番瀉葉苷A 對糖尿病腎病大鼠足細胞自噬的影響

王 凱,孫林成,余 婓,劉鳳勛

1.河南省南陽市第一人民醫院腎病內科，南陽 473000；2.鄭州大學第一附屬醫院腎內科，鄭州 450000

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）作為終末期腎功能衰竭的主要原因，是糖尿病患者最嚴重的并發癥之一［1］，DN 特征包括持續性白蛋白尿（albuminuria，Alb）、腎小球濾過率降低和出現糖尿病腎臟組織病理學衰退［2］。DN 蛋白尿增多與足細胞損傷相關，其中足細胞上皮-間質轉化（epithelial mesenchymal transformation，EMT）通過誘導足細胞脫離或凋亡，廣泛參與糖尿病足細胞損傷缺失的早期階段［3］。自噬過度激活或抑制均可導致足細胞損傷，研究發現，糖尿病引起的代謝紊亂可降低機體細胞自噬水平，導致足細胞自噬不足［4-5］。沉默信息調節因子1（silent information regulator-1，Sirt 1）為自噬核底物，可通過自噬蛋白微管相關蛋白1 輕鏈3（icrotubule associated protein 1 light chain 3，LC3）參與細胞質自噬體-溶酶體降解［6］激活Sirt 通路，可增強自噬并減輕DN 氧化應激［7］。番瀉葉苷A（sennoside A，SA）具有降血糖、抗纖維化、抗炎、抗菌等多種藥理特性［8］，還可改善DN［9］。本實驗擬通過觀察SA 對鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的DN 大鼠腎組織及足細胞的作用探討其可能的機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FC 型全自動酶標儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；FluorChem M 化學發光凝膠成像系統（美國ProteinSimple 公司）。

1.2 試藥

番瀉葉苷A（sennoside A，SA，質量分數≥98%，批號81-27-6，上海滬崢生物科技有限公司）；鹽酸貝那普利片（規格為10 mg，成都地奧制藥集團有限公司）；鏈脲佐菌素（批號S8050，北京索萊寶科技有限公司）；白蛋白尿酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（上海瓦蘭生物科技有限公司）；兔抗LC3 多克隆抗體（Proteintech 中國公司）；兔抗Bcl-2 相互作用蛋白（Bcl-2 interacting coiled-coil protein 1，Beclin-1）多克隆抗體（武漢艾美捷生物科技有限公司）；兔抗腎病蛋白nephrin 單克隆抗體、兔抗E-鈣黏蛋白（Ecadherin，E-cad）、兔抗波形蛋白（vimentin，Vim）、兔抗Sirt1 單克隆抗體均購自美國Abcam 公司。

1.3 動物

SPF 級雄性7 周齡Wistar 大鼠60 只，體質量為（180±20） g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，許可證號為SCXK（湘）2019-0013。恒溫（24±2） ℃、恒濕（相對濕度為50%～60%）環境下飼養，給予充足水和普通飼料，12 h 光-暗交替，適應性培養1 周。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥

隨機挑選10 只大鼠作為正常組，剩余大鼠用于構建DN 大鼠模型［10］：斷食12 h，連續2 d 腹腔注射55 mg·kg-1STZ（檸檬酸緩沖液稀釋），每日1 次，72 h后經尾靜脈采血檢測空腹血糖（fasting blood glucose，FBG），當FBG 值連續3 d≥16.7 mmol·L-1視為糖尿病大鼠，1 周后檢測Alb，陽性表達表明功能損害，DN模型大鼠成功構建。正常組大鼠注射等量檸檬酸緩沖液。成功建模的41 只大鼠，隨機剔除1 只，剩余大鼠隨機分為模型組、SA 低劑量組、SA 高劑量組及貝那普利組，每組10 只。SA 低劑量組、SA 高劑量組大鼠每日分別灌胃給予SA 40、80 mg·kg-1，貝那普利組大鼠每日灌服給予鹽酸貝那普利片10 mg·kg-1，模型組及正常組大鼠每日灌服等量生理鹽水，連續給藥21 d。

2.2 樣品采集與處理

末次給藥結束后，通過代謝籠單獨收集每只大鼠的24 h 尿液以檢測Alb 含量；腹腔注射戊巴比妥鈉45 mg·kg-1麻醉大鼠，尾靜脈采血、眼眶采血，用全自動生化分析儀檢測各組大鼠空腹FBG、血清肌酐（serum creatinine，Scr）及血尿素氮（BUN）；頸椎脫臼處死大鼠，采集腎臟，將左腎部分保存于多聚甲醛中，用于組織病理學染色；取右腎1 cm3腎皮質保存于戊二醛中，用于超微結構分析；剩余部分均保存于液氮中，用于蛋白印跡法（Western blotting）檢測。

2.3 ELISA 法檢測24 h Alb 含量

24 h 尿液于4 °C 以3 500 r·min-1離心10 min，收集上清液。設置對照品孔和樣本孔，分別加入對應體積對照品及稀釋（5 倍稀釋）后樣品，于各孔加入HRP 標記的抗體，37 °C 溫育1 h，洗板，加入底物A、B 避光孵育，終止液終止反應，在450 nm 波長處測定各孔吸光度（A）值，以對照品質量濃度為橫坐標（x）、A值為縱坐標（y）繪制標準曲線，并計算Alb 含量。

2.4 HE 染色

腎組織經多聚甲醛固定過夜，常規石蠟包埋并制備成2 μm 厚度切片，常規脫蠟至水，用蘇木精染液染色5 min，用鹽酸乙醇分化5 s，用伊紅染色3 min，脫水、透明，用中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。

2.5 Masson 染色

組織切片常規脫蠟至水，用Weigert 鐵蘇木素染色液染色5 min，用鹽酸乙醇分化20 s，用藍化液返藍，用麗春紅染色5 min，用乙酸工作液洗滌，用磷鉬酸處理，用乙酸工作液洗滌，脫水、透明，用中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。膠原纖維染色呈藍色，用于評估腎纖維化。

2.6 PAS 染色

組織切片經常規脫蠟至水，高碘酸氧化20 min，水洗，用Schiff 染液避光染色15 min，水洗，用蘇木素染色5 min，用水洗10 min 返藍，脫水、透明、封片，用中性樹膠封片，鏡下觀察并采集圖片。PAS 糖原陽性呈紫紅色。

2.7 透射電鏡觀察腎組織自噬體的形成

用戊二醛固定過夜，用鋨酸溶液固定1.5 h，用梯度乙醇及丙酮脫水，脫水后組織塊嵌入丙酮與環氧樹脂等體積混合的浸透液中，4.5 h 后包埋，用超薄切片機制成超薄切片（50 nm），覆蓋于200 目銅網上，在透射電子顯微鏡下觀察自噬體形成。

2.8 Western blotting 檢測腎組織中相關蛋白的表達水平

取液氮保存的腎組織，研缽碾碎，于4 ℃裂解液內裂解，以12 000 r·min-1離心10 min，取上清。測定蛋白質量濃度并加熱變性，SDS-PAGE 電泳（壓縮膠60 V，25 min；分離膠120 V，70 min）分離蛋白，濕轉（200 mA，120 min）蛋白至PVDF 膜，將膜于50 mg·mL-1脫脂乳中封閉2 h，一抗（1×TBST 行1∶1 000 稀釋）內4 ℃孵育14 h；1×TBST 洗膜6 次，二抗（1×TBST 行1∶8 000 稀釋）內孵育2 h，1×TBST 洗膜6 次，用增強型化學發光（enhanced chemiluminescence，ECL）試劑于化學發光凝膠成像系統顯影并記錄。用Image J 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白LC3、Beclin-1、E-cad、Vim、Sirt1、nephrin 與內參GAPDH 灰度值比值表示蛋白的相對表達水平。

2.9 統計學方法

SPSS 26.0 軟件分析數據，計量結果以（±s）表示，多計量樣本比較用單因素方差分析，進一步組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠24 h Alb 含量

組間大鼠24 h Alb 含量比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠24 h Alb 含量升高（P＜0.05）；與模型組比較，SA 低劑量組、SA 高劑量組及貝那普利組大鼠24 h Alb 含量降低（P＜0.05）；與SA 低劑量組比較，SA 高劑量組及貝那普利組大鼠24 h Alb含量降低（P＜0.05），貝那普利組大鼠24 h Alb含量最低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠24 h Alb 含量的比較 （±s，n=10）Tab.1 Comparison of 24-hour Alb content of rats in each group (±s, n=10)

表1 各組大鼠24 h Alb 含量的比較 （±s，n=10）Tab.1 Comparison of 24-hour Alb content of rats in each group (±s, n=10)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SA 低劑量組比較，cP＜0.05；與SA 高劑量組比較，dP＜0.05。

組別正常組模型組SA 低劑量組SA 高劑量組貝那普利組尿Alb/（mg·d-1）6.01±0.55 22.39±2.78a 19.37±2.35ab 14.17±1.96abc 10.88±2.02abcd

3.2 大鼠FBG、Scr 及BUN 水平

組間大鼠FBG 及Scr、BUN 水平比較差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組3 項水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，SA 低劑量組、SA 高劑量組及貝那普利組3 項水平降低（P＜0.05）；與SA 低劑量組比較，SA 高劑量組及貝那普利組3 項水平降低（P＜0.05），貝那普利組3 項水平最低（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠FBG 及Scr、BUN 水平的比較 （±s，n=10）Tab.2 Comparison of FBG, Scr and BUN levels of rats in each group (±s, n=10)

表2 各組大鼠FBG 及Scr、BUN 水平的比較 （±s，n=10）Tab.2 Comparison of FBG, Scr and BUN levels of rats in each group (±s, n=10)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SA 低劑量組比較，cP＜0.05；與SA 高劑量組比較，dP＜0.05。

組別正常組模型組SA 低劑量組SA 高劑量組貝那普利組FBG/（mmol·L-1）5.17±0.72 26.36±3.12a 23.12±2.32ab 16.73±1.80abc 11.44±0.93abcd Scr/（μmol·L-1）66.56±7.49 145.20±13.15a 126.72±7.57ab 98.56±6.48abc 82.53±8.10abcd BUN/（mmol·L-1）5.71±0.82 11.36±1.91a 9.52±1.14ab 7.42±0.67abc 6.43±0.59abcd

3.3 大鼠腎臟組織的病理學變化

HE 染色結果顯示，正常組大鼠腎組織中腎小球、腎小管形狀規則，結構完整，未見有炎性浸潤；模型組大鼠腎組織中腎小球增大膨出，腎小管管腔不完整，腎小球系膜及腎小管管腔厚度顯著增加；SA低劑量組、SA 高劑量組及貝那普利組大鼠腎組織病理損傷情況有不同程度地減輕。見圖1。

3.4 大鼠腎臟組織的膠原纖維沉積情況

Masson 染色結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織膠原纖維嚴重沉積，腎小球及腎小管藍染較深；與模型組比較，3 個給藥組腎組織藍染范圍逐漸縮小，膠原纖維沉積程度均逐漸減輕。見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織Masson 染色結果（400×）Fig.2 Masson staining results of renal tissue of rats in each group (400×)

3.5 大鼠腎小球系膜細胞和基質增生的情況

PAS 染色結果顯示，正常組糖原陽性染色區域較小，顏色較淺，腎小球基底膜較??；模型組大鼠腎組織中腎小球基底膜和系膜糖原沉積明顯，腎小球基底膜、系膜增厚；3 個給藥組糖原陽性沉積程度逐漸減弱，區域有不同程度地縮小。見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織PAS 染色的結果（400×）Fig.3 Results of PAS staining of renal tissue of rats in each group (400×)

3.6 大鼠腎組織中自噬體的形成情況

透射電鏡觀察結果顯示，細胞中自噬體呈雙層囊泡樣結構。組間大鼠腎組織中自噬體數量差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠腎組織中自噬體數量減少（P＜0.05）；與模型組比較，3 個給藥組組織中自噬體數量增加（P＜0.05）；與SA 低劑量組比較，SA 高劑量組及貝那普利組自噬體數量增加（P＜0.05），貝那普利組自噬體數量顯著增加（P＜0.05）。見表3、圖4。

圖4 各組大鼠腎組織在透射電鏡下自噬體-溶酶體觀察（30 000×）Fig.4 Observation of autophagy lysosome in renal tissue of rats in each group under transmission electron microscope (30 000 ×)

表3 各組大鼠腎組織中自噬體的數量（±s，n=10）Tab.3 The number of autophagosomes in renal tissue of rats in each group (±s, n=10)

表3 各組大鼠腎組織中自噬體的數量（±s，n=10）Tab.3 The number of autophagosomes in renal tissue of rats in each group (±s, n=10)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SA 低劑量組比較，cP＜0.05；與SA 高劑量組比較，dP＜0.05。

組別正常組模型組SA 低劑量組SA 高劑量組貝那普利組自噬體數量/（個·視野-1）6.20±0.87 1.60±0.66a 2.70±0.78ab 4.20±0.98abc 5.10±0.83abcd

3.7 大鼠腎組織中蛋白的相對表達情況

組間大鼠腎組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、E-cad、Vim、nephrin 及Sirt1 蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與正常組比較，其他4 組大鼠腎組織中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值、Beclin-1、E-cad、nephrin 及Sirt1 蛋白的相對表達量降低，Vim蛋白的相對表達量升高（P＜0.05）；與模型組比較，3 個給藥組LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ比值、Beclin-1、E-cad、nephrin 及Sirt1 蛋白相對表達量升高，Vim 蛋白相對表達量降低（P＜0.05）；與SA 低劑量組比較，SA 高劑量組及貝那普利組上述指標水平變化規律相同（P＜0.05），貝那普利組更顯著（P＜0.05）。見表4、圖5。

圖5 各組大鼠腎組織內相關蛋白Western blotting 條帶Fig.5 Western blotting bands of related proteins in renal tissue of rats in each group

表4 各組大鼠腎組織內目的蛋白的相對表達量（ ±s，n=10）Tab.4 The relative expression of target proteins in renal tissue of rats in each group (±s, n=10)

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SA 低劑量組比較，cP＜0.05；與SA 高劑量組比較，dP＜0.05。

組別正常組模型組SA 低劑量組SA 高劑量組貝那普利組LC3Ⅱ/LC3I 2.62±0.42 0.31±0.04a 0.42±0.03ab 0.67±0.04abc 1.12±0.27abcd Beclin-1 0.42±0.04 0.11±0.02a 0.15±0.02ab 0.25±0.03abc 0.31±0.04abcd E-cad 0.56±0.05 0.18±0.02a 0.24±0.03ab 0.32±0.03abc 0.39±0.04abcd Vim 0.10±0.02 0.33±0.04a 0.29±0.03ab 0.21±0.03abc 0.13±0.02abcd Nephrin 0.88±0.05 0.13±0.02a 0.19±0.03ab 0.28±0.04abc 0.38±0.04abcd Sirt1 0.92±0.05 0.17±0.02a 0.21±0.03ab 0.32±0.03abc 0.45±0.04abcd

4 討論

蛋白尿是早期DN 的常見特征，與腎小球肥大、腎小球基底膜增厚和系膜細胞外基質擴張有關［11］；足細胞是一種高度分化的上皮細胞，附著在腎小球基底膜外表面，共同形成最終的過濾屏障以防蛋白質流失，其損傷時可致蛋白尿［12］。本研究經連續單次注射STZ，與正常組比較，模型組大鼠FBG、Scr、BUN 水平及24 h Alb 含量顯著升高，表明成功構建DN 大鼠模型，另表明DN 大鼠腎臟機能受損；病理染色結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織明顯可見腎小球及腎小管結構異常、完整性缺失，基底膜及系膜增厚，膠原蛋白嚴重沉積等病理變化，表明DN 大鼠腎功能受損可能是因為腎組織病理改變引起足細胞損傷進而導致過濾屏障受損。

SA 作為大黃的主要活性成分可廣泛用于治療肥胖和便秘，可通過腸道細菌轉化為活性代謝物大黃酸蒽酮［13］。一項關于大黃治療動物DN 的系統評價和薈萃分析結果顯示，大黃酸可降低高血糖、增加胰島素敏感性、保護腎功能并顯著改善DN［14］。徐博等［15］研究表明，SA 可減輕STZ 誘導的DN 大鼠腎組織細胞凋亡及炎癥反應。本研究結果顯示，SA 可減輕DN 大鼠腎小球、腎小管病理性損傷及膠原纖維沉積，降低FBG、Scr、BUN 及24 h Alb 含量，表明SA 經灌胃后，可能通過減輕足細胞損傷而發揮一系列腎臟保護作用。

足細胞損傷可作為DN 演變的臨床預測指標，足細胞自噬能降解蛋白質和細胞器，調節細胞穩態，其功能障礙被認為是足細胞損傷的重要誘導因素，也是提示體外和體內足細胞凋亡/損傷的指標［16-17］。LC3 是自噬體指示蛋白，自噬體膜脂化形式（LC3Ⅱ）/胞質形式（LC3Ⅰ）比值用于監測自噬發生；Beclin1 參與調節自噬體形成與成熟［18］，自噬可刺激LC3、Beclin 1 蛋白的表達［19］。本研究結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠腎組織中自噬體數量顯著減少，而經SA 治療后，自噬體數量顯著增加，且LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值及Beclin1 蛋白相對表達水平顯著升高，表明足細胞中自噬的抑制導致DN 腎功能障礙，SA 可能通過促進足細胞自噬體形成及成熟，改善其自噬功能，進而減輕DN 大鼠腎組織病理損傷。若足細胞損傷時呈進行性，足細胞將經歷EMT 并逃避凋亡，從而導致成熟足細胞上皮樣表型標志物（如Ecad）丟失，獲得間充質細胞樣表型標志物（如Vim）［20］。nephrin 是一種黏附蛋白，在腎小球的足細胞細胞間連接處表達，其表達水平是足細胞脫離、丟失的先兆［21］。LU Z［22］等研究表明，當足細胞免受損傷和EMT 時，nephrin、E-cad 表達上調，波形蛋白表達下調。本研究結果顯示，模型組大鼠腎組織中Ecad、nephrin 蛋白相對表達量顯著降低，Vim 蛋白相對表達水平顯著升高，表明DN 大鼠足細胞可能因損傷刺激而發生EMT，導致足細胞缺失；而經SA 治療后，nephrin、E-cad 表達上調，波形蛋白表達下調，表明SA 可能通過改善DN 大鼠腎組織病理損傷，促進足細胞自噬恢復，減少足細胞損傷，減緩EMT 防止足細胞丟失，進而減輕腎功能障礙。

Sirt-1 是維持細胞骨架完整性和足細胞存活所必需的蛋白質，WANG W 等［23］研究認為，Sirt-1 涉及DN 發病機制中代謝紊亂、氧化應激、炎癥、自噬損害、缺氧、異常血管生成、細胞凋亡和腎素-血管緊張素系統激活等多種信號通路；研究發現，一些合成藥物和天然化合物作為Sirt-1 激活劑發揮藥理活性時，均涉及通過Sirt-1 通路減輕腎臟組織病理損傷、降低STZ 誘導的DN 大鼠Alb 水平［24］、改善自噬障礙［25］及預防EMT 所致的腎組織纖維化［26］。本研究結果顯示，模型組大鼠腎組織中Sirt 蛋白的相對表達量顯著降低，經SA 治療后，其表達量顯著升高，結合上述結果，提示SA 可能作為Sirt-1 激活劑參與并激活Sirt-1通路，發揮一系列腎臟保護作用。

綜上所述，SA 可減輕腎功能障礙，其機制可能與激活Sirt-1 通路，進而改善DN 大鼠腎組織病理損傷、促進足細胞自噬恢復、減少足細胞損傷及減緩EMT 發生有關。