hnRNPA2B1通過抑制轉鐵蛋白受體增強胰腺癌細胞對鐵死亡的抵抗

李政, 劉雅雯, 陳家希, 王慧之, 于正悅, 王舜宇, 龔愛華, 徐岷

(1. 江蘇大學醫學院, 江蘇 鎮江 212013; 2. 泰興市人民醫院消化科, 江蘇 泰興 225400; 3. 江蘇大學附屬醫院消化科, 江蘇 鎮江 212001)

在我國,胰腺癌是消化道腫瘤患者中死亡率較高的疾病之一[1］,其5年生存率低于10%[2-3］。由于缺乏早期特異性表征,80%～85%胰腺癌患者在確診時已錯過最佳治療時機。目前胰腺癌的治療仍以手術為主,但是僅有10%患者有機會接受手術治療,其預后仍不理想,5年生存率僅20%[1］。此外,患者還可采用放療與化療,但是伴有其他基礎疾病的老年患者往往不能耐受。目前,新興療法如靶向療法和免疫療法在胰腺癌的治療中應用較少[4］。

鐵死亡是一種鐵依賴性的非凋亡細胞死亡模式,其本質是由脂質過氧化驅動的氧化性細胞死亡[5-7］。Fe3+與轉鐵蛋白結合后,通過轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFRC)進入細胞內,一部分被還原為Fe2+并被釋放入胞質的不穩定鐵池中[8］。研究表明,由于Fe2+的高反應活性可產生大量羥自由基,其在胞質中的蓄積是鐵死亡發生的重要途經之一[9-10］。研究發現,TFRC作為細胞鐵攝取蛋白,其介導的鐵攝取增加可致癌癥干細胞樣細胞對Erastin敏感,并導致細胞死亡增加,而干擾TFRC后可逆轉該現象[8］。由此提示,TFRC在以誘導鐵死亡發生的癌癥治療策略中起重要作用。

異質核核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1,hnRNPA2B1)屬異質核糖核蛋白家族成員,是一種RNA結合蛋白,可閱讀6-甲基腺嘌呤(m6A)的修飾位點,通過調控RNA代謝的多個過程參與抗病毒免疫、調節多種癌癥的進展[11-12］。研究表明,hnRNPA2B1在結腸癌[13］、肺癌[14］和膀胱癌[15］中均作為癌基因發揮作用,在胰腺癌中參與調控上皮間質轉換、影響腫瘤對藥物的敏感性[16-17］。最新研究顯示,一些甲基化酶可決定細胞是否發生鐵死亡,如甲基轉移酶樣蛋白3(methyltransferase-like 3,METTL3)、甲基轉移酶樣蛋白4(METTL4)和YTH N6-甲基腺苷RNA結合蛋白1(YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1,YTHDF1)等[18］。hnRNPA2B1作為甲基化閱讀蛋白,其是否參與調控胰腺癌細胞發生鐵死亡尚不清楚。因此,本研究擬探討hnRNPA2B1對胰腺癌細胞惡性生物學行為的影響,并在此基礎上探究其對鐵死亡的影響及其潛在機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人胰腺癌PaTu8988、MIA-paca2、PANC1細胞以及人胚腎HEK-293T細胞均由江蘇大學醫學院細胞生物學研究室液氮罐保存。

1.1.2 主要試劑 DMEM高糖培養基、PBS、超敏ECL發光液購自美倫生物技術有限公司;胎牛血清購自依科賽生物公司;Matrigel膠購自美國BD公司;Trizol裂解液、2×SYBR Green Mix溶液、CCK8試劑盒購自南京諾唯贊科技生物股份有限公司;Lipofectamine 2000試劑、逆轉錄試劑盒、C11-BODIPY染料檢測試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;兔抗人溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11/xCT)抗體、β-微管蛋白抗體、鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain1,FTH1)抗體購自英國Abcam公司;兔抗人hnRNPA2B1抗體、TFRC抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司;兔抗人谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)抗體購自美國Cell Signaling公司;羊抗兔二抗購自美國Santa Cruz公司;鐵死亡挽救劑Ferrostatin-1、壞死挽救劑Necrostatin-1、凋亡挽救劑ZVAD-FMK、Erastin購于美國Med Chem Express公司;hnRNPA2B1過表達質粒和對照質粒以及hnRNPA2B1干擾質粒和對照質粒購自廣州基旦生物科技有限公司;4%多聚甲醛、結晶紫、臺酚藍染色液購自北京蘭杰柯科技有限公司;丙二醛檢測試劑盒、組織鐵測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 主要儀器 超凈細胞操作臺購自蘇州凈化設備公司;細胞恒溫培養箱、高速低溫離心機購自美國Thermo Fisher公司;雙目光學細胞顯微鏡購自日本Nikon公司;多功能酶標儀800TS購自美國Bio Tek公司;流式細胞儀購自美國BD公司;組織勻漿器購自寧波新芝生物科技股份有限公司;SDS-PAGE電泳儀、熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人胰腺癌PaTu8988、MIA-paca2、PANC1細胞以及人胚腎HEK-293T細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養于5% CO2,37 ℃的培養箱中。

1.2.2 CCK8法檢測不同濃度Erastin處理后的細胞活性 將PaTu8988、MIA-paca2、PANC1細胞以3 000個/孔接種于96孔板,每孔培養基體系為100 μL,在實驗孔外圈每孔添加100 μL PBS防止實驗孔培養基揮發;次日細胞貼壁后,用吸引器小功率吸去上清液;根據細胞系各自生長習性,添加含不同濃度梯度的Erastin培養基,PaTu8988細胞為0、1.25、2.5、5、10、20 μmol/L,MIA-paca2細胞為0、2、4、8、16、32 μmol/L,PANC1細胞為0、0.5、1、1.5、2、2.5 μmol/L,每組濃度均設3個復孔,孵育72 h;將每孔含Erastin的培養基更換為100 μL CCK8工作液(無血清培養基與CCK8檢測試劑體積比為1∶9),設3個空白孔,避光孵育1～4 h;多功能酶標儀檢測各孔450 nm處D值,細胞活性(%)=(D當前Erastin濃度-D空白組)/(D0 μmol/L Erastin組-D空白組)×100%。GraphPad Prism 9.0進一步處理所得數據,計算Erastin IC50。

1.2.3 qRT-PCR檢測胰腺癌細胞中hnRNPA2B1mRNA相對表達水平 用Trizol提取PaTu8988、MIA-paca2、PANC1細胞總RNA,采用逆轉錄試劑盒行逆轉錄得到對應cDNA;配置10 μL PCR反應體系:4.1 μL DEPC水、5 μL 2×SYBR Green Mix、上下游引物各0.2 μL、0.5 μL cDNA,振蕩混勻瞬時離心后置于PCR儀中,反應程序為95 ℃預變性3 min,95 ℃變性10 s,58 ℃退火30 s,72 ℃ 延伸30 s,共40個循環;根據NCBI查找的基因序列設計引物,hnRNPA2B1上游引物為5′-TGGAGGTAGCCCCGGTTATG-3′,下游引物為5′-GGACCGTAGTTAGAAGGTTGCT-3′;將β-肌動蛋白設為內參,以2-ΔΔCt計算hnRNPA2B1mRNA相對表達量,每個樣本設3個復孔,實驗獨立重復3次。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測胰腺癌細胞中hnRNPA2B1蛋白表達 2×SDS上樣緩沖液、β-巰基乙醇、蛋白酶抑制劑、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl,PMSF)按照100∶10∶1∶1的比例制備蛋白裂解液,混勻后充分裂解胰腺癌PaTu8988、MIA-paca2、PANC1細胞;刮取總蛋白置于EP管中,100 ℃煮沸10 min;12 000 ×g離心10 min,取上清液;配置10% SDS-PAGE分離膠,泳道中加入蛋白,55 V電泳50 min,75 V電泳60 min;300 mA轉膜150 min將蛋白轉至PVDF膜;5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;一抗(hnRNPA2B1抗體、β-微管蛋白抗體均1∶2 000稀釋)4 ℃孵育過夜;次日TBST室溫洗膜3次,每次7 min;室溫孵育二抗(1∶10 000稀釋)1 h;TBST室溫洗膜3次,每次7 min;借助ECL發光液使蛋白條帶在電子凝膠成像儀中顯影,Image J 5.0對所得圖片進行灰度分析。

1.2.5 生物信息學分析 通過基因表達在線分析平臺GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)分析hnRNPA2B1在胰腺癌和正常胰腺組織中的表達水平,篩選條件“gene:hnRNPA2B1”,“Datasets:PAAD”,“Matched Normal data:Match TCGA normol and GTEx data”,“Log Scale:Yes”,“Jitter Size:0.4”;通過數據集GSE85916篩選70個胰腺癌患者樣本,根據hnRNPA2B1表達水平,選取50%處為截斷值,將樣本分為高表達組(n=35)和低表達組(n=35),采用Kaplan-Meier算法進行生存分析。

1.2.6 構建穩定轉染細胞系

1.2.6.1 病毒包裝 將人胚腎HEK-293T細胞接種于6孔板中,使其貼壁后細胞密度為6孔板單孔的40%～60%;配置病毒包裝液,5 μL PEI轉染試劑與100 μL無血清培養基混勻作為PEI管,0.75 μg psPAX2質粒、0.25 μg pMD2.G質粒、1 μg目的質粒(sh-Control質粒、sh-hnRNPA2B1質粒、Vector質粒、Flag-hnRNPA2B1質粒)與100 μL無血清培養基混勻作為質粒管,瞬時離心后靜置5 min;將PEI管和質粒管混勻,瞬時離心后靜置25 min得到200 μL轉染復合物;棄培養基,重新加入2 mL含10%血清的培養基,將轉染復合物滴入對應的孔,輕微晃動混勻,置于細胞培養箱孵育;48 h后收取上清液,8 000×g離心10 min,取上清液置于-80 ℃保存備用。

1.2.6.2 轉染細胞 根據hnRNPA2B1基礎表達量的高低選擇在PaTu8988細胞中轉染干擾質粒,PANC1細胞中轉染過表達質粒;將PaTu8988細胞分為空載組(sh-Control)、干擾質粒組(sh-hnRNPA2B1)和裸細胞組,PANC1細胞分為空載組(Vector)、過表達質粒組(Flag-hnRNPA2B1)和裸細胞組,接種于6孔板中,接種密度同“1.2.6.1”;次日按照以下比例配置培養基:10%血清培養基1 mL、病毒液1 mL、聚凝胺2 μL;24 h后,重復第2天步驟更換培養基;第4天開始根據質粒所帶抗性在含10%血清培養基中加入嘌呤霉素篩選成功轉染的細胞,根據細胞狀態從1 ng/L逐漸加大嘌呤霉素濃度篩選,直至裸細胞組細胞全部死亡。

1.2.6.3 驗證感染效率 取“1.2.6.2”成功轉染細胞即sh-Control組、sh-hnRNPA2B1組和Vector組、Flag-hnRNPA2B1組,提取總RNA、蛋白,分別通過qRT-PCR、蛋白免疫印跡法驗證效率,具體方法同“1.2.3”、“1.2.4”。

1.2.7 細胞表型實驗檢測hnRNPA2B1對胰腺癌細胞生物學行為的影響

1.2.7.1 細胞增殖實驗 將成功轉染干擾質粒的PaTu8988細胞即sh-Control組、sh-hnRNPA2B1組和成功轉染過表達質粒的PANC1細胞即Vector組、Flag-hnRNPA2B1組共4組細胞以1 000個/孔接種于96孔板,每組設置3個復孔,實驗孔外圈每孔添加100 μL PBS防止實驗孔培養基揮發,24 h細胞貼壁后將培養基更換為CCK8工作液,置于培養箱中孵育40 min后檢測各組細胞活性。

1.2.7.2 遷移實驗 將成功轉染干擾質粒的PaTu8988細胞即sh-Control組、sh-hnRNPA2B1組和成功轉染過表達質粒的PANC1細胞即Vector組、Flag-hnRNPA2B1組共4組細胞接種于Transwell小室內,每孔8×104個細胞,小室內為100 μL無血清培養基,小室外加500 μL含10%血清培養基,每組設置3個復孔,孵育14 h;棄培養基,PBS清洗3次;4%多聚甲醛室溫固定30 min;PBS清洗3次;結晶紫染液室溫染色20 min;PBS清洗3次;用棉簽輕輕擦除小室內面殘留結晶紫,晾干拍照。

1.2.7.3 侵襲實驗 提前將基質膠鋪于Transwell小室內,置于培養箱中至少30 min,基質膠凝固后吸去多余培養基;由于基質膠黏稠,以基質膠∶無血清培養基體積比=1∶25比例稀釋,每孔稀釋后的基質膠最終所加體系為100 μL;將成功轉染干擾質粒的PaTu8988細胞即sh-Control組、sh-hnRNPA2B1組和成功轉染過表達質粒的PANC1細胞即Vector組、Flag-hnRNPA2B1組共4組細胞接種于Transwell小室內,細胞接種、固定、染色、拍照具體方法同“1.2.7.2”。

1.2.8 臺酚藍染色檢測細胞活性 將成功轉染干擾質粒的PaTu8988細胞根據所接受的藥物處理進行分組:sh-Control組,sh-Control+Erastin(18.020 μmol/L)組,sh-hnRNPA2B1組,sh-hnRNPA2B1+Erastin(18.020 μmol/L)組,sh-hnRNPA2B1+Erastin(18.020 μmol/L)+Ferrostatin-1(1 μmol/L)組,sh-hnRNPA2B1+Erastin(18.020 μmol/L)+ZVAD-FMK(5 μmol/L)組,sh-hnRNPA2B1+Erastin(18.020 μmol/L)+Necrostatin-1(2.5 μmol/L)組;各組細胞與藥物共孵育72 h;收集培養皿底貼壁活細胞和漂浮的死細胞,PBS重懸;取100 μL細胞重懸液與100 μL 0.4%臺酚藍染液,混勻,室溫染色5 min;鏡下分別對活細胞(未染成藍色)及死細胞(染成藍色)計數,計算細胞存活率;成功轉染過表達質粒的PANC1細胞以同樣的方法進行分組并計算藥物處理后各組細胞存活率。細胞存活率(%)=(細胞總數-藍色細胞數)/細胞總數×100%。

1.2.9 脂質過氧化物含量的檢測 將成功轉染干擾質粒的PaTu8988細胞即sh-Control組、sh-hnRNPA2B1組和成功轉染過表達質粒的PANC1細胞即Vector組、Flag-hnRNPA2B1組共4組細胞分別予以對照(0 μmol/L Erastin)和Erastin(PaTu8988細胞:18.020 μmol/L;PANC1細胞:2.947 μmol/L)處理72 h;各組細胞中加入無血清DMEM配置的2 μmol/L C11-BODIPY染料工作液,于培養箱中避光孵育30 min;室溫800 r/min離心5 min;根據細胞量加入適量含2%血清的PBS重懸,避光置于冰上;選擇FITC通道進行流式分析,所得數據采用Flow 10軟件處理并計算出各組平均熒光強度。

1.2.10 丙二醛含量檢測 取“1.2.9”處理72 h的4組細胞;根據細胞數加入適量PBS,收集細胞于組織勻漿器中以300 W功率破碎得到細胞勻漿,每次超聲3～5 s,間隔30 s,重復4～5次,超聲前將轉子置于-80 ℃冰箱預冷,防止破碎過程中溫度過高;采用丙二醛測試盒制備各組待檢樣品;取各組待檢樣品1.5 mL至比色皿中,置于分光光度計中測定532 nm處D值;結合蛋白濃度,計算丙二醛含量。丙二醛含量(nmol/mL)=(測定D值-空白D值)/(標準D值-空白D值)×標準品濃度(10 nmol/mL)×待測樣本蛋白濃度(mgprot/mL)。

1.2.11 組織中鐵含量測定 取“1.2.9”處理72 h的4組細胞;按“1.2.10”制備細胞勻漿;采用組織鐵測定試劑盒制備各組待檢樣品;取各組待檢1.5 mL至比色皿中,置于分光光度計中測定520 nm處D值;結合蛋白濃度,計算組織中鐵含量。鐵含量(mg/gprot)=(D測定-D空白)/(D標準-D空白)×標準品濃度(2 mg/mL)/待測樣本蛋白濃度(mgprot/mL)。

1.2.12 qRT-PCR檢測TFRC、FTH1、GPX4、xCTmRNA相對表達水平 取“1.2.6.2”成功感染細胞即sh-Control組、sh-hnRNPA2B1組和Vector組、Flag-hnRNPA2B1組,提取總RNA,具體方法同“1.2.3”。

1.2.13 蛋白免疫印跡法檢測TFRC、FTH1、GPX4、xCT蛋白表達量 取“1.2.6.2”成功轉染細胞即sh-Control組、sh-hnRNPA2B1組和Vector組、Flag-hnRNPA2B1組,提取總蛋白,具體方法同“1.2.4”。

1.3 數據處理與統計分析

2 結果

2.1 不同胰腺癌細胞系中Erastin IC50與hnRNPA2B1表達量

根據不同濃度Erastin處理后的細胞活性,計算出PaTu8988、MIA-paca2、PANC1細胞的IC50分別為18.020、15.760、2.947 μmol/L(圖1A-C)。qRT-PCR和蛋白免疫印跡結果顯示,在mRNA和蛋白水平上,PaTu8988細胞中hnRNPA2B1表達量最高,MIA-paca2細胞次之,PANC1細胞中表達量最低(圖1D-E,F值分別為36.43,478.90,P均<0.05)。3種胰腺癌細胞對Erastin誘導鐵死亡的抵抗能力與各自hnRNPA2B1的表達水平成正相關。由此,選擇PaTu8988細胞轉染sh-Control、sh-hnRNPA2B1質粒行干擾實驗,Erastin濃度為18.020 μmol/L;選擇PANC1細胞轉染Vector、Flag-hnRNPA2B1質粒行過表達實驗,Erastin濃度為2.947 μmol/L。

*:P<0.05,與0 μmol/L Erastin組相比;#:P<0.05,與PaTu8988細胞相比;A-C:CCK8法分別檢測Erastin處理后胰腺癌PaTu8988、MIA-paca2、PANC1細胞活性;D:qRT-PCR檢測hnRNPA2B1 mRNA相對表達量;E:蛋白免疫印跡法檢測hnRNPA2B1蛋白相對表達量

2.2 hnRNPA2B1在胰腺癌中的表達和生存分析

通過GEPIA在線網站分析TCGA和GTEx數據庫,其中胰腺癌患者179例,健康對照者171例,與正常組織相比,hnRNPA2B1在腫瘤組織中表達明顯升高(圖2A,P<0.05)。通過GEO在線數據庫下載GSE85916數據集并分析,hnRNPA2B1高表達組胰腺癌患者總體存活率明顯低于低表達組(圖2B,P=0.018)。由此表明,胰腺癌患者hnRNPA2B1表達量與其不良預后呈正相關。

*:P<0.05;A:GEPIA分析胰腺癌組織和正常胰腺組織中hnRNPA2B1相對表達量;B:hnRNPA2B1高表達組和低表達組胰腺癌患者生存曲線

2.3 hnRNPA2B1增強胰腺癌細胞的惡性生物學行為

與sh-Control組相比,sh-hnRNPA2B1組細胞遷移和侵襲能力明顯減弱(圖3A,t=13.92,26.81,P均<0.05),細胞增殖活力自第4天開始顯著降低(圖3B,P均<0.05)。與Vector組相比,Flag-hnRNPA2B1組細胞遷移和侵襲能力明顯增強(圖3C,t=13.55,11.62,P均<0.05),增殖活力自第3天開始顯著增加(圖3D,P均<0.05)。由此表明,hnRNPA2B1促進胰腺癌細胞的生物學行為向惡性轉化。

*:P<0.05;#:P<0.05,與相應的對照組相比;A、C:Transwell實驗分別檢測hnRNPA2B1對胰腺癌PaTu8988、PANC1細胞遷移和侵襲能力的影響(×200);B、D:細胞增殖實驗分別檢測hnRNPA2B1對胰腺癌PaTu8988、PANC1細胞增殖能力的影響

2.4 下調hnRNPA2B1表達增強胰腺癌PaTu8988細胞對鐵死亡的敏感性

qRT-PCR和蛋白免疫印跡結果顯示,與sh-Control組相比,sh-hnRNPA2B1組hnRNPA2B1mRNA和蛋白相對表達量均顯著降低(圖4A-B,P均<0.05)。經Erastin處理后,與sh-Control組相比,sh-hnRNPA2B1組細胞活性明顯降低,脂質過氧化物、丙二醛和鐵含量明顯增加(圖4C-F,P均<0.05)。sh-hnRNPA2B1組經Erastin處理后加入Ferrostatin-1、ZVAD-FMK或Necrostatin-1進行挽救,只有加入Ferrostatin-1組的細胞活性明顯升高(圖4C,t=9.52,P<0.05),說明抑制hnRNPA2B1表達可通過誘導發生鐵死亡致細胞活性下降,而非誘導發生凋亡或壞死。由此可見,抑制hnRNPA2B1表達后,胰腺癌細胞對鐵死亡的敏感性增加。

*:P<0.05,與sh-Control組相比;A:qRT-PCR檢測hnRNPA2B1 mRNA相對表達量;B:蛋白免疫印跡法檢測hnRNPA2B1蛋白相對表達量;C:臺酚藍染色法檢測不同藥物處理后細胞活性;D:流式細胞術檢測脂質過氧化物含量;E:比色法檢測丙二醛含量;F:比色法檢測鐵含量

2.5 上調hnRNPA2B1表達增強PANC1細胞對鐵死亡的抵抗

qRT-PCR和蛋白免疫印跡結果顯示,與Vector組相比,Flag-hnRNPA2B1組hnRNPA2B1mRNA和蛋白相對表達量均明顯升高(圖5A-B,t=13.92,11.14,P均<0.05)。經Erastin處理后,與Vector組相比,Flag-hnRNPA2B1組細胞活性明顯上升,脂質過氧化物、丙二醛和鐵含量明顯降低(圖5C-F,P均<0.05)。Flag-hnRNPA2B1組經Erastin處理后加入Ferrostatin-1、ZVAD-FMK或Necrostatin-1進行挽救,只有加入Ferrostatin-1組細胞活性明顯升高(圖4C,t=6.92,P<0.05),說明增加hnRNPA2B1表達可通過抵抗鐵死亡發生致細胞活性升高,而非凋亡或壞死。由此可見,增加hnRNPA2B1表達可增強胰腺癌細胞對鐵死亡的抵抗。

*:P<0.05,與Vector組相比;A:qRT-PCR檢測hnRNPA2B1 mRNA相對表達量B:蛋白免疫印跡法檢測hnRNPA2B1蛋白相對表達量;C:臺酚藍染色法檢測不同藥物處理后細胞活性;D:流式細胞術檢測脂質過氧化物含量;E:比色法檢測丙二醛含量;F:比色法檢測鐵含量

2.6 hnRNPA2B1抑制胰腺癌細胞TFRC表達

qRT-PCR和蛋白免疫印跡結果顯示,與sh-Control組相比,sh-hnRNPA2B1組TFRC、FTH1mRNA和蛋白相對表達量均明顯升高(圖6A-B,P均<0.05),GPX4、xCTmRNA和蛋白相對表達量變化差異均無統計學意義;與Vector組相比,Flag-hnRNPA2B1組TFRC、FTH1mRNA和蛋白相對表達量均明顯降低(圖6C-D,P均<0.05),GPX4、xCTmRNA和蛋白相對表達量變化差異均無統計學意義。由此表明,hnRNPA2B1并非通過抗氧化體系(谷胱甘肽系統)調控胰腺癌細胞的鐵死亡抵抗,而是通過TFRC調控胰腺癌細胞的鐵代謝使之發生鐵死亡抵抗。

*:P<0.05,與各自對應的對照組相比;A、C:qRT-PCR檢測鐵死亡相關mRNA相對表達量;B、D:蛋白免疫印跡法檢測鐵死亡相關蛋白相對表達量

3 討論

Erastin作為鐵死亡誘導劑的一種,可以通過多種分子如胱氨酸-谷氨酸轉運受體、電壓依賴的陰離子通道和p53等誘導細胞發生鐵死亡從而特異性殺死腫瘤細胞[19］。本研究發現,與低表達hnRNPA2B1的胰腺癌PANC1細胞相比,高表達hnRNPA2B1的胰腺癌PaTu8988細胞對Erastin的抵抗力更強,提示hnRNPA2B1可能參與調控胰腺癌細胞對鐵死亡的易感性。同時,生物信息學分析以及相關功能學實驗結果顯示,hnRNPA2B1在胰腺癌的進展中發揮促癌作用。研究表明,hnRNPA2B1可通過多種機制促進多種腫瘤的惡性進展,如增強Lin28B表達促進卵巢癌細胞增殖,介導淋巴結轉移相關轉錄物2(LNMAT2)包裝成外泌體促進膀胱癌的轉移等[20-21］,但其對腫瘤細胞鐵死亡的影響仍不明確。

脂質過氧化物作為鐵死亡過程的終末產物[6］,是檢測鐵死亡的金指標。本研究結果顯示,抑制hnRNPA2B1mRNA和蛋白表達,細胞中脂質過氧化物含量均明顯增加,過表達hnRNPA2B1則反之,表明hnRNPA2B1可介導胰腺癌細胞對鐵死亡的抵抗。腫瘤細胞的生長、增殖需要大量的鐵,大多數腫瘤細胞表現出TFRC表達上調,如肝癌細胞[8,22］。但是,本研究結果顯示,hnRNPA2B1通過負性調控TFRC表達,限制人胰腺癌PaTu8988、PANC1細胞的鐵攝取從而引起鐵死亡抵抗,表明TFRC表達調控腫瘤細胞對氧化應激的敏感性,與既往研究結果相符,即鐵死亡過程依賴鐵[10,23-24］。同時,FTH1作為一種儲鐵蛋白,在干擾或者過表達hnRNPA2B1后,其表達量變化趨勢與TFRC相同,但變化幅度小于TFRC,提示FTH1表達變化可能是腫瘤細胞基于hnRNPA2B1/TFRC軸引起的胞內鐵含量變化的一種反饋性調節。hnRNPA2B1對胞內總鐵含量的調控在一定程度上解釋了差異性表達hnRNPA2B1的胰腺癌細胞對鐵死亡敏感性的不同。胞內鐵以氧化態的Fe3+和還原態的Fe2+兩種形式存在,而參與芬頓反應生成細胞內活性氧,誘發鐵死亡的是還原態Fe2+[25］,所以,作為抵抗鐵死亡發生的因子——hnRNPA2B1是否能在限制鐵攝取的同時進一步保證胞內鐵離子以Fe2+形式大量存在有待進一步證實。

TFRC作為細胞內鐵穩態的關鍵調控因子,其介導的鐵死亡抵抗是發生癌變的主要原因之一[26］。以往研究發現,針對TFRC表達的調控可從多個水平進行,Mycn原癌基因與TFRC啟動子結合從轉錄水平調控其表達,增強神經細胞瘤細胞對鐵死亡的敏感性[27］;環狀RNA RAP鳥嘌呤核苷酸交換因子5阻斷RNA結合fox-1同系物2與TFRC前體RNA的結合,從轉錄后水平介導其選擇性剪接,增強子宮內膜癌細胞對鐵死亡的抵抗[28］;含有E3泛素蛋白連接酶的β-轉導蛋白重復序列介導TFRC泛素化降低其蛋白穩定性,增強肝癌細胞對鐵死亡的抵抗[26］。本研究中hnRNPA2B1表達在mRNA和蛋白水平的下調均促進TFRC表達,過表達則反之。研究表明,hnRNPA2B1可識別并結合RNA特定序列,參與其降解、加工和翻譯等[12］。由此推測,hnRNPA2B1可能從轉錄后水平介導對TFRC的負性調控,具體機制有待進一步研究。

綜上所述,hnRNPA2B1抑制TFRC表達,限制鐵攝取從而引起胰腺癌細胞對鐵死亡的抵抗。但是,hnRNPA2B1負性調控TFRC表達的具體機制有待進一步研究。作為最廣泛的程序性死亡方式之一,鐵死亡在癌癥治療中潛力大,對于高表達hnRNPA2B1的胰腺癌患者,可予以靶向hnRNPA2B1的抗癌治療。