酸再修飾一個半乳糖即形成大豆皂苷Ⅲ,其抗皰疹病毒、抗溶血、保肝能力增強[20-21];半乳糖修飾糖苷衍生物大豆皂苷Bb,可以治療骨質疏松等。但鮮有對金盞花苷E進行半乳糖修飾的報道。

來源于大豆的UDP-糖基轉移酶GmSGT2可以催化SBMG、甘草次酸單葡萄糖醛酸(GAMG)和尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)反應,分別生成甘草次酸單葡萄糖醛酸-半乳糖(Gal-GAMG)與大豆皂苷Ⅲ[22-23]。GAMG、SBMG同屬于齊墩果烷型五環三萜化合物,結構與金盞花苷E十分相似,因此,通過對該酶的序列及結構的進一步分析,推測GmSGT2可能具備催化金盞花苷E的功能。因此,本研究中,筆者首次對大豆糖基轉移酶GmSGT2催化金盞花苷E進行功能驗證,并通過分子對接研究揭示GmSGT2催化金盞花苷E與UDP-半乳糖反應時的識別機制,以期為利用酶法合成新的半乳糖苷衍生物提供指導意義。

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒構建

質粒pET28a-GmSGT2及工程菌E.coliBL21-GmSGT2 (DE3),筆者所在課題組前期構建保存。GmSGT2基因(登錄號為AB473730.1)、E.coliDH5α與E.coliBL21(DE3),北京博邁德基因技術有限公司;pET28a質粒,德國Novagen公司。

要評估一個P波未下傳是由于被阻滯還是被干擾所致，首先要看心房率。當心房率足夠慢，則可診斷為阻滯。心房率過快(>135次/min)時出現的房室分離P波未下傳心室，通常是由生理性不應期引起的房室傳導功能障礙所致，此種情況不能診斷為房室阻滯[1]。

1.2 試劑與儀器

利用AKTA純化儀對GmSGT2粗酶液進行Ni2+柱純化,用5倍柱體積重蒸水(ddH2O)清洗Ni2+柱,再用5倍柱體積蛋白純化平衡液(50 mmol/L PBS、25 mmol/L咪唑、15 mmol/L NaCl,pH 7.4)平衡Ni2+柱,流速1.0 mL/min 將GmSGT2粗酶液過Ni2+柱,用5倍柱體積含有75 mmol/L咪唑的洗脫液(50 mmol/L PBS、75 mmol/L咪唑、15 mmol/L NaCl,pH 7.4)清洗雜蛋白,再用3倍柱體積含有225 mmol/L咪唑的洗脫液(50 mmol/L PBS、225 mmol/L咪唑、15 mmol/L NaCl,pH 7.4)洗脫目標蛋白并收集至離心管,測定蛋白濃度,得到GmSGT2純酶。(50 mmol/L 不同pH的 PBS配制參照Thermo Scientific官網PBS溶液配制)。

LC-30A型超高效液相色譜儀(UPLC),日本島津公司;6460 Triple Quad型液相色譜-質譜聯用儀, Agilent公司;PowerPac 3000gajf 電泳儀,Bio-Rad有限公司;DK-8D型恒溫水浴鍋,上海一恒科技有限公司;AKTA純化儀, GE Healthcare公司;Jinbio低溫高壓細胞破碎儀,廣州聚能納米生物科技股份有限公司;Avanti-JXN-26型高速冷凍離心機,貝克曼庫爾特公司;Nanodrop 2000c型超微量分光光度計,賽默飛世爾科技公司。

1.3 GmSGT2工程菌株的培養與純化

將構建成功的BL21接種到含有50 μg/mL卡那青霉素的30 mL LB液體培養基中,37 ℃搖床過夜培養,按照體積分數1%的接種量,將種子液接種至新鮮LB培養基中,37 ℃培養至OD600為0.8,加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),16 ℃過夜誘導后8 000 r/min離心2 min收集菌體,按照體積比1∶40加入50 mmol/L的Na2HPO4-NaH2PO4-NaCl緩沖液(PBS,pH 7.5)重懸菌體,在4 ℃、100 MPa條件下,利用低溫超高壓破碎儀破碎4次,12 000 r/min離心30 min,收集上清液,得到粗酶液。

所用引物由安升達(天津)生物科技有限公司合成;金盞花苷E,天津伐木易生物科技有限公司;UDP-阿拉伯糖(UDP-Ara)、UDP-半乳糖(UDP-Gal),廣州昂飛生物科技有限公司; UDP-木糖(UDP-Xyl)、UDP-葡萄糖(UDP-Glc)、UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)、UDP-鼠李糖(UDP-Rha),蘇州漢酶生物技術有限公司;齊墩果酸、白樺脂酸,阿拉丁試劑(上海)有限公司;3-氧-葡萄糖-齊墩果酸、28-氧-葡萄糖-齊墩果酸、3,28-氧-雙葡萄糖-齊墩果酸、3-氧-葡萄糖-白樺脂酸、28-氧-葡萄糖-白樺脂酸,自制;其他所用化學藥品均為市售分析純。

1.4 金盞花苷E半乳糖苷衍生物檢測方法

反應樣用0.22 μm有機濾膜過濾,利用UPLC檢測,檢測條件:色譜柱Agilent公司的InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(100 mm×2.1 mm,2.7 μm)、檢測波長203 nm、流動相為乙腈(A)和0.1%磷酸(B)、流速為0.3 mL/min、柱溫箱40 ℃、上樣量3 μL,具體梯度洗脫程序為0～1.0 min 60% B溶液、1～2.4 min 43% B溶液、2.4～2.6 min 40% B溶液、2.6～3.4 min 30%B溶液、3.4～4.25 min 24% B溶液、4.25～4.6 min 5% B溶液、4.6～5.0 min 0% B溶液、5.0～6.5 min 0% B溶液、6.5～7.0 min 60% B溶液、7.0～9.5 min 60% B溶液。LCMS檢測條件同UPLC檢測方法,流動相為乙腈(A)和0.1%甲酸(B),采用陰離子與陽離子雙模式檢測。

2) 墻體水平位移時程曲線：在此選擇三個有代表性的墻體水平位移監測點ZQT-01、ZQT-03、ZQT-23隨著土方開挖的變形時程曲線進行分析，三個測點的變形時程曲線見圖3～圖5。

1.5 GmSGT2酶學性質表征

因為GmSGT2可以催化SBMG與UDP-Gal反應生成大豆皂苷Ⅲ,還可催化GAMG生成GAMG-Gal,同時SBMG與GAMG都屬于齊墩果烷型五環三萜化合物,且3號位均修飾一個葡萄糖醛酸,金盞花苷E均符合以上結構特征。因此,以UDP-Gal為糖基供體,金盞花苷E為糖基受體,探究GmSGT2的催化活性,結果如圖1所示。

1.課內：開展“以學生為主體，教師為主導，訓練為主線”的情境教學法，進行情境教學探索與研究。課堂教學中采用“貼近生活展現情境”“引導學生擴寫，描述情境”“利用音樂渲染情境”三情境法開展課堂教學，喚醒他們自身對生活的感受，使學生由被動的學習者，變為有主觀情感積極參與的藝術再創造者。進行情境教學法探索與研究對老師的知識、能力及奉獻精神提出了更高的要求，需要老師精心設計教學內容，同時借助多媒體技術，將同學們帶入詩境；做好適當鋪墊，憑借詩境，弄清詩意；反復吟誦，咀嚼詩句，體驗詩情。

病理表現 灰黃色腫物1枚，表面光滑，包膜完整，切面灰黃色，質中，局部見鈣化。光鏡下可見典型的細胞致密區(Antoni A區)及細胞疏松區(Antoni B區)，瘤細胞呈編織狀排列，未見明確柵欄狀結構(圖3)，免疫組織化學檢查顯示：波形蛋白 (彌漫強+)、S-100(彌漫強+)(圖4)。結合形態及免疫組織化學染色結果，考慮為神經鞘瘤。

為了探究GmSGT2的最適溫度,構建100 μL反應體系,反應體系同熱穩定性,在不同反應溫度(25、30、35、40、45、50、55和60 ℃)條件下反應時間2 h,加400 μL甲醇終止反應,UPLC檢測。定義在40 ℃下 GmSGT2 催化金盞花苷E反應的酶活為100%。

為了探究GmSGT2的最適pH,構建100 μL反應體系,反應體系同上,使用不同pH的50 mmol/L緩沖液定容至100 μL,在35 ℃條件下反應2 h,加400 μL甲醇終止反應,UPLC檢測,其中,pH 5～6的緩沖液為檸檬酸鈉-檸檬酸,pH 6～8的緩沖液為Na2HPO4-NaH2PO4,pH 8～9的緩沖液為Tris-HCl,pH 9～14的緩沖液為Na2CO3-NaHCO3。定義在pH 9.0 Tris-HCl條件下,GmSGT2 催化金盞花苷E反應的酶活為100%。

為了探究GmSGT2糖供體特異性,構建100 μL反應體系,分別使用UDP-Ara、UDP-Gal、UDP-Xyl、UDP-Glc、UDP-GlcA和UDP-Rha作為糖供體,金盞花苷E為糖基受體,反應體系同上,在35 ℃條件下反應2 h;探究GmSGT2底物特異性,構建100 μL反應體系, UDP-Gal為糖基供體,分別使用金盞花苷E、齊墩果酸、白樺脂酸、3-氧-葡萄糖-齊墩果酸和28-氧-葡萄糖-齊墩果酸、3,28-氧-雙葡萄糖-齊墩果酸、3-氧-葡萄糖-白樺脂酸、28-氧-葡萄糖-白樺脂酸作為糖基受體,反應體系同上,在35 ℃條件下反應2 h,加400 μL甲醇終止反應,UPLC檢測。

由原始的決策原則[10]可知，當證據融合后出現兩個或者多個可信度值相同且最大時，原始準則無法判斷。若選擇某元素作為結果可能導致誤判。為了解決以上問題，改進后的決策原則的結果滿足式(7)。

為了探究GmSGT2催化金盞花苷E的酶活影響,設計兩組實驗,構建100 μL反應體系,實驗組一:GmSGT2 50 μg,金盞花苷E 500 μmol/L,UDP-Gal 500 μmol/L,pH7.5的50 mmol/L PBS緩沖液定容至100 μL,35 ℃水浴鍋,反應時間分別為1、2、3、4、5和6 h,加400 μL甲醇終止反應,12 000 r/min離心1 min,過膜,利用UPLC進行檢測。實驗組二:GmSGT2 100 μg,其反應體系、反應時間、檢測方法同實驗組一。

1.6 GmSGT2催化金盞花苷E動力學常數測定

為了測定GmSGT2對金盞花苷E的催化效率,構建100 μL反應體系,加入GmSGT2 25 μg,UDP-Gal 50 mmol/L,金盞花苷E 濃度分別為0.05、0.08、0.1、0.2、0.25、0.5、1、2和5 mmol/L,在最適溫度、pH條件下反應10 min,加400 μL甲醇終止反應,UPLC檢測;利用GraphPad Prism 9.0進行擬合。

1.7 蛋白分子對接

UDP-Gal和金盞花苷E使用ChemBioDraw 12.0 and ChemBio3D 12.0進行修飾。利用SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)對GmSGT2蛋白同源建模,獲得GmSGT2的3D結構,利用AutoDockTools-1.5.6進行對接分析,使用PyMOL 1.8進行可視化分析。

2 結果與討論

2.1 GmSGT2催化金盞花苷E生成半乳糖苷衍生物及MS分析結果

為了探究GmSGT2在35 ℃條件下的熱穩定性,構建100 μL反應體系,加入GmSGT2 50 μg,金盞花苷E 500 μmol/L,UDP-Gal 500 μmol/L(無特殊說明,底物濃度均為500 μmol/L),pH 7.5的50 mmol/L PBS定容至100 μL,將GmSGT2置于35 ℃的水浴鍋,分別取不同時間(0、0.5、1.0、1.5、2、3、4、5和6 h)的蛋白在35 ℃反應1 h后,加400 μL甲醇終止反應,12 000 r/min離心1 min,過膜,利用UPLC進行檢測。定義GmSGT2 催化金盞花苷E 0 h反應的酶活為100%。

圖1 GmSGT2催化金盞花苷E生成半乳糖苷衍生物Fig.1 Synthesis of galactoside derivatives from calunduloside E by GmSGT2

教師介紹：20世紀初期，一些生物學家已經在一些昆蟲的細胞中發現了性染色體。教師展示雄果蠅的染色體圖、男性的染色體圖，并提出問題：（1）X染色體、Y染色體大小相同嗎？（2）X染色體都比Y染色體大嗎？（3）X染色體、Y染色體是同源染色體嗎？（4）所有生物都有性染色體嗎？教師展示X染色體、Y染色體的同源區段和非同源區段的圖片，以此加深學生對性染色體的認識。

2.2 GmSGT2催化底物特異性

以常用的UDP-Ara、UDP-Xyl、UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-Rha和UDP-GlcA作為糖基供體,以金盞花苷E為糖基受體,探究了GmSGT2的糖供體特異性,結果如圖2所示。

由圖1可知:GmSGT2可催化金盞花苷E與UDP-Gal反應,僅在3.4 min出現1個新峰,推測為金盞花苷E-半乳糖;對新峰進行LC-ESI-MS分析(圖1(c)),新峰分子量為794.6,與推測結果一致,說明GmSGT2催化金盞花苷E僅生成金盞花苷E-半乳糖,無其他副產物生成。

圖2 GmSGT2的糖基受體、糖基供體特異性Fig.2 Specificity of sugar acceptor and donor of GmSGT2

由圖2可知:GmSGT2催化UDP-Gal與金盞花苷E反應活性最高,金盞花苷E轉化率為64.72%,催化UDP-Glc、UDP-Xyl和UDP-Ara反應的酶活性次之,金盞花苷E轉化率分別為24.43%、22.59%和16.03%, 這與文獻[23]報道一致,GmSGT2更偏好于UDP-Gal為糖基供體。這可能與GmSGT2天然催化活性有關,GmSGT2催化SBMG與UDP-Gal反應生成大豆皂苷Ⅲ[22]。

GmSGT2還可催化3-氧-葡萄糖-齊墩果酸、3,28-氧-雙葡萄糖-齊墩果酸、3-氧-葡萄糖-白樺脂酸與UDP-Gal反應;GmSGT2不能催化28-氧-葡萄糖-齊墩果酸、28-氧-葡萄糖-白樺脂酸,說明GmSGT2僅能實現3號位糖上加糖,不能實現28號位糖上加糖。雖然同為五環三萜單糖修飾化合物,但催化金盞花苷E的效率要高于其他化合物,這可能是因為其3號位修飾的是葡萄糖,而非葡萄糖醛酸,因為SBMG作為天然底物,其修飾就是葡萄糖醛酸,與金盞花苷E結構更接近。

2.3 GmSGT2催化金盞花苷E反應酶學性質表征

探究不同反應條件下GmSGT2催化金盞花苷E的酶學性質,結果見圖3(a)～(c)。

圖3 溫度、pH、孵育時間和酶量對轉化率或酶活的影響Fig.3 Effects of temperature,pH,incubation time and enzyme concentration on the conversion rate or enzyme activity

由圖3(b)可知:當pH為7.5時,GmSGT2酶活最高,GmSGT2催化金盞花苷E的最適pH約為7.5;在pH為7.5～9的緩沖液中,堿性GmSGT2酶活較高,均在80%以上。在相同pH不同類型緩沖液中,GmSGT2催化金盞花苷E的酶活也不一樣,在pH為6的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液中,其相對酶活僅有63.13%,而在pH為6的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中,其相對酶活為87.20%,相差了24.07%。即使是相同pH的不同緩沖液也會對酶的活性產生影響,這與文獻[23-24]結果一致。與多數UDP-糖基轉移酶催化特點相似,GmSGT2催化反應的最適pH為7～9,偏堿性。

由圖3(a)可知:GmSGT2催化金盞花苷E的最適溫度是40 ℃,當溫度為35 ℃時,相對酶活為89.40%;當溫度達到45 ℃時,GmSGT2相對酶活受到較大影響,相對酶活為48.36%,GmSGT2受溫度影響較大。這與GmSGT2催化GLMG的結果相似,在45 ℃條件下,GmSGT2催化GLMG的相對酶活約為最適溫度下的48%,活性下降明顯,但GmSGT2催化GAMG受溫度影響比GLMG與金盞花苷E的影響較小。與其他UGT性質相似,如UGT73P28催化環黃芪醇反應的最適溫度是37 ℃,而UGT催化反應的最適溫度為35～40 ℃[24]。

由圖3(c)可知:當孵育0.5 h后,GmSGT2對金盞花苷E和UDP-Gal的相對酶活依然有90.32%;孵育2 h后,GmSGT2相對活性剩余74.23%,GmSGT2催化活性下降相對緩慢;在2 h之后,穩定性急劇下降,孵育3 h后,GmSGT2相對酶活為35.93%;經過5 h的孵育,GmSGT2相對酶活性僅剩9.76%。

為了進一步驗證GmSGT2催化金盞花苷E與UDP-Gal反應酶活,設置不同酶量反應、定點時間取樣檢測,結果如圖3(d)所示。由圖3(d)可知:與GmSGT2熱穩定性趨勢一致,當控制GmSGT2為50 μg時,反應3 h后,金盞花苷E轉化率趨于穩定,轉化率為72.67%;當酶量增加至100 μg,保持其他反應條件不變,金盞花苷濃度仍為0.5 mmol/L,3 h后金盞花苷E的轉化率達到95.03%,說明在相同時間內,限制金盞花苷E轉化率的主要原因是有效酶分子數量,通過增大酶量,金盞花苷E轉化率達到95%。在100 μg酶量的反應體系下,當金盞花苷E濃度為250 μmol/L時,可實現底物100%轉化。

GmSGT2從大豆cDNA中克隆獲得,所用引物為GmSGT2-F:5′-C￣G￣C￣G￣G￣A￣T￣C￣C￣A￣T￣G￣G￣A￣G￣A￣A￣G￣A￣A￣G￣A￣A￣G￣G￣G￣T￣G￣A￣G￣C￣T￣A￣A-3′,GmSGT2-R:5′-A￣T￣A￣A￣G￣A￣A￣T￣G￣C￣G￣G￣C￣C￣G￣C￣T￣T￣A￣A￣G￣G￣A￣T￣T￣G￣G￣G￣T￣G￣C￣G￣G￣T￣C￣T￣C￣T￣T￣G￣A-3′。引物包含2個限制性內切酶位點BamHⅠ、NotⅠ,分別位于GmSGT2的5′端和3′端。將6個組氨酸殘基融合到重組酶GmSGT2的N端,消化連接GmSGT2基因至表達載體pET28a,構建pET28a-GmSGT2質粒。將得到的質粒通過大腸轉化至大腸桿菌感受態細胞DH5α和BL21(DE3)。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0統計軟件進行分析。計量資料以表示，進行Pearson相關分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2.4 GmSGT2催化金盞花苷E的動力學常數

利用GraphPad Prism 9.0軟件進行擬合,結果如圖4所示。

圖4 GmSGT2米氏動力學常數的測定Fig.4 Michaelis constant of GmSGT2

由圖4可知:GmSGT2催化金盞花苷E反應的Km(Km為酶催化反應速率達到最大反應速率一半時的底物濃度)為(0.12±0.03) mmol/L,kcat(kcat為催化常數)為(0.32±0.02) s-1,催化效率kcat/Km是(2.71±0.22) L/(mmol·s),與文獻[23]的結果相比,GmSGT2催化GAMG的催化效率kcat/Km是0.78 L/(mmol·s),GmSGT2催化金盞花苷E的催化效率kcat/Km是催化GAMG 的3.4倍[23]。由此可見,GmSGT2催化UDP-Gal反應時,金盞花苷E是更好的糖基受體。

2.5 GmSGT2分子對接

通過SWISS-MODEL,GmSGT2同源建模的參數分別為Seq Identity:65.50%;GMQE:0.89;QMEAN:-1.26,說明UGT73P12可以作為GmSGT2模型[9],通過AUTODOCK-Vina對接,結果如圖5所示。

圖5 GmSGT2催化金盞花苷E與UDP-Gal反應的底物識別機制Fig.5 Substrate recognition mechanism of GmSGT2 toward calunduloside E and UDP-Ga-Gal

由圖5可知:Ser19、Ala146、Arg260、Tyr262、Ser291、Leu353、Trp370、Asn371、Thr372和Glu391發揮底物識別作用,His20作為催化氨基酸,與Asp123-金盞花苷E形成復合體,催化金盞花苷E反應生成半乳糖苷衍生物,這與已報道的UDP-糖基轉移酶底物催化機制一致[24-25]。通過分子對接闡明GmSGT2底物識別機制,便于理解GmSGT2催化的反應機制。

選擇李維平主編的《蛋白質工程》[9]為教材．該書為“案例版”生物工程系列規劃教材，普通高等教育“十二五”規劃教材．

3 結論

GmSGT2催化金盞花苷E與UDP-Gal反應得到新的糖苷衍生物金盞花苷E-半乳糖。GmSGT2還可催化3-氧-葡萄糖-齊墩果酸、3,28-氧-雙葡萄糖-齊墩果酸、3-氧-葡萄糖-白樺脂酸與UDP-Gal反應生成新的半乳糖苷衍生物。GmSGT2催化金盞花苷E的最適溫度、pH分別為40 ℃、7.5,這與多數糖基轉移酶特征一致。在最適溫度、pH反應條件下,GmSGT2催化金盞花苷E的催化效率kcat/Km為(2.71±0.22) L/(mmol·s)。

通過分子對接分析發現,Ser19、Ala146、Arg260、Tyr262、Ser291、Leu353、Trp370、Asn371、Thr372和Glu391發揮底物識別作用,His20-Asp123-金盞花苷E形成復合體,催化金盞花苷E反應生成半乳糖苷衍生物。