Serratia sp.對銅綠微囊藻、斜生柵藻的溶藻效果

洪桂云，汪 濤，朱 慧，馬少雄

（安徽建筑大學環境與能源工程學院/水污染控制與廢水資源化安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230601）

大量的氮、磷等物質排入水體，導致水體富營養化，使藻類迅速生長繁殖，引起藍藻水華暴發，嚴重影響水生態系統健康，威脅飲用水安全[1-2]。藍藻水華發生范圍廣，持續時間長，生物量高，已成為世界性的生態環境問題[3-4]，探索抑制藻類水華暴發的有效途徑極為迫切。目前，控制藻類的方法主要有物理法、化學法和生物法。常用的物理法有黏土除藻、氣浮除藻及超聲波控藻等手段?；瘜W法是通過投加除藻劑來達到抑制藻類生長的目的。物理法和化學法對藻類有很強的滅殺作用，但存在治理成本高、選擇性差、易對環境造成二次污染等缺點[5-7]。微生物控藻技術因有經濟、高效、環境友好的優勢[8-9]而廣受關注?？卦逦⑸镅芯恐饕獓@溶藻菌分離[10]、溶藻機理[11]以及對藻類的抑制效果[12-14]展開，而對實驗體系中溶藻產物的分析研究較少。

銅綠微囊藻是引起水體藻華的主要藻種之一，通過產生微囊藻毒素和藍藻毒素威脅環境生態和人類健康[15]。斜生柵藻是淡水中極為常見的浮游綠藻,對污染物的耐性較強且繁殖快,常作為淡水水體生態常用指示物種,是淡水水體污染指示種之一,在水生生態系統中占有重要地位[16]。洪桂云等[17]從富營養化水體中分離到溶藻菌S6（Serratiasp.），并對該菌株溶藻機理進行了研究。本研究將菌株S6 分別加入銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）、斜生柵藻（Scenedesmus obliquus）以及2 種藻混合藻液中，以藻種生物量、葉綠素a、氨氮、總磷（TP）濃度的變化趨勢為指標研究S6 對水華中2 種常見藻的溶藻效果，以及對水質的影響，并利用光譜技術分析溶藻產物，為生物控藻研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試藻種

銅綠微囊藻（FACHB-1326）和斜生柵藻（FACHB-1810）均購于武漢中科院水生生物研究所淡水藻種庫，于恒溫光照培養箱中靜置培養，培養條件：溫度（25±1）℃，照度2 000 lx，光暗周期12 h∶12 h。

1.2 菌種活化

實驗菌株S6（Serratiasp.）為本課題組從富營養化水體中篩選的高效溶藻菌，置于低溫冰箱保藏。將菌種S6接入牛肉膏蛋白胨液體培養基，以30 ℃、150 r/min條件恒溫振蕩培養24 h，備用。

1.3 溶藻菌S6溶藻實驗

將溶藻菌S6 培養至對數生長期（2×109mL-1），依次稀釋至原菌液的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，取各稀釋菌液20 mL，分別加入180 mL 預培養1 周的銅綠微囊藻、斜生柵藻以及兩者按體積比1∶1混合（下稱“混合藻”）的藻液中，以加入20 mL BG11 培養基為空白對照。每組設置3 個平行樣，用封口膜封口后放入恒溫光照培養箱中進行溶藻實驗。培養條件：溫度（25±1）℃，光暗周期12 h∶12 h[17]。

1.4 藻細胞濃度、葉綠素a濃度測定

采用血細胞板計數法[18]和熱乙醇法[19]分別測各溶藻體系中的藻細胞數目和葉綠素a 濃度，計算溶藻率（%）：

式中：ρ(Chl-a)c為對照組的葉綠素a 質量濃度，ρ(Chl-a)t為處理組的葉綠素a質量濃度。

1.5 氨氮和總磷測定

將共培養的菌藻混合液定期取樣10 mL，經0.45 μm微孔濾膜過濾，測定濾液中氨氮及磷質量濃度，氨氮測定采用納氏試劑比色法，TP 測定采用鉬酸銨分光光度法,計算去除率（%）。

式中：ρ(NH3-N)c和ρ(TP)c為對照組的氨氮和總磷質量濃度，ρ(NH3-N)t和ρ(TP)t為處理組的氨氮和總磷質量濃度。

1.6 溶藻產物特性分析

紫外光譜測定。取銅綠微囊藻、斜生柵藻和混合藻的空白對照組以及經不同濃度菌液溶藻14 d后的處理組藻液3 mL，分別采用TU-1950 型普析紫外分光光度計測定350～750 nm的光密度（OD）。

紅外光譜測定。分別取空白對照組和經不同濃度菌液溶藻14 d 后的銅綠微囊藻、斜生柵藻以及混合藻35 mL，于4 ℃、5 000 r/min 條件下離心5 min，離心后的沉淀用去離子水洗滌3 次，冷凍干燥，干燥粉經KBr 固定后于FTIR-7600 型紅外光譜分析儀上進行光譜掃描。

三維熒光光譜分析。將空白對照、原菌液和10-1倍菌液處理14 d 后的銅綠微囊藻、斜生柵藻和混合藻的9 個樣品混勻、離心，各取3 mL 上清液過0.45 μm 濾膜，得到胞外溶解性有機物溶液，采用F-7000 型熒光光度計（HITACHI，日本）進行激發波長（λEx）為200～450 nm 和發射波長（λEm）為250～550 nm的檢測，掃描間隔均為5 nm。

1.7 數據處理

采用IBM SPSS Statistics 24 軟件對數據進行統計分析。所有數據均用單因素方差分析（One-way ANOVA）方法，利用Origin 2022軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 溶藻菌S6對不同藻類生長情況的影響

由圖1 可知，銅綠微囊藻、斜生柵藻、混合藻的空白對照組中藻細胞濃度均呈上升趨勢。加入溶藻菌S6 后，各處理組的藻細胞濃度與菌液濃度呈負相關。葉綠素a 濃度變化同藻細胞濃度，3 組對照組中葉綠素a 質量濃度分別從（274.65±18.53）、（260.54±13.54）、（444.49±27.68）μg/L升至（688.25±21.31）、（775.32±23.18）、（945.15±43.57）μg/L；而原菌液處理組中葉綠素a 質量濃度分別從（237.65±12.21）、（243.44±21.58）、（432.78±30.28）μg/L 降至（25.11±5.7）、（48.63±3.88）、（92.83±13.68）μg/L，各組的溶藻率見圖2。由圖2可知，溶藻率最高的為原菌液處理組，最低的為105倍稀釋組，銅綠微囊藻、斜生柵藻、混合藻的原菌液溶藻率分別為89.4%、80.0%和78.6%，S6 105倍稀釋液溶藻率分別為33.6%、22.2%和38.4%。因此，溶藻菌S6 可使兩種純藻及其混合藻的藻密度和葉綠素a 濃度均降低，且隨著菌液濃度升高，溶藻率也呈現上升趨勢。

圖1 S6菌對不同藻類藻密度的影響Fig.1 Effect of algicidal bacterium S6 on the algal density of different algal species

圖2 S6菌對不同藻類溶藻率Fig.2 Alga dissiolution rate of different alga solutions treatmented with algicidal bacterium S6

2.2 溶藻菌S6對氨氮和總磷的去除能力

圖3表明，銅綠微囊藻、斜生柵藻和混合藻藻液對照組中氨氮濃度在前6～8 d 內下降，之后呈平穩趨勢，14 d 內3 組藻對照組中去除率分別為58%、68%和43%，可能是由前期藻類自身繁殖需要消耗水中的氮源，后期生長趨于穩定導致。各處理組氨氮濃度變化趨勢同對照組，S6 原菌液及其10、102、103、104、105倍的稀釋菌液對銅綠微囊藻中氨氮去除率分別為79%、73%、71%、69%、69%和64%，對斜生柵藻中氨氮去除率分別為77%、74%、74%、73%、72%和71%，對混合藻中氨氮去除率分別為55%、49%、48%、47%、47%和46%，各處理組氨氮去除率平均值略高于各對照組（圖4）。由圖3可知，原菌液和10倍稀釋的處理組起始氨氮含量明顯偏高，可能是由于這兩組菌液中含有一定量的牛肉膏蛋白胨培養基。在原菌液加入銅綠微囊藻和斜生柵藻12 d、加入混合藻10 d左右時，由于藻類死亡數量上升，藻細胞大量破裂，導致水中氨氮濃度有一定回升。

圖3 S6菌對不同藻液NH3-N的影響Fig.3 Effect of algicidal bacterium S6 on NH3-N concentrations in different algal solutions

圖4 S6菌對不同藻液氨氮去除率Fig.4 Removal rates of NH3-N from different algal solutions treatmented with algicidal bacterium S6

由圖5 可知，三組空白對照組中TP 濃度也由于藻類自身繁殖需要呈現下降趨勢，14 d 內銅綠微囊藻、斜生柵藻和混合藻藻液對照組除磷率分別為31%、34%和52%。加入不同濃度菌液后，S6原菌液及其10、102、103、104、105倍的稀釋菌液對銅綠微囊藻中TP去除率分別為28%、29%、24%、29%、31%和31%，對斜生柵藻中TP 去除率分別為36%、36%、34%、35%、36%和39%，對混合藻中TP 去除率分別為56%、54%、51%、51%、53%和46%，各處理組除磷率和對照組相差不大（圖6）。

圖5 S6菌對不同藻液中TP濃度的影響Fig.5 Effect of algicidal bacterium S6 on TP concentrations in different algal solutions

圖6 S6菌對不同藻液TP去除率Fig.6 Removal rates of TP from solutions of different algae treatmented with algicidal bacterium S6

2.3 溶藻產物的紫外光譜分析

由圖7可知，銅綠微囊藻、斜生柵藻和混合藻對照組和經不同濃度菌液溶藻14 d 后，各處理組的紫外吸收光譜變化趨勢較為相近，總體上，不同處理組吸收峰峰值均隨菌液濃度升高而降低，原菌液組處理組的峰值最低。銅綠微囊藻對照組在425～465、500～520、600～630、650～675 nm 處出現4 個吸收峰，峰值分別為2.325、2.008、1.958、1.889，各處理組的吸收峰位置與對照組相似，但峰值低于對照組。斜生柵藻的對照組在400～450 nm 處峰值為1.907，475～500 nm 處峰值為1.862、670～695 nm處峰值為1.926，各處理組在670～690 nm 之間出現與對照組相似但峰值低于對照組的吸收峰?；旌显鍖φ战M在450～460、640～680 nm 處吸收峰峰值分別為1.319、1.139，各處理組在640～690 nm 處也出現與對照組相似但峰值較低的吸收峰。

圖7 S6菌對不同藻類的溶藻產物紫外吸收光譜Fig.7 UV-absorption spectra of algae-lysing products of different algae dissolved by algicidal bacterium S6

2.4 溶藻產物的傅里葉紅外光譜分析

由圖8 可知，各處理組與對照組的紅外光譜主要吸收峰位置基本一致，峰形十分相似，但因菌液濃度不同，各吸收峰相對強度會有差異。銅綠微囊藻溶藻前后的紅外光譜均在3 400、2 875、1 660、1 550、1 410、1 070、700 cm-1處出現7 個吸收峰。從峰歸屬看，3 400 cm-1處吸收峰為酰胺Ⅱ峰，是N—H伸縮振動區域；2 300 cm-1處是CO2反對稱伸縮振動區域；1 660 cm-1處是C—O 伸縮振動區域；1 550 cm-1處是硝基—NO2伸縮振動區域；1 410 cm-1處是飽和烴基C—H 彎曲振動區域，表明蛋白質中的C—H 鍵可能被破壞；1 070 cm-1處是伯醇C—O伸縮振動區域；700 cm-1處是硬脂酸CH2面內搖擺振動區域?？梢?，銅綠微囊藻藻細胞結構中N—H、CO2、C—O、—NO2、C—H、CH2等鍵斷裂。斜生柵藻在3 400、2 875、2 300、1 660、1 550、1 410、1 250、1 070、700 cm-1處出現9個吸收峰，其中銅綠微囊藻中未出現的2 875 cm-1和1 250 cm-1處分別是CH2對稱伸縮振動和C—N伸縮振動區域，表明斜生柵藻藻細胞結構中N—H、CO2、C—O、—NO2、C—H、CH2、C—N 等鍵斷裂?；旌显宸謩e在3 400、2 875、1 660、1 550、1 410、1 250、1 070、700 cm-1處出現8 個吸收峰，表明混合藻藻細胞結構中也有類似的化學鍵鍵遭到破壞。由上可知，三種溶藻體系中的幾種化學鍵大致相同，說明溶藻產物中均存在某種或多種含有這些化學鍵的多糖、氨基酸或蛋白質。

圖8 S6菌對不同藻類的溶藻產物的紅外光譜Fig.8 Infrared spectra of algae-lysing products of different algae dissolved by algicidal bacterium S6

2.5 溶藻產物溶解性有機物（DOM）的三維熒光分析

由圖9(a-c)可知：銅綠微囊藻對照組光譜中λEx、λEm中心位置為270、340 nm 和200、380 nm 的類色氨酸峰和類富里酸熒光峰；原菌液和10倍稀釋處理組的DOM 中除檢測到類色氨酸峰和類富里酸熒光峰，還出現λEx、λEm為350、450 nm 的類腐殖酸熒光峰。由圖9(d-f)可知：斜生柵藻對照組光譜中出現λEx、λEm為280、340 nm 的色氨酸峰；原菌液和10倍稀釋處理組除色氨酸峰外，還檢測到λEx、λEm為350、450 nm 的類腐殖酸熒光峰。由圖9(g-i)可知：混合藻對照組光譜中出現λEx、λEm為270、330 nm 的類色氨酸峰；原菌液和10 倍稀釋處理組除類色氨酸峰外，也檢測到λEx、λEm為200、380 nm 的類富里酸峰和λEx、λEm為340、430 nm 的類腐殖酸熒光峰。類色氨酸物質可能是藻細胞的代謝產物，類富里酸、類腐殖酸物質是微生物對大分子有機物或藻細胞的降解產物，且這類物質不能被溶藻菌作為營養物質吸收[20]。隨著溶藻菌S6 濃度的上升，溶藻產物DOM中類色氨酸、類富里酸和腐殖酸物質熒光峰強度呈增大趨勢。

圖9 S6菌對不同藻類溶藻產物的三維熒光譜Fig.9 Three-dimensional fluorescence spectra of algae-lysing products of different algae dissolved by algicidal bacterium S6

3 討論

本研究以本課題組篩選到的高效溶藻菌S6 為研究對象，以銅綠微囊藻和斜生柵藻為供試藻種，以各溶藻體系中的藻細胞濃度、葉綠素a 濃度、氨氮、總磷為指標，監測不同濃度的溶藻菌S6 對不同藻類的溶藻過程。當兩種藻分別與不同濃度溶藻菌S6單獨培養時，各實驗組中的藻細胞濃度與葉綠素a含量呈下降趨勢；混合藻分別與不同濃度溶藻菌S6混合培養時，各處理組中藻細胞濃度和葉綠素a含量均下降，而空白對照組中藻細胞濃度和葉綠素a含量均上升?？梢?，S6對兩種藻的溶藻效果較佳，并可初步判斷溶藻菌S6對混合藻也有一定抑藻效果。許藍心等[21]研究表明，銅綠微囊藻和斜生柵藻共培養相互會產生抑制效應，本研究中溶藻效果是混合藻之間的抑制作用還是溶藻作用，下一步實驗將根據混合藻實驗體系中兩種藻細胞的具體占比來探究。陳東等[22]發現，側孢短芽孢桿菌（Brevibacillus laterosporus）對銅綠微囊藻的去除率可達到89.55%；金黎[23]探究4 株從富營養化水體中篩選出的高效溶藻菌株G3 (Aeromonas)、B2 (Cellulomonas)、P1 (Micrococcus cohn)、P2 (Flavobacterium bergey)對不同藻種的溶藻性能和影響因素時，發現菌液投加量會影響溶藻效果；Su 等[24]研究溶藻菌的溶藻率與菌液濃度的關系，結果也與本研究一致。

氮磷是反映水體富營養化程度重要指標之一。本研究中，經不同濃度菌液溶藻14 d 后，各處理組的NH3-N 濃度整體上呈下降趨勢，氨氮去除率與菌液濃度成正比，且混合藻中去除率低于兩種純藻，這可能與藻類間競爭有關，具體原因有待進一步探究。TP 濃度變化趨勢同NH3-N，但去除率與菌液濃度無直接關系，低濃度菌液處理組中TP濃度下降可能與藻類自身繁殖需要有關，高濃度菌液組TP濃度下降可能受溶藻菌S6 影響。因此，溶藻菌S6 對NH3-N 和TP 有一定的去除效果。劉萍等[25]利用溶藻菌生物膜中動態膜生物反應器自身的脫氮除磷優勢降低水體中氨氮含量時發現，溶藻菌對氨氮去除率最高為73.84%，與本研究結果（氨氮最高去除率為79%）相比略低，這可能是由于反應器內微生物系統對氨氮的利用能力已趨于飽和，但其TP去除率高達86.79%，比本研究約高30%。徐晨嵐[26]發現Shigellasp.H3 和Alcaligenessp.H5 兩株細菌也有脫氮和溶藻雙重作用。馬民[27]發現在貧營養好氧反硝化培養基中活化3 d 后的菌液對氨氮的去除率可達86.98%。與文獻[25-27]的菌株相比，本研究的溶藻菌S6 對NH3-N 去除效果較高，而除磷效果較低，本課題組將進一步優化溶藻菌S6培養條件，以利于提高溶藻菌S6除磷效果。

隨著微生物控藻研究的深入，在溶藻細菌篩選鑒定的基礎上，將光譜分析技術應用于藻類有機物（包括胞外有機物和胞內有機物）分析[28-29]。曾滟[30]在研究菌藻共生培養時用紫外分光光度法測定藻類680 nm處光密度，用以表征藻密度及藻的生長情況?？宗S等[31]發現，銅綠微囊藻經溶藻菌株Streptomycessp.HJC-D1 溶藻前后的紅外光譜峰形也十分相似。溶藻菌S6分別與銅綠微囊藻、斜生柵藻以及兩者混合藻共培養時，不同處理組藻液的紫外光譜圖呈相似的下降趨勢，表明各藻液中葉綠素a 等物質濃度均下降，且存在類似的溶藻有機物，處理組藻液的紫外吸收峰峰值比對照組小，并隨著菌液濃度的降低，各組間的差異逐漸減小。當3 種實驗體系的溶藻產物經紅外光譜掃描后，藻細胞結構中N—H、CH2、C—O、—NO2、C—H、C—N 等鍵斷裂，可知在溶藻過程中，藻細胞內多糖、氨基酸、蛋白質類物質結構可能被溶藻產物破壞，藻細胞破裂，細胞質被吸收，溶藻產物被釋放出來。對比不同濃度菌液的紅外吸收曲線，原菌液吸收峰的透過率最低，光密度最強，說明原菌液的溶藻產物濃度最高，溶藻效果最強。由各溶藻體系的三維熒光圖譜可知，溶藻菌S6 作用于銅綠微囊藻的DOM 中含類色氨酸、類富里酸物質，斜生柵藻的DOM 中含有類色氨酸和類腐殖酸物質，其中類富里酸和類腐殖酸物質僅在處理組被檢測出，且原菌液的熒光強度大于其10倍稀釋液。由上可知，溶藻菌S6破壞了銅綠微囊藻和斜生柵藻細胞，并釋放了藻細胞胞內有機物，銅綠微囊藻溶解產物初步推斷為類色氨酸、類富里酸和類腐殖酸物質，斜生柵藻溶解產物為類色氨酸和類腐殖酸物質，且菌液投加量越高，藻細胞破壞和降解程度越嚴重。董小娜等[32]運用三維熒光圖譜結合平行因子模型分析溶藻菌R1（Lysinibacillus macrolides）溶藻產物時發現，主要溶藻產物為長波類色氨酸物質。盧露等[33]應用三維熒光技術研究溶藻菌EA-1（Enterobacter）對銅綠微囊藻溶藻產物胞外溶解性有機物組成變化時結果也與本研究一致。

4 結論

1）不同濃度溶藻菌S6對銅綠微囊藻、斜生柵藻以及混合藻均有溶藻效果，且菌液濃度越高，溶藻效果越好。

2）高濃度的溶藻菌S6 對氨氮和總磷具有一定去除能力，但除磷效果不如脫氮。

3）不同處理組溶藻產物的DOM 光譜學特征研究表明，銅綠微囊藻的DOM 以類色氨酸、類富里酸和類腐殖酸為主，斜生柵藻的DOM 以類色氨酸和類腐殖酸物質為主，隨著溶藻菌液濃度的上升，類色氨酸、類富里酸和類腐殖酸物質的強度呈增加趨勢。