葛根蛋白酶解物大孔樹脂吸附工藝優化及其體外抗氧化活性研究

岳奕含 嚴銘銘 邵 帥 丁奕元 江 婷

(長春中醫藥大學,吉林 長春 130117)

葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Willd.) Ohwi的干燥根,習稱野葛,始載于《神農百草經》,具有生津止渴、升陽止瀉等功效[1]。葛根作為藥食同源藥品,在改善心血管功能[2]、解酒保肝[3]、抗氧化、保護神經、預防骨質疏松[4]等方面具有良好的療效。有研究[5]表明,將植物蛋白酶解生成多種活性肽,能夠提高其生物活性及蛋白質功能,且具有良好的抗氧化潛力。龐會娜等[6]將葛根蛋白酶解,酶解后蛋白分子量降低,且體外抗氧化活性較酶解前顯著提高。但由于蛋白質酶解產物多樣(其中包括游離氨基酸、部分未水解蛋白質以及多肽),選擇合適的純化方法能夠進一步評估蛋白酶解物結構及提高其生物活性[7-8]。目前,蛋白多肽純化方法主要包括超濾、凝膠色譜、大孔樹脂純化、離子交換色譜、反向高效液相色譜、電滲析等[9-11]。目前對葛根蛋白多肽的研究多限于提取工藝的優化,對其純化工藝的研究尚未見報道。研究擬通過大孔樹脂吸附脫去葛根蛋白酶解物中無機鹽等雜質,提高葛根蛋白酶解物的純度及抗氧化活性,為葛根蛋白多肽添加于食品中的開發與利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根蛋白:含量9.35%,課題組前期研究產物;

堿性蛋白酶:200 U/mg,上海源葉生物科技有限公司;

無水乙醇:分析純,無錫市晶科化工有限公司;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):分析純,上海麥克林生化科技股份有限公司;

FeCl3、HCl、NaH2PO4、Na2HPO4、K3[Fe(CN)6]、NaOH、FeSO4·7H2O:分析純,西隴科學股份有限公司;

牛血清蛋白、PBS(pH 7.4):北京索萊寶科技有限公司;

三氯乙酸(TCA):天津化學試劑有限公司;

大孔樹脂(AB-8、D101、HPD-450、LX-8):廈門柏嘉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外分光光度計:UV-1700型,日本島津(中國)有限公司;

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器:DF-101S型,上海豫康科教儀器設備有限公司;

賽多利斯臺式數顯酸度計:PB-10型,上海諾萱科學儀器有限公司;

低溫離心機:5804R型,美國貝克曼庫爾特有限公司;

冷凍干燥機:DRC-2L型,北崎國際貿易有限公司;

恒溫水浴鍋:HH-6數顯型,金壇市佳美儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 葛根蛋白酶解物制備 取適量葛根蛋白與蒸餾水配制成質量濃度為2%的底物溶液,加入酶底比為2%的堿性蛋白酶,在55 ℃、pH為9的條件下酶解3 h,酶解結束后,立即于100 ℃水浴滅酶10 min,冷卻至室溫,將pH值調至中性,4 ℃、8 000 r/min離心15 min[6]。

1.3.2 葛根蛋白多肽含量測定 采用福林酚法[12],其標準曲線為y=0.000 6x+0.001 3(R2=0.999 9)。

1.3.3 大孔樹脂篩選 選用4種不同極性的大孔樹脂進行吸附—解吸試驗。取預處理好的大孔吸附樹脂各1.0 g,分別加入到150 mL錐形瓶中,加入質量濃度為3.0 mg/mL的葛根蛋白酶解物溶液50 mL,25 ℃下,160 r/min震搖12 h,抽濾,取濾液,按式(1)計算葛根蛋白酶解物質量濃度與吸附率。取上述飽和的大孔樹脂用蒸餾水洗至流出液澄清透明,加入50 mL 95%乙醇,相同條件振搖12 h,測定吸光度并按式(2)計算解吸率[13-14]。

(1)

(2)

式中:

R1——吸附率,%;

R2——解吸率,%;

C0——吸附液中葛根蛋白酶解物質量濃度,mg/mL;

C1——吸附后溶液葛根蛋白酶解物質量濃度,mg/mL;

C2——解吸液中酶解物質量濃度,mg/mL。

1.3.4 單因素試驗 稱取預處理后的大孔樹脂,濕法裝柱,裝柱約為柱體積的3/4。固定葛根酶解物質量濃度為10 mg/mL、上樣液流速為2 mL/min、上樣液體積為40 mL,吸附時間為3 h,上柱、收集、測定,考察上樣液質量濃度(5,10,15,20,25 mg/mL)、上樣液流速(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mL/min)對吸附率的影響。固定洗脫液乙醇體積分數為70%,上樣液流速為2.5 mL/min,洗脫液體積為160 mL,考察洗脫液乙醇體積分數(0%,30%,50%,70%,90%)、洗脫液流速(1.5,2.0,2.5,3.0,3.5 mL/min)、洗脫液體積(40,80,120,160,200,240 mL)對解吸率的影響。

1.3.5 響應面試驗優化 在單因素試驗基礎上,以上樣液質量濃度、洗脫液流速以及洗脫液乙醇體積分數作為自變量,葛根蛋白酶解物解吸率作為響應值,使用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行Box-Behnken三因素三水平試驗設計,優化葛根蛋白酶解物大孔樹脂吸附工藝。

1.3.6 葛根蛋白酶解物的體外抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除能力測定:根據文獻[15]并修改。取2 mL質量分數為0.004%的DPPH溶液,加入2 mL不同梯度濃度的葛根蛋白酶解物溶液,渦旋混勻,避光反應30 min,測定517 nm處吸光度。以甲醇為樣品對照組,蒸餾水為空白對照組,維生素C為陽性對照,按式(3)計算DPPH自由基清除率。

(3)

式中:

S1——DPPH自由基清除率,%;

A0——空白對照組吸光度值;

A1——樣品對照組吸光度值;

A2——樣品吸光度值。

(2) 羥自由基清除能力測定:根據文獻[16]并修改。將 2 mL濃度為0.2 mol/L的PBS緩沖溶液(pH 7.4)加入到1 mL濃度為0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液中,再加入1 mL不同梯度濃度的葛根酶解物溶液,渦旋混勻,加入1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液以及0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液,混勻后反應0.5 h (37 ℃),測定536 nm處吸光度。將樣品液替換為蒸餾水,測定空白對照組吸光度。將過氧化氫溶液替換為蒸餾水,測定樣品對照組吸光度。以維生素C作為陽性對照,按式(4)計算ABTS自由基清除率。

(4)

式中:

S2——羥自由基清除率,%;

A0——空白對照組吸光度值;

A1——樣品吸光度值;

A2——樣品對照組吸光度值。

(3) ABTS+自由基清除能力測定:根據文獻[17]并修改。取0.2 mL ABTS+工作液,用pH 7.4 PBS緩沖溶液稀釋至734 nm處吸光度值為0.7±0.2,取稀釋后的ABTS+溶液0.2 mL,加入10 μL不同梯度濃度的葛根酶解物溶液,混勻,常溫暗室反應6 min,測定734 nm處吸光度。以PBS溶液為樣品對照組,維生素C作為陽性對照,按式(5)計算ABTS+自由基清除率。

(5)

式中:

S3——ABTS+自由清除率,%;

A0——樣品對照組吸光度值;

A1——樣品吸光度值。

(4) 還原能力:根據文獻[18]并修改。分別取不同梯度濃度的葛根蛋白酶解物溶液2.5 mL,加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL,再加入1% K3Fe(CN)6溶液2.5 mL,反應20 min (50 ℃)后冷卻至室溫,加入10%三氯乙酸2.5 mL,離心,取上清液1 mL,加入1 mL蒸餾水以及5 mL 0.1%的FeCl3溶液,渦旋混勻,靜置后測定700 nm處吸光度值。將1% K3Fe(CN)6溶液替換為蒸餾水,測定吸光度值。蒸餾水作為空白組調零,維生素C作為陽性對照,按式(6)計算還原力。

A=A1-A2,

(6)

式中:

A——還原能力;

A1——樣品吸光度值;

A2——樣品對照組吸光度值。

1.3.7 數據統計與分析 每組試驗均重復3次,利用SPSS 21.0軟件進行統計學分析,Origin2019軟件繪制圖表,Design-Expert 8.0.6.1軟件進行響應面試驗設計及數據分析。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂型號篩選

由表1可知,不同型號大孔樹脂對于葛根蛋白酶解物的靜態吸附—解吸率不同,綜合吸附率、解吸率來看,AB-8大孔樹脂的效果最好,可能是由于AB-8型大孔樹脂極性較弱,具有網狀結構及高比表面積,適合蛋白多肽的吸附純化[19]。故后續試驗選用AB-8型大孔樹脂。

表1 各型號大孔樹脂的靜態吸附性能

2.2 單因素試驗

2.2.1 上樣液質量濃度 由圖1可知,大孔樹脂的吸附率隨葛根蛋白酶解物質量濃度的增大呈先增大后減小的趨勢,當上樣液質量濃度為10.0 mg/mL時,吸附率達到最大值87.54%。繼續增大葛根蛋白酶解物質量濃度,吸附率逐漸降低,可能是葛根蛋白酶解物質量濃度較低時,大孔樹脂不能完全吸附,而質量濃度過高,則會超出大孔樹脂的吸附量,并且葛根蛋白酶解液中的雜質成分也會競爭吸附位點,大孔樹脂不能將其完全吸附[20]。因此,最佳上樣質量濃度確定為10 mg/mL。

圖1 上樣液質量濃度對大孔樹脂吸附性能的影響

2.2.2 上樣液流速 由圖2可知,隨著葛根蛋白酶解物上樣液速度的加快,大孔樹脂對葛根蛋白酶解物的吸附率呈先上升后下降的趨勢,當上樣液流速為2.0 mL/min時,吸附率達到最大值。當上樣液流速>2.0 mL/min時,吸附率反而降低,可能是葛根蛋白酶解液在大孔樹脂中需要一個吸附與擴散的過程,流速過大,酶解液還未充分吸附就被泄露,導致葛根蛋白酶解液浪費。因此,最佳上樣液流速為2 mL/min。

圖2 上樣液流速對大孔樹脂吸附性能的影響

2.2.3 洗脫液乙醇體積分數 由圖3可知,隨著洗脫液乙醇體積分數逐漸增大,大孔樹脂對葛根蛋白酶解物的解吸率呈先增大后減小趨勢,當洗脫液乙醇體積分數為70%時,解吸率達到最大值82.55%,當洗脫液乙醇體積分數>70%時,解吸率則下降。這可能是乙醇體積分數會導致洗脫液的極性發生改變,進而影響了洗脫液對葛根蛋白酶解物的洗脫能力[21]。因此,選擇50%,70%,90% 3個水平進行后續研究。

圖3 乙醇體積分數對大孔樹脂解吸性能的影響

2.2.4 洗脫液流速 由圖4可知,隨著洗脫液流速的增加,大孔樹脂對葛根蛋白酶解物的吸附率呈先上升后下降的趨勢,當洗脫液流速為2.5 mL/min時,解吸率達到最大值89.75%。當洗脫液流速>2.5 mL/min時,解吸率開始下降,可能是洗脫流速過快,洗脫液不能與大孔樹脂很好接觸,葛根蛋白酶解物不能被有效洗脫[22]。

圖4 洗脫液流速對大孔樹脂解吸性能的影響

2.2.5 洗脫液體積 由圖5可知,隨著洗脫液體積的上升,大孔樹脂對葛根蛋白酶解物的解吸率呈先上升后趨于平緩的趨勢,當洗脫液體積為160 mL時,解吸率達到最大值84.50%。繼續增大洗脫液體積,解吸率幾乎不再變化,說明此時流出液中酶解物含量已經很少,大部分葛根蛋白酶解物已被洗脫下來,可能剩余部分葛根蛋白酶解物出現死吸附的情況,不能被繼續洗脫。

圖5 洗脫液體積對大孔樹脂解吸性能的影響

2.3 響應面試驗優化

2.3.1 試驗模型建立與方差分析 根據單因素試驗結果,以上樣液質量濃度、洗脫液流速和洗脫液乙醇體積分數為自變量,以解吸率為響應值,進行三因素三水平響應面分析。試驗因素水平見表2,試驗設計及結果見表3。利用Design-Expert軟件進行線性方程擬合,擬合回歸方程為:

表2 響應面試驗因素水平

表3 響應面設計方案與結果

Y=88.02-1.24A+1.49B+1.58C+0.80AB+1.73AC-0.27BC-6.39A2-4.28B2-0.96C2。

(7)

由表4可知,模型P<0.01,極顯著;失擬項P=0.105 3,不顯著;R2為0.986 4,說明誤差對實際結果影響較小,模型可靠,可以對葛根蛋白酶解物解吸率有準確的分析和預測。在該模型中,一次項A、B、C,二次項A2、B2,交互項AC對葛根蛋白酶解物解吸率影響極顯著(P<0.01),二次項C2對葛根蛋白酶解物解吸率影響顯著(P<0.05)。根據F值可以判斷出各水平對試驗結果影響排序為C(洗脫液乙醇體積分數)>B(洗脫液流速)>A(上樣液質量濃度)。

表4 回歸方程方差分析結果?

2.3.2 響應面結果分析 由圖6可知,隨著上樣液質量濃度與洗脫液乙醇體積分數的增加,解吸率呈先上升后下降的趨勢,其曲面坡度較陡峭,等高線呈橢圓形,說明上樣液質量濃度與洗脫液乙醇體積分數的交互作用對葛根酶解物的解吸率影響顯著,與模型方差結果一致。上樣液質量濃度與洗脫液流速交互作用的曲面坡度陡峭,但其等高線呈圓形,說明二者交互作用對結果影響不顯著,與模型方差結果一致。洗脫液流速與洗脫液乙醇體積分數交互作用等高線呈橢圓形,但曲面坡度平緩,說明二者交互作用對結果影響不顯著,與模型方差結果一致。

圖6 響應面與等高線分析圖

2.3.3 最佳吸附工藝結果分析與驗證 通過對擬合模型進行分析,響應面優化大孔樹脂吸附葛根酶解物的最佳工藝為上樣液質量濃度9.33 mg/mL,洗脫液流速2.61 mL/min,洗脫液乙醇體積分數74.44%,此工藝條件下預測葛根蛋白酶解物解吸率為88.54%?？紤]到后續驗證實驗的可操作性,將最佳工藝調整為上樣液質量濃度10 mg/mL,洗脫液流速2.6 mL/min,洗脫液乙醇體積分數74%。此時葛根蛋白酶解物的解吸率為(86.78±1.27)%,與預測值基本相同,且最佳工藝下葛根蛋白酶解物含量由10.81%增加至37.19%,證明此工藝優化可行且效果較好。

2.4 葛根酶解物的體外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 由圖7可知,當樣品質量濃度為0.1～3.2 mg/mL時,樣品對DPPH自由基清除能力隨質量濃度的增大而增強,當樣品質量濃度為0.8 mg/mL時,DPPH自由基清除率達(89.34±1.26)%,且趨于平穩。維生素C、葛根蛋白酶解物吸附前后的IC50值分別為0.002,0.083,0.063 mg/mL,IC50值越小,證明其清除能力越強,抗氧化效果越好[23],三者自由基清除能力由強到弱為維生素C>純化后>純化前。因此,經大孔樹脂純化后,葛根蛋白多肽含量上升導致其體外抗氧化活性增強。

圖7 純化前后葛根蛋白酶解物對DPPH自由基清除能力的影響

2.4.2 羥自由基清除能力 由圖8可知,當樣品質量濃度為0.1～3.2 mg/mL時,純化前后的樣品對羥自由基的清除率均低于維生素C的,但經大孔樹脂純化后的葛根酶解物對羥自由基的清除率從(78.72±2.29)%增加到(85.74±2.24)%。維生素C、純化前后的IC50值分別為0.126,0.423,0.304 mg/mL,三者對羥自由基清除率能力排序為維生素C>純化后>純化前。因此,葛根酶解物經大孔樹脂純化后,其抗氧化活性增強,與呂凱波等[24]的研究結論一致。

2.4.3 ABTS+自由基清除能力 由圖9可知,葛根酶解物純化前后對ABTS+自由基清除能力隨樣品質量濃度的增加而增強,且純化后對ABTS+的清除率最高可達(93.14±2.38)%。維生素C、純化前后的IC50值分別為0.141,0.642,0.408 mg/mL,三者對ABTS自由基清除能力大小排序為維生素C>純化后>純化前,其抗氧化能力結果與馬萌等[25]的一致。

圖9 純化前后葛根蛋白酶解物對ABTS+自由基清除能力的影響

2.4.4 還原能力 由圖10可知,當樣品質量濃度為0.1～3.2 mg/mL時,大孔樹脂純化前后的葛根酶解物呈現出不同的還原能力,隨著質量濃度的增加,還原能力增加。當葛根蛋白酶解物質量濃度增加至1.5 mg/mL時,其還原能力基本與維生素C的持平,純化后的葛根蛋白酶解物具有更強的還原能力。

圖10 純化前后葛根蛋白酶解物對還原能力影響

3 結論

試驗表明,AB-8型大孔樹脂為吸附葛根蛋白酶解物的最佳材料,大孔樹脂吸附葛根蛋白酶解物的最佳工藝條件為上樣液質量濃度10.0 mg/mL,洗脫液流速2.6 mL/min,洗脫液乙醇體積分數74%。該條件下葛根蛋白酶解物含量以及抗氧化活性較吸附前明顯提高,說明優化工藝可行。但將其作為一種有效的食源性抗氧化肽來源應用于保健食品中,需進行動物以及臨床試驗,以探究葛根蛋白酶解物的抗氧化活性機制。