Plackett-Burman 設計結合Box-Behnken 響應面法篩選草烏甲素納米乳凝膠貼膏的處方

何雨曉,李麗云,孫文強,丁江生*,周云龍

1.云南中醫藥大學，昆明 650500；2.云南省藥物研究所，昆明 650111；3.云南省中藥和民族藥新藥創制企業重點實驗室，昆明 650111

草烏甲素是從毛莨科烏頭屬植物滇西嘟拉（Aconitum bulleyanumDiels）中分離出的生物堿——滇西嘟拉堿甲（bulleyaconitine A），屬于二萜雙酯型生物堿，是一種強效鎮痛劑和抗炎劑，臨床上應用廣泛，用于治療各種原因導致的慢性疼痛、癌性疼痛、類風濕關節炎（rheumatoid arthritis）、骨關節炎、肌纖維炎、頸肩痛、腰腿痛等［1-4］。草烏甲素口服后的首過效應明顯，生物利用度低。草烏甲素具有劑量小、藥效強等優點，但由于其毒性和刺激性較大，肝臟首過效應較強，因此認為經皮給藥是其比較理想的給藥途徑［5］。

納米乳是一種潛在的載體系統，與傳統劑型相比，納米乳具有良好的增溶能力和熱力學穩定性，可以透過皮膚進行藥物的輸送［6］。此外，納米乳具有良好的生物相容性，可以遞送親水性和親脂性藥物，可以解決藥物的溶解性低、滲透性低和生物利用度低的問題［7-8］。凝膠貼膏原名巴布劑，是將親水性基質與原料藥混合后均勻涂布于合適的背襯材料上制成的可產生局部作用或全身作用的薄片狀外用制劑，對皮膚有良好的生物相容性、親和性、透氣性、耐汗性和追隨性，生物利用度高［9］。凝膠貼膏主要用于風濕和類風濕關節炎的治療，近年逐漸用于治療支氣管疾病、心血管疾病、癌癥等，成為經皮給藥新劑型的研究熱點［10-11］。本研究以納米乳作為草烏甲素藥物載體，以初黏力、持黏力作為評價指標，并且結合凝膠貼膏的外觀、皮膚追隨性、涂布性、透布狀況等感官評價指標，用Plackett-Burman 設計、最陡爬坡實驗、Box-Behnken 響應面法優化草烏甲素納米乳凝膠貼膏的基質處方，以期制備出膏體均勻性好、黏性較高、皮膚追隨性好、涂布性優良的凝膠貼膏。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

PL203 型電子天平（梅特勒托利多公司）；STX1202ZH 型電子天平［奧豪斯儀器（常州）有限公司］；TF2RJ-100-DLZS-SB-ZJD61 型真空乳化攪拌機（溫州不富機械有限公司）；MS-H280-Pro 磁力攪拌器（德國賽多利斯集團）；NANO 微射流均質機［諾澤流體科技（上海）有限公司］；ZJ-122-B 型初黏性測試儀（濟南格瑞特測試儀器有限公司）；ZJ-050-B 型持黏性測試儀（濟南賽成電子科技有限公司）；ZJ-077-B 型小型實驗用涂布機（上海鍇凱科技貿易有限公司）。

1.2 試藥

草烏甲素（云南淶文生物科技有限公司）；油酸（山西晉湘輔料有限公司）；聚氧乙烯40 氫化蓖麻油（RH-40，北京鳳禮精求醫藥股份有限公司）；二乙二醇單乙醚（transcutol P，法國嘉法獅公司）；NP-700（亞什蘭集團公司）；PVP-K90（重慶斯泰克瑞登梅爾材料技術有限公司）；酒石酸（國藥集團化學試劑有限公司）；高嶺土（上海亮江鈦白化工制品有限公司）；甘油（西安晉湘藥用輔料有限公司）；甘羥鋁（陜西天正輔料有限公司）。

2 方法

2.1 草烏甲素納米乳凝膠貼膏的制備

2.1.1 草烏甲素納米乳的制備 將草烏甲素溶于油酸，再與乳化劑RH40 和助乳化劑transcutol P 混合，用磁力攪拌器攪拌，并不斷滴加純化水，攪拌1 h，攪拌溫度為55 ℃，攪拌速度為1 000 r·min-1。加入高剪切乳化機以一定速度剪切45 次，形成初乳。剪切好的初乳通過微射流均質機以28 000 psi 的壓力均質8 次，最終形成草烏甲素納米乳。

2.1.2 草烏甲素納米乳凝膠貼膏的制備 取處方量的酒石酸和PVP-K90，加入少量純化水預先過夜溶脹，置于60 ℃水浴鍋中充分溶解，作為A 相；取處方量的甘油、NP-700、甘羥鋁、高嶺土混合，攪拌均勻，作為B 相；納米乳作為C 相；先將C 相與A 相混合，混合均勻后，邊攪拌邊加入B 相中，以約60 r·min-1的速度手動攪拌均勻，立即用涂布機涂布，密封保存。

2.2 凝膠貼膏的評價指標

參考2020年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）第四部通則及相關文獻，以初黏力、持黏力、感官評價的綜合評分作為評價指標篩選草烏甲素納米乳凝膠貼膏的基質處方。

2.2.1 初黏力[1,12]參照《中國藥典》2020年版第四部通則0952 第一法，用滾球斜坡停止法測定草烏甲素納米乳凝膠貼膏的初黏力。板上畫有2 條相隔10 mm的水平線，上線為鋼球起始位置的標記，下線為凝膠貼膏固定的標記，將凝膠貼膏剪成長為8 cm、寬為5 cm 的片，除去蓋膜，上端用雙面膠固定在板上2 條水平線的下線位置，膏面向上。調節底座使鋼板表面與水平面呈30°傾斜，以從大到小的順序取鋼球從水平線的上線自由滾落。記錄凝膠貼膏能黏住的最大鋼球號，以所有凝膠貼膏中測得的最大值為100 分，其余以（測得值/最高值）×100 計分。

2.2.2 持黏力[13]取2.1.2 項下4.0 cm×6.5 cm 凝膠貼膏1 片，除去蓋膜，以4.0 cm×4.0 cm 為測試面積，黏貼于垂直放置的清潔不銹鋼板上，記錄凝膠貼膏完全從鋼板上脫落的時間，重復測量3 次，取平均值。以脫落時間最長的計為滿分（100 分），其余的以（測得值/最長值）×100 計分。

2.2.3 感官評價[14]以透布程度、涂展性、均勻性、皮膚追隨性為主觀考察指標，各指標的滿分均為25 分，總分為100 分。透布程度：肉眼觀察凝膠貼膏涂布一定時間后，無透布者為滿分（25 分）。涂展性：用涂布機涂布時，膏體不聚集成塊或斷條，易涂布，為滿分（25 分）。均勻性：制備的膏體均勻、無塊斑，為滿分（25 分）。皮膚追隨性：將成型的凝膠貼膏貼于手腕的背部，用力甩10 下不脫落者為滿分（25 分），分數依據甩手次數的減少而降低。凝膠貼膏感官評分的具體標準見表1。綜合評分標準：以感官評分、初黏力和持黏力的綜合評分為評價指標，權重系數分別為0.4、0.5、0.1。綜合評分=感官評分×0.4+初黏力×0.5+持黏力×0.1。

表1 凝膠貼膏感官評分的標準Tab.1 Sensory scoring standard of the gel paste

2.4 Plackett-Burman 設計

用單因素預實驗篩選各個因素的范圍，用Plackett-Burman 設計對所有因素進行12 次實驗，以2.1.2項下的綜合評分為指標，因素和水平見表2。

表2 Plackett-Burman 設計的因素和水平Tab.2 Factors and levels in Plackett-Burman design

2.5 最陡爬坡實驗

以Plackett-Burman 實驗結果為依據，確定3 個顯著因素以選定爬坡的方向，并選擇合理步長，設計出最陡爬坡實驗的最佳路徑。

2.6 Box-Behnken 優化設計

在Plackett-Burman 實驗和最陡爬坡實驗結果的基礎上，以（A）甘油、（B）酒石酸、（C）純化水為因素，綜合評分作為響應值，用Box-Behnken 設計進行數據分析，因素和水平見表3。

表3 Box-Behnken 設計的因素和水平Tab.3 Factors and levels in Box-Behnken design

2.7 數據分析

做3 次平行實驗，用Design Expert 13.0 軟件對Plackett-Burman 實驗和Box-Behnken 實驗進行設計及數據分析。

3 結果

3.1 Plackett-Burman 實驗

對表3所列的Packett-Burman實驗結果進行方差分析，可以得到回歸模型方程：綜合評價=68.65-0.216 7A-0.3B+4.92C-3.0D+0.966 7E+1.0F-0.633G+0.433H，R2=0.996 8，表明模型顯著，擬合良好。

Plackett-Burman 設計結果見表4 和表5。由表5可知，8 個影響因子的顯著性排序為C（甘油）＞D（酒石酸）＞F（純化水）＞E（PVP-k90）＞G（高嶺土）＞H（納米乳）＞B（甘羥鋁）＞A（NP-700），且C（甘油）、D（酒石酸）、F（純化水）3 個因素在8 個因素中最顯著。因此，確定以甘油、酒石酸和純化水作為最陡爬坡實驗的實驗因素。

表4 Plackett-Burman 設計結果Tab.4 Results of Plackett-Burman design

表5 Plackett-Burman 實驗結果的顯著性分析Tab.5 Significance test of the results of Plackett-Burman test

3.2 最陡爬坡實驗

最陡爬坡實驗設計和結果見表6。由表6 可知，第4組實驗的綜合評分最高，由此篩選出甘油的用量為35～45 g，酒石酸的用量為0.25～0.35 g、純化水的用量為35～45 g。

表6 最陡爬坡實驗的設計和結果Tab.6 Design and results of the steepest ascent experiment

3.3 Box-Behnken 實驗分析

用Design Expert 13.0 軟件進行Box-Behnken 數據分析，結果見表7。

表7 Box-Behnken 設計的實驗結果Tab.7 Experimental results of Box-Behnken design

3.3.1 模型擬合和方差分析 用Design Expert 13.0軟件對表7 中的數據進行二次多元回歸并進行方差分析，得到的二次多元回歸模型方程為綜合評分=93.12+4.237 5A-4.825B+4.712 5C+1.475AB-0.2AC+5.375BC-11.335A2-8.41B2-4.085C2，R2＝0.980 5，表明該模型的擬合度良好，可對凝膠貼膏的性能進行分析和預測。二次回歸方差分析的結果見表8。

由表8 可知，模型的整體水平達到極顯著水平（P＜0.000 1），表明該二次方程的模型具有極顯著意義，失擬值=0.943 1＞0.05，表明失擬項差異無統計學意義，實際值和預測值不擬合發生的概率很低，表明該模型對實驗結果預測性好，實驗穩定、可靠。模型中A、B、C、BC、A2、B2具有顯著性，表明各個自變量與因變量之間不是線性關系，而是相互影響的關系。在各影響因素中，因素B和C對響應值的影響最大，其次是因素A。

各因素對草烏甲素納米乳凝膠貼膏綜合評分影響的響應面圖和等高線圖見圖1。響應面圖和等高線圖可直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響以及最優條件下各因素的取值。由圖1 可見，圖1-B、圖1-C 響應面曲線較陡，表明因素B和C之間具有顯著性的交互作用，與方差分析的結果一致。等高線的形狀反映了各個影響因素之間交互作用的強弱，圖形越趨近于橢圓，表示2 個因素之間的交互作用越具有顯著性。由圖1 可見，因素B、C之間的交互作用最顯著。以響應值最大為優化目標篩選最優的基質處方，得到的最優處方條件為A＝40.877，B＝0.294，C＝42.491，即甘油40.877 g、酒石酸0.294 g、純化水 42.491 g，綜合評分為94.937 分。

圖1 各因素對草烏甲素納米乳凝膠貼膏綜合評分影響的響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour map of various factors to the comprehensive score of bulleyaconitine A nanoemulsion gel paste

3.3.2 驗證實驗 按照最優處方制備了3 批草烏甲素納米乳凝膠貼膏，并進行驗證實驗，結果見圖2 和表9。所制備的凝膠貼膏表面平整，無透布現象，皮膚追隨性好，黏性適中，綜合評分與預測值（94.937 分）接近，表明該方法穩定、可靠，預測性良好。

圖2 草烏甲素納米乳凝膠貼膏外觀及涂展性和黏性Fig.2 Appearance， spread and viscosity of kusnezocin A nano emulsion gel paste

表9 驗證實驗的結果（n=3）Tab.9 Results of the validation test （n=3）

4 討論

在草烏甲素納米乳凝膠貼膏基質處方的篩選過程中，由于影響凝膠貼膏基質的因素較多，故需要開展多次實驗進行篩選。本研究以單因素實驗結合Plakett-Burman 設計、最陡爬坡實驗、Box-Behnken響應面法減少了篩選的步驟。Plackett-Burman 設計能用最少的實驗次數篩選并確定對結果影響比較顯著的因素，避免在后期的優化實驗中由于部分因素不顯著而浪費實驗資源，其已經被廣泛應用于化學、質量控制和食品科學等領域［15-16］。響應面法的原理是基于多項式數學關系的生成和響應在實驗域上的映射來選擇最佳公式。Box-Behnken 設計是一種可用于配方統計優化的發散型RSM 設計。該設計提供了一種比常規劑型優化技術更有效的方法，因為它縮短了實驗時間、降低了實驗成本［17-18］。與正交實驗設計及均勻設計比較，Box-Behnken 設計響應面優化更適合處方配比復雜、各因素之間存在交互作用的凝膠貼膏處方的設計。因此，本研究以Plackett-Burman 設計選擇顯著因子，以爬陡坡實驗篩選出因素范圍，以Box-Behnken 設計響應面優化、篩選出最優的處方，用最優處方制備的凝膠貼膏膏體均勻平整，黏性適中，并且可以反復貼揭，沒有殘留，用涂布機涂布時有很好的涂展性，未出現透布的現象。

在研究的過程中發現以下幾個問題：①凝膠貼膏的含水量會影響凝膠貼膏的黏性，通常建議含水量為30%～60%［19］，并且在制劑保存的時候要密封保存，選擇合適的包材進行包裝，防止其由于過度吸濕或者過度干燥導致膏體的性能發生改變。②納米乳的添加量對凝膠貼膏的基質也有影響，因為納米乳本身就具有黏性，納米乳的添加量過多會導致膏體過黏，無法涂布。③膏體的攪拌時間和攪拌速度是凝膠貼膏制備過程中很重要的影響因素。攪拌時間過長、交聯反應過度會導致膏體硬度過大不易涂布［20］；攪拌時間過短、交聯反應時間過短，則無法形成膠團；攪拌速度過快，容易造成膏體中的氣泡過多，且會導致剪切力過大，使膏體內部各物質的鏈接被破壞從而導致黏性下降；攪拌的速度過慢，則基質較難混勻［21］。攪拌的時間一般控制在10～20 min，且攪拌時應順著同一個方向［22］，攪拌時如果出現氣泡可以用真空泵或者真空干燥箱去除氣泡［23-24］。④交聯時環境條件（如溫度、相對濕度）也會對膏體性能產生影響。溫度高時，膏體相對較軟，成形較快，容易混合均勻，但是會影響膏體的黏性并且容易透布；溫度低時，膏體攪拌會很困難，并且很難混合均勻，攪拌的溫度一般控制在50～60 ℃［25］。