殼聚糖-大豆蛋白-百里香酚乳液制備及其對大口黑鱸保鮮效果

王世哲，黃 琪，凌玉釗，劉 斌，譚宏淵，喬 宇，汪 蘭，熊光權，汪 超

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068；2.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064)

自然界中含有大量大分子食源性蛋白、多糖及食品級的膠體顆粒，如纖維素[1]、淀粉[2]、蛋白質[3]、脂質[4]等，均具有成本低、無毒、成膜性好等特點，常常應用于可食膜的基質。目前多利用蛋白質與多糖[5,6]、多糖與多糖[7]之間的相互作用來制備固體顆粒穩定乳液。袁楊等[8]通過控制不同的pH 值、復合比、溫度和離子強度，發現大豆蛋白和殼聚糖形成的復合水溶液體系穩定性極佳。孫穎恩等[9]利用大豆蛋白-殼聚糖凝聚物制備微藻油乳液，改善了微藻油乳液的物理穩定性及氧化穩定性。王柏琪等[10]發現殼聚糖與酯化大豆蛋白形成的復合物具有較好的乳化性和抗菌性。綜上，以大豆分離蛋白與殼聚糖為基質形成的復合乳液具有優異的穩定性、乳化性及抑菌性。

大豆分離蛋白，簡稱大豆蛋白，是天然大分子，營養價值很高，自身具有的雙親性結構使其作為乳化劑能夠擴散吸附在油-水界面[11]。百里香酚是疏水性酚類物質，其抑菌活性優于香芹酚、丁香酚等其他植物精油[12,13]。研究發現，百里香酚在非熱條件下可促進大豆蛋白形成凝膠結構[14]，大豆蛋白加入后，蛋白質與多糖的相互作用及大豆蛋白與百里香酚形成的凝膠結構均影響乳液的穩定性[15,16]。目前，基于殼聚糖與大豆蛋白分子間相互作用及殼聚糖與百里香酚的協同抗菌作用[17]，將CST 乳液應用于水產品保鮮具有一定的現實意義，且鮮見將殼聚糖、大豆蛋白與百里香酚三者制成乳液用于水產品保鮮方面的研究報道。本研究通過控制大豆蛋白的添加量，構建多糖-蛋白質復合體系，通過殼聚糖與大豆蛋白分子間相互作用改善百里香酚表面活性，制成不同大豆蛋白濃度的殼聚糖-大豆蛋白-百里香酚（CST）復合乳液，研究其乳化活性指數、乳化穩定性指數、乳析指數等的變化。

大口黑鱸（Micropterus salmoides）是我國重要的飼養魚之一，且大口黑鱸的預制菜市場很大[18]。目前冷鏈物流行業運輸過程中貯藏溫度多為10 ℃左右，因此本研究將經最佳配比CST乳液處理后的鱸魚肉塊與對照組在10 ℃下貯藏，檢測魚肉的pH、揮發性鹽基氮和菌落總數，驗證乳液保鮮效果，以期為新型乳化劑在水產品保鮮中的應用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑 百里香酚（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；大豆分離蛋白、8-苯胺-1-萘磺酸溶液（ANS），上海源葉生物科技有限公司；大豆油，食品級，益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；殼聚糖（脫乙酰度80.0%～95.0%），購自國藥集團化學試劑有限公司；平板計數瓊脂，青島海博生物技術有限公司；氨水（體積分數20%，分析純），上海阿拉丁生化科技有限公司?？捡R斯亮藍試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.1.2 主要儀器 K9840型自動凱氏定氮儀（海能未來技術集團股份有限公司）；Zetasizer Nano-ZS 型電位分析儀（英國馬爾文公司）；Mastersizer2000 激光粒度分析儀（英國馬爾文公司）；Flavour Spe GCIMS 聯用儀1H1-00053（德國G.A.S 公司）；尼康YS100生物顯微鏡（上海蔡康光學儀器有限公司）。

1.1.3 主要材料 鮮活大口黑鱸（M.salmoides）購于湖北省武漢市洪山區武商量販超市，1 h內運至實驗室待用。

1.2 方法

1.2.1 CST 乳液的制備 1 g 殼聚糖加入到100 mL體積分數1%乙酸溶液。將2 g 百里香酚加到體積分數2% 100 mL 吐溫-80 溶液，放入45 ℃恒溫水浴鍋中攪拌至充分溶解。將上述制備的兩個溶液按照體積比1∶1 混合，得到含有質量分數0.5%殼聚糖、質量分數1.0%百里香酚的混合液，將其置于45 ℃磁力攪拌水浴鍋保溫。加入4 g 大豆蛋白，待大豆蛋白全部溶解后，再加入50 mL大豆油（SBO），將溶液冷卻至室溫后，以18 000 r/min 轉速均質3 min，得到大豆蛋白質量分數為1.6%的CST 乳液。按照上述方法依次加入6、8、10、12 g 大豆蛋白制備質量分數2.4%、3.2%、4.0%和4.8%大豆蛋白添加量的CST乳液。

1.2.2 CST 乳液乳化活性指數（EAI）和乳化穩定性指數（ESI）的測定 EAI（m2/g）和ESI（%）參考Gao等[19]和Zhang等[20]方法。

1.2.3 CST乳析穩定性的測定 乳析指數（CI，%）參考Zhang等[20]方法。

1.2.4 CST乳液物理穩定性的測定 物理穩定性KE（%）參考Hu等[21]方法。

1.2.5 CST 乳液蛋白溶解度的測定 蛋白溶解度（%）參考Zhang等[20]方法。

1.2.6 CST 乳液表面疏水性的測定 表面疏水性參考Kato 等[22]并略作修改。將乳液以8 000 r/min 離心30 min，取50 μL 蛋白質上清液用去離子水稀釋至5 mL，將蛋白溶液稀釋到五個不同濃度梯度（0.05、0.10、0.20、0.30、0.40 mg/mL），在溶液中各加入40 μL 8 mmol/L ANS 溶液，使用熒光分光光度計測定熒光強度。以熒光強度對蛋白質量濃度作圖并得到線性回歸方程，初始段斜率值即為表面疏水性。

1.2.7 CST 乳液粒徑、電位的測定 粒徑、電位參考Chen 等[23]并略作修改。使用激光粒度分析儀測定乳液的粒度。使用去離子水將乳液稀釋1 000 倍，然后裝入DTS1070 毛細管比色杯，在電位分析儀測定乳液的Zeta 電位。分散相和連續相的折射率分別設置為1.475和1.330。

1.2.8 CST乳液濁度分析 濁度參考Hu等[21]方法。

1.2.9 紫外吸收光譜分析 紫外吸收光譜參考Yan等[24]方法。

1.2.10 CST 乳液美拉德反應物生成指數分析 美拉德反應物生成指數參考Yu 等[25]并略作修改。用去離子水將乳液稀釋400 倍，分別測定其在294 nm和420 nm波長處光密度D294nm、D420nm。

1.2.11 內源熒光光譜分析 內源熒光光譜參考Yan等[24]并略作修改。將乳液稀釋成蛋白質量濃度為0.2 mg/mL 的待測液，然后在熒光分光光度計掃描其熒光強度。程序參數為：激發波長280 nm，發射波長280～400 nm，激發和發射狹縫寬分別為5 nm和1 nm，掃描頻率為1 200 nm/min。重復掃描5次。

1.2.12 CST 乳液的微觀結構觀察 參考Gao 等[19]的方法。

1.3 原料處理及指標測定

大口黑鱸，體長（33.0±2.0）cm，去頭、尾、鱗，取背部肌肉切分成小塊（平均質量約為50 g）。將切分的魚肉塊放入最佳配比的乳液中，魚肉與浸泡液質量比為1∶2，浸泡時間為30 min。用中速濾紙吸干魚片表面殘留的浸泡液，然后將魚塊放入蒸煮袋并進行真空封裝。將制備好的樣品放入10 ℃恒溫箱每天取樣。在貯藏期間測定樣品的總揮發性鹽基氮（TVB-N）含量、菌落總數（TVC）、pH指標，具體參考GB5009.228—2016并略作修改，以去離子水作為試劑空白組。

1.4 數據處理

實驗均進行三次重復，實驗數據以平均值±標準差表示。使用統計分析軟件SPSS 19.0 通過Duncan 多重極差檢驗在顯著性水平（P＜0.05）上確定樣品間的差異，用視化軟件Origin 9.4繪圖。

2 結果與討論

2.1 大豆蛋白添加量對CST乳液乳化性的影響

圖1 可以看出，添加質量分數3.2%、4.0%和4.8%大豆蛋白的CST 乳液EAI較大，且三者之間差異不顯著（P＞0.05）。各濃度下ESI 變化不顯著（P＞0.05）。添加質量分數3.2%大豆蛋白的CST 乳液乳液EAI 和ESI 最大，為（8.85 ± 0.13）m2/g 和（0.92±0.18）%。隨著大豆蛋白含量升高，大豆蛋白與溶液中殼聚糖的親水基團充分接觸，使蛋白質的疏水基團暴露，增加了蛋白質的疏水性，蛋白質的疏水-親水平衡得到改善，從而使乳液穩定性提高。同時，大豆蛋白與殼聚糖相互作用使其電荷增多，黏度增加，導致乳液乳化性增強[26]。在大豆蛋白低濃度時，殼聚糖含量高，乳液黏度大，大豆蛋白結構無法展開，疏水性差，導致乳液穩定性差。隨著大豆蛋白含量增加，大豆蛋白與殼聚糖相互作用，蛋白-多糖結構逐漸成立，乳液也趨于穩定[27]。

圖1 大豆蛋白質量分數對CST乳液乳液活化指數和乳液穩定性指數的影響Fig.1 Effects of soybean protein mass fraction on CST emulsion ESI and EAI

2.2 大豆蛋白添加量對CST 乳液乳析指數及乳液狀態的影響

由圖2(a)可知，隨著貯藏時間的增加，CST 乳液的乳析指數不斷增加，添加質量分數3.2%、4.0%和4.8%大豆蛋白的CST乳液乳析指數在放置5 d時達到最高點，這可能是由于隨著油相比例增大，乳液的乳清高度隨貯藏時間的增加而增加，當大豆蛋白添加量低時，乳液無法形成穩定的蛋白-多糖復合結構，殼聚糖不能將全部的油滴吸附在其表面，自由的油滴容易聚合進而導致其破壞乳液穩定性。乳液狀態如圖2(b)所示，符合乳析指數的變化趨勢。

圖2 大豆蛋白質量分數對CST乳液乳析指數及乳液狀態的影響Fig.2 Effects of soy protein mass fraction on the creaming index and status of CST emulsions

2.3 大豆蛋白添加量對CST 乳液內源性熒光強度的影響

內源性熒光常被用于檢測蛋白質的色氨酸殘基所處微環境變化及蛋白質三級結構變化，可以用來檢測蛋白質空間結構的變化。如圖3 所示，隨著大豆蛋白濃度的升高，熒光譜圖的最大熒光強度先升高后降低，添加質量分數3.2%大豆蛋白的CST乳液熒光強度最大。這可能是因為隨著大豆蛋白濃度升高，大豆蛋白暴露的色氨酸增多，導致熒光譜圖最大強度增加。隨著大豆蛋白濃度繼續升高，殼聚糖吸附在大豆蛋白表面形成顆粒，大豆蛋白表面暴露出的色氨酸減少導致熒光猝滅，使熒光譜圖最大強度減小[28,29]。王柏棋等[10]在對酯化大豆蛋白與殼聚糖相互作用復合乳液的研究中也發現相似的結果。

圖3 大豆蛋白質量分數對CST乳液熒光強度的影響Fig.3 Effects of soy protein mass fraction on fluorescence intensity of CST emulsion

2.4 大豆蛋白添加量對CST 乳液粒徑、Zeta-電位和乳滴微觀結構的影響

圖4(a)所見，隨著大豆蛋白濃度的增加，乳液的表面積加權平均粒徑D(3,2)和體積加權平均粒徑D(4,3)均呈現下降的趨勢，但添加質量分數3.2%～4.8%大豆蛋白的CST 乳液粒徑無顯著差異（P＞0.05）。當大豆蛋白質量分數為1.6%時，乳液D(3,2)和D(4,3)分別為13.72 μm 和45.07μm，乳液中大豆蛋白質量分數為4.8%時，乳液D(3,2)和D(4,3)分別 為12.92 μm 和25.67 μm。其中添加質量分數3.2%大豆蛋白的CST乳液粒徑最小。

圖4 大豆蛋白質量分數對CST乳液粒徑、電位及微觀結構的影響Fig.4 Effects of soy protein mass fraction on particle size,potenial and microstructure of CST emulsions

Zeta-電位能夠反映溶液中粒子表面電荷之間的相互作用，是影響乳液穩定性的重要參數之一，Zeta-電位絕對值越大，乳液體系越穩定[30]。如圖4(b)所示，添加質量分數1.6%～4.8%大豆蛋白的CST乳液電位分別為（44.84±1.14）、（41.00±1.00）、（39.64 ± 0.83）、（37.3 ± 0.62）、（35.34±1.45）mV，隨大豆蛋白濃度的增加而下降。圖4(c)為CST乳液的光學顯微鏡拍攝照片。

2.5 CST乳液紫外全掃描光譜

如圖5 所示，當紫外光譜的最大吸收波長為274 nm，添加質量分數1.6%、2.4%、3.2%、4.0%和4.8%大豆蛋白的CST 乳液光密度分別為1.836、1.369、1.056、0.792 和0.868，總體呈下降趨勢，并且3.2%、4.0%、4.8%大豆蛋白添加量的CST 乳液光密度差別不大。說明3.2%、4.0%、4.8%的大豆蛋白添加量的CST 乳液中蛋白質與多糖、多酚等化合物的結合程度均較佳。

圖5 大豆蛋白質量分數對CST乳液光密度的影響Fig.5 Effects of soya protein mass fraction on the optical density of CST emulsions

2.6 大豆蛋白添加量對CST乳液穩定性的影響

如圖6(a)所示，質量分數1.6%大豆蛋白的CST乳液濁度最低（2.10），而質量分數2.4%～4.8%大豆蛋白的CST乳液濁度無顯著差異（P＞0.05）。如圖6(b)所示，質量分數1.6%、2.4%、3.2%、4.0%、4.8%大豆蛋白的CST 乳液蛋白溶解度分別為0.57、0.24、0.64、0.65和0.49。質量分數3.2%和4.0%大豆蛋白的CST 乳液溶解度最大，但兩者無顯著差異（P＞0.05）。結果表明，質量分數3.2%大豆蛋白的CST乳液蛋白溶解度最大，這與濁度、紫外全掃描結果相符合。

圖6 大豆蛋白質量分數對CST乳液穩定性的影響Fig.6 Effects of soy protein mass fraction on the stability of CST emulsions

較小的物理穩定性值表明離心過程對乳液中分散顆粒的漂浮和下沉的影響較小[15]。如圖6(c)所示，質量分數1.6%、2.4%、3.2%、4.0%、4.8%大豆蛋白的CST 乳液物理穩定性分別為0.84、0.84、0.67、0.84 和0.79。其中質量分數3.2%大豆蛋白的CST乳液物理穩定性顯著低于其他濃度乳液（P＜0.05），這是由于大豆蛋白添加質量分數為3.2%時，CST乳液中大豆蛋白與殼聚糖結合的更加緊密，致使其形成穩定的大分子結構，從而增強了乳液的穩定性[31]。綜上可得，大豆蛋白的添加能增強乳液的穩定性，這與陳智慧等[17]結果類似。

2.7 大豆蛋白添加量對CST乳液美拉德反應物的影響

D294nm和D420nm可分別指示美拉德反應的中間化合物（重要前體）和棕色聚合物，可與游離氨基酸和小分子肽在美拉德反應的高反應性有關[24]。如圖7所示，隨著大豆蛋白添加量的增加，D294nm和D420nm均先升高后降低，添加質量分數3.2%大豆蛋白的CST乳液D294nm、D420nm最大，D420nm變化不顯著（P＞0.05），說明3.2%大豆蛋白添加量的CST 乳液的美拉德反應物生成最多，可能是大豆蛋白、殼聚糖和百里香酚等多種物質之間互相結合比其他濃度更加緊密，這與濁度、蛋白溶解度等指標結果相符。Meng等[32]研究表明，在不使用任何其他化學品的情況下，蛋白質的氨基可與殼聚糖還原端的羰基或任何其他還原性羰基相連，通過美拉德反應形成多糖-蛋白質復合物。

圖7 大豆蛋白質量分數對CST乳液美拉德反應物的影響Fig.7 Effects of Soya Protein Mass Fraction on Meladic Reactants of CST Emulsions

2.8 大豆蛋白添加量對CST乳液表面疏水性的影響

乳液表面疏水性與其乳液穩定性、乳化能力、乳化穩定性密切相關，可以體現出疏水性官能團的數量，對蛋白質功能特性有顯著影響[33]。如圖8 所示，隨著大豆蛋白濃度的增加，乳液表面疏水穩定性先增加后減少，在乳液中大豆蛋白質量分數為3.2%時達到最大。這可能歸因于隨著大豆蛋白濃度增加，大豆蛋白與殼聚糖相互作用，且大豆蛋白濃度升高，從而使大豆蛋白結構展開，導致更多的疏水基團被ANS探針結合，使大豆蛋白乳液疏水性升高。當大豆蛋白含量較低時，殼聚糖含量較高，乳液黏度較高，蛋白質-多糖結構在乳液中不能完全舒展，被緊緊包裹，使疏水性較低。當大豆蛋白濃度過高時，殼聚糖大豆蛋白并不能完全結合，導致暴露出的疏水性基團較少，所以疏水性較弱。

圖8 大豆蛋白質量分數對CST乳液表面疏水性的影響Fig.8 Effects of soy protein mass fraction on the surface hydrophobicity of CST emulsions

2.9 CST乳液對鱸魚片貯藏期間菌落總數的影響

為驗證CST 乳液的抑菌性能，對未經處理和經大豆蛋白質量分數為3.2%的CST 乳液處理的鱸魚肉片進行貯藏實驗。如圖9 所示，對照組在0、1、2、3、4 d 的菌落總數對數值lg [TVC/(CFU/g)]分別為3.77、4.88、6.81、7.65 和7.91，實驗組在0、5、10、15、20 d 的lg [TVC/(CFU/g)]分別為1.72、2.10、4.40、5.49 和7.17。根據GB2733—2015《鮮、凍動物性水產品》規定，lg[TVC/(CFU/g)]＞6即為腐敗。本研究可明顯看出，乳液浸泡后的魚肉抗菌能力遠超于未經過乳液浸泡過的魚肉。對照組在2 d 已經超過腐敗閾值，而實驗組可以將貨架期延長至20 d，這與徐瑞等[34]實驗結果相似。這歸因于殼聚糖中的陽離子與細胞膜互作從而破壞細胞結構，而百里香酚通過疏水鍵和氫鍵結合膜蛋白發揮其抗微生物作用，殼聚糖與百里香酚協同作用能提高乳液抗菌能力。

圖9 大豆蛋白質量分數3.2%的CST乳液對鱸魚片菌落總數的影響Fig.9 Effects of CST emulsion with 3.2%mass fraction of soy protein on value of total colony count of sea bass fillets

2.10 CST乳液對鱸魚片貯藏期間pH的影響

如圖10 所示，對照組在0、1、2、3、4 d 的pH 分別為6.71、6.81、6.85、6.86 和6.74，實驗組在0、5、10、15、20 d 的pH 分別為5.15、5.22、5.51、5.44 和5.50?？傮w來看是上升趨勢，但經乳液浸泡后的魚肉20 d內pH 變化不大。在貯藏開始階段，pH 值較低是由于厭氧細菌呼吸產生乳酸，之后pH 值增加是由于微生物和內源性酶解蛋白質產生的生物胺、氨和其他堿性物質等的積累[10]。

圖10 大豆蛋白質量分數3.2%的CST乳液對鱸魚片pH的影響Fig.10 Effects of CST emulsion with 3.2%mass fraction of soy protein on the pH of sea bass fillets

2.11 CST 乳液對鱸魚片貯藏期間總揮發性鹽基氮含量的影響

如圖11所示，隨著貯藏時間的延長，魚肉TVB-N含量逐漸升高。對照組在0、1、2、3、4 d的TVB-N質量分數分別為18.18、18.77、19.21、31.49和36.52 mg/100 g，實驗組在0、5、10、15、20 d 的TVB-N 質量分數分別為15.39、17.10、17.18、18.08 和19.85 mg/100 g?？瞻捉M在貯藏2 d已經接近腐敗閾值（20 mg/100 g），而實驗組可以將貨架期延長至20 d。TVB-N 的增加是因為微生物和酶使蛋白質分解而產生氨以及胺類等堿性含氮物質，使用CST 處理的肉，因其中殼聚糖的抗菌活性可以減緩微生物誘導的蛋白質分解，且百里香酚可進一步增強抗菌效果[35]。因此，相對于對照組，乳液處理的鱸魚片擁有更好的保鮮能力，并且使魚肉在10 ℃的貨架期提高至少17 d。

圖11 大豆蛋白質量分數3.2%的CST乳液對鱸魚片總揮發性鹽基氮的影響Fig.11 Effects of CST emulsion with 3.2%mass fraction of soy protein on total volatile saline nitrogen of sea bass fillets

3 結論

改變CST 乳液中大豆蛋白的質量分數會影響乳液的穩定性。在大豆蛋白添加質量分數為3.2%時，CST 乳液EAI 和ESI 達到最大值；隨著大豆蛋白濃度升高，CST 乳液乳化性先升高后減小，在大豆蛋白添加質量分數為3.2%時乳液最穩定。此時乳液粒徑較小，為（13.05±0.05）μm，且Zeta-電位較高，達到（39.64±0.83）mV，表面疏水性、美拉德反應物生成指數、最大熒光強度、乳液濁度、蛋白溶解度、穩定指數都是最佳。CST 乳液處理對魚肉有保鮮能力，可以將大口黑鱸肉貨架期延長至20 d。

綜上所述，當大豆蛋白質量分數為3.2%時，CST 乳液（其中殼聚糖質量分數0.5%，百里香酚乳液質量分數1.0%）性能最佳，經此乳液處理后的魚肉貨架期可延長至20 d。