堇葉碎米薺低聚肽制備工藝優化及結構特征、氧化活性研究

問小龍 向極釬, 張 亮 李亞杰 龍 瀾

(1. 恩施土家族苗族自治州農業科學院,湖北 恩施 445000;2. 湖北省富硒產業技術研究院,湖北 恩施 445000)

堇葉碎米薺(CardamineviolifoliaO. E. Schulz)別名野油菜,為十字花科一年或二年生草本植物,全草可作為野菜食用,也可作藥用,具有清熱祛濕的功能[1]。據《湖北恩施藥用植物志》[2]記載,碎米薺性平,味淡,具有清熱利濕的功效。2021年3月,國家衛健委批復堇葉碎米薺參照葉類蔬菜標準管理。

堇葉碎米薺中富含不飽和脂肪酸、硒蛋白、硒多糖、維生素、礦質元素等成分[3-5]。目前,關于堇葉碎米薺的研究大多集中在富硒栽培及硒耐受的機理、硒形態分析、營養成分、富硒蛋白和富硒多糖等大分子物質的功效評價等方面,呂昊[6]研究發現,堇葉碎米薺富硒蛋白具有緩解疲勞的作用;林樾[7]研究發現,堇葉碎米薺中的有機硒以硒代胱氨酸為主,并探究了富硒多肽對肝癌細胞的抑制作用及其機理。然而有關堇葉碎米薺中小分子活性成分低聚肽的系統研究尚未見報道。

研究擬以堇葉碎米薺蛋白為原料,優化酶解工藝制得堇葉碎米薺低聚肽粉末,分析檢測該低聚肽的理化成分和氨基酸組成,利用相對分子質量分布、紫外全波長掃描、紅外光譜和掃描電鏡對其結構進行表征,并通過羥自由基清除能力等4種化學評價方法分析堇葉碎米薺低聚肽的抗氧化能力,以期為堇葉碎米薺功能食品的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

堇葉碎米薺:經中科院昆明植物研究所鑒定為十字花科碎米薺屬植物堇葉碎米薺,恩施州農科院;

氫氧化鈉、無水乙醇、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、雙氧水等:分析純,國藥集團化學試劑有限公司;

水楊酸:分析純,天津福晨化學試劑有限公司;

堿性蛋白酶(200 U/mg)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼:上海源葉生物科技有限公司;

2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸:上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

抗氧化能力(FRAP法)試劑盒:蘇州科銘生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

分析天平:BS-124S型,德國Sartorius公司;

pH計:FE20K型,梅特勒—托利多科技(中國)有限公司;

離心機:TG16-WS型,湖南湘立科學儀器有限公司;

真空冷凍干燥機:S-18N型,寧波新芝生物科技股份公司;

凱氏定氮儀:K9840型,海能未來技術集團股份有限公司;

紫外可見光分光光度計:UV-1900型,日本島津儀器有限公司;

全波長酶標儀:Spectra Max190型,美國Molecular Devices公司;

雙道原子熒光光度計:AFS-9760型,北京海光儀器公司;

膜分離系統:HC-DG2540-3X型,成都和誠過濾技術有限公司;

掃描電鏡:sigma3000型,德國蔡司公司;

傅里葉紅外光譜儀:Nicolet IS20型,美國賽默飛公司;

高效液相色譜儀:1260型,美國安捷倫公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 堇葉碎米薺低聚肽的制備 堇葉碎米薺干粉經堿提、酸沉、脫鹽、干燥后獲取堇葉碎米薺蛋白,按質量分數4%稱取一定量的堇葉碎米薺粗蛋白溶于蒸餾水中,升溫至50 ℃,調節pH值為9,加入160 mg堿性蛋白酶,酶解2 h,酶解過程中使用氫氧化鈉溶液保持pH值為9,直至酶解結束,95 ℃水浴10 min,離心,上清液依次通30,5,1 kDa的超濾膜,收集濾過液,減壓濃縮后冷凍干燥,得到堇葉碎米薺低聚肽干粉。

(1) 單因素試驗:固定堇葉碎米薺蛋白質量分數為4%、酶用量為5%,酶解溫度為50 ℃、酶解時間2 h、pH 9,以水解度為指標,考察堇葉碎米薺蛋白質量分數(2%,3%,4%,5%,6%)、酶解溫度(40,45,50,55,60 ℃)、酶用量(0%,3%,4%,5%,6%,7%)和pH值(7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0)對堇葉碎米薺蛋白酶解效果的影響。

(2) 正交試驗:在單因素試驗基礎上,采用四因素三水平正交表 L9(34),以堇葉碎米薺蛋白水解度為測定指標,對酶解條件進行優化。

1.3.2 水解度測定 采用Ph-STAT法[8-10]。

1.3.3 成分分析

(1) 蛋白質:按GB 5009.5—2016執行。

(2) 水分:按GB 5009.3—2016執行。

(3) 硒含量:按GB 5009.93—2017執行。

(4) 氨基酸含量:按GB 5009.124—2016執行。

(5) 酸溶蛋白含量:按GB/T 22729—2008執行。

(6) 游離氨基酸含量:參考譚建寧等[11]的方法。

1.3.4 相對分子質量分布測定 參考Liu等[12]的方法。

1.3.5 結構特征

(1) 紫外全波長掃描:參考Liu等[12]的方法,掃描波長為190～400 nm。

(2) 傅里葉變換紅外光譜掃描:根據朱孝晨[13]的方法。

(3) 掃描電鏡:參考Qin等[14]的方法,分別于2 000,5 000倍下獲取圖像。

1.3.6 體外抗氧化活性測定

(1) DPPH自由基清除能力:參考Zhao等[15]的方法,按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中:

A——自由基清除率,%;

A2——樣品組吸光值;

A1——對照組吸光值;

A0——空白組吸光值。

(2) ABTS自由基清除能力:參考Pandhare等[16]方法,按式(1)計算ABTS自由基清除率。

(3) 羥自由基清除能力:參考Amarowicz等[17]的方法,按式(1)計算羥自由基清除率。

(4) 總抗氧化能力(FRAP法):按抗氧化能力試劑盒說明書進行測定。

1.3.7 數據處理 各試驗重復3次,結果以平均值±標準差表示,利用Excel 2017軟件進行數據處理,采用SPSS 16.0軟件進行顯著性分析,OriginPro 9.1軟件繪圖,使用omnic 8和peakfit 4.12軟件進行紅外光譜數據分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶用量 由圖1(a)可知,隨著酶用量的增加,堇葉碎米薺蛋白水解度增加。當酶用量為5%時,堇葉碎米薺蛋白水解度為9.26%,繼續增大酶用量,堇葉碎米薺蛋白水解度增加的趨勢比較平緩,可能是因為底物大部分已參與反應,堇葉碎米薺蛋白水解度趨于飽和[18]。因此,堇葉碎米薺蛋白酶解的最佳酶用量為5%。

圖1 各因素對堇葉碎米薺蛋白水解度的影響

2.1.2 底物質量分數 由圖1(b)可知,當底物質量分數為3%時,堇葉碎米薺蛋白水解度最大,達10.17%,繼續增大底物質量分數,堇葉碎米薺蛋白水解度呈下降趨勢,可能是因為隨著底物質量分數的增加,溶液黏度增加,減緩了酶的擴散,降低了酶分子與底物的相互作用[19],從而導致堇葉碎米薺蛋白水解度降低。因此,堇葉碎米薺蛋白酶解的最佳底物質量分數為3%。

2.1.3 酶解溫度 由圖1(c)可知,隨著酶解溫度的增加,堇葉碎米薺蛋白水解度增加。當酶解溫度為55 ℃時,堇葉碎米薺蛋白水解度達10.74%,繼續提升酶解溫度,堇葉碎米薺蛋白水解度不再增加,可能是因為隨著酶解溫度的升高,酶活力受到影響甚至變性[20],導致堇葉碎米薺蛋白水解度降低。因此,堇葉碎米薺蛋白酶解的最佳酶解溫度為55 ℃。

2.1.4 酶解pH 由圖1(d)可知,隨著酶解pH值的增加,堇葉碎米薺蛋白水解度增加。當酶解pH為9.5時,堇葉碎米薺蛋白水解度達12.22%,繼續增大酶解pH,堇葉碎米薺蛋白水解度略有下降。試驗選取的堿性蛋白酶的最適pH為9～10[20],當pH>10時,酶活力會下降從而導致堇葉碎米薺蛋白水解度降低。因此,堇葉碎米薺蛋白的最佳酶解pH值為9.5。

2.2 正交試驗

根據單因素試驗結果,選取酶解溫度、pH、酶用量、底物質量分數4個因素進行正交試驗,各因素水平見表1,試驗設計及結果見表2。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設計及結果

由表2和表3可知,各因素均會影響堇葉碎米薺蛋白水解度,影響順序依次為pH>底物質量分數>酶解溫度>酶用量,其最佳酶解組合為A1B2C2D2,即酶解溫度50 ℃、pH 9.5、酶用量5%、底物質量分數3%,此時堇葉碎米薺蛋白水解度為15.1%。

表3 正交試驗方差分析?

2.3 堇葉碎米薺低聚肽成分

由表4可知,堇葉碎米薺低聚肽水分含量為5.25%,蛋白質含量為49.01%,總硒含量為412.67 mg/kg,酸溶性蛋白質含量為44.2%,占總蛋白質的90%,游離氨基酸含量為1.33%,經計算,肽含量為42.87%。說明堇葉碎米薺蛋白經酶解制備得到的低聚肽,其蛋白、肽和硒元素含量較高,是開發富硒功能食品的優質原料。

表4 堇葉碎米薺低聚肽的成分

由表5可知,堇葉碎米薺低聚肽中氨基酸總量為48.10 g/100 g,其中色氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺在酸性條件下被水解,未檢測到[21]。堇葉碎米薺低聚肽中必需氨基酸種類和含量豐富(7種,24.06%),疏水性氨基酸占氨基酸總量的50.91%,給質子能力氨基酸占氨基酸總量的56.63%。有研究[22-23]報道,氨基酸的組成與低聚肽的抗氧化能力緊密相關,疏水性氨基酸和給質子能力氨基酸占比高,可穩定和清除自由基,從而提升低聚肽的抗氧化能力。

表5 堇葉碎米薺低聚肽的氨基酸組成

2.4 堇葉碎米薺低聚肽的相對分子質量分布

使用GPC軟件處理色譜數據,結果顯示堇葉碎米薺低聚肽的重均相對分子質量為621,數均相對分子質量為461,主要為小分子物質。由圖2可知,堇葉碎米薺低聚肽的凝膠色譜圖中主要有4個峰,每個峰的相對分子質量分布見表6,峰1、2、3、4的數均相對分子質量分別為1 567,782,383,238,峰面積分別為10.64%,36.13%,46.01%,7.22%,制備的堇葉碎米薺低聚肽主要以寡肽為主,且各峰的分散系數均接近1,說明相對分子質量分布越小,相對分子質量越集中。有研究[24-25]表明,抗氧化活性較好的肽,其相對分子質量均較小。

表6 堇葉碎米薺低聚肽的相對分子質量分布

圖2 堇葉碎米薺低聚肽的流出曲線圖

2.5 堇葉碎米薺低聚肽的紫外光譜掃描

圖3 堇葉碎米薺低聚肽的紫外全波長掃描

2.6 堇葉碎米薺低聚肽的紅外光譜掃描

蛋白質二級結構的分析常使用酰胺Ⅰ帶的譜圖,它能夠反映α-螺旋(1 660～1 650 cm-1)、β-折疊(1 640～1 600 cm-1)、β-轉角(1 700～1 660 cm-1)及無規卷曲(1 650～1 640 cm-1)等不同結構信息[27]。通過對堇葉碎米薺低聚肽酰胺Ⅰ帶(1 700～1 600 cm-1)的圖譜進行基線校準、高斯去卷積、二階導數擬合后得到分峰擬合圖如圖4所示。

圖4 堇葉碎米薺低聚肽的紅外光譜掃描圖和酰胺I帶分峰擬合圖

由圖4可知,對酰胺I帶進行分峰擬合后共獲得7個單一峰,各子峰的面積代表相對應結構所占比例,結果見表7。由表7可知,堇葉碎米薺低聚肽二級結構中有多種構象并存,主要以β-轉角為主,含量為57.4%,其次是α-螺旋、無規卷曲和β-折疊。α-螺旋和β-折疊代表蛋白分子的有序性,β-轉角和無規卷曲代表蛋白分子的分散程度[28]。這可能是因為酶解破壞了蛋白質間的氫鍵和肽鍵,從而使蛋白質結構從有序向無序轉變[29]。

表7 堇葉碎米薺低聚肽的二級結構含量

2.7 堇葉碎米薺低聚肽的掃描電鏡

由圖5可知,堇葉碎米薺蛋白在酶解成低聚肽后,微觀結構有明顯差異。堇葉碎米薺蛋白的外觀結構以不規則片狀結構存在,表面比較平整光滑。酶解過1 000 Da超濾膜得到的低聚肽外觀結構變化明顯,表面不再光滑,變成具有許多小孔的海綿狀。這可能是酶解導致蛋白質分子間的氫鍵和范德華力被破壞,蛋白質結構被破壞,內部結構中的疏水性基團暴露出來,低聚肽的抗氧化活性可能會因此而提高[24]。

圖5 堇葉碎米薺蛋白和低聚肽的掃描電鏡

2.8 堇葉碎米薺低聚肽的體外抗氧化能力

由圖6可知,堇葉碎米薺低聚肽清除自由基(·OH、DPPH·和ABTS·)的能力和抗氧化能力(FRAP法)均表現出明顯的量效關系,隨樣品質量濃度的增加而增強;當堇葉碎米薺低聚肽質量濃度為20 mg/mL時,對羥自由基、ABTS自由基和DPPH自由基的清除率分別為84.54%,98.22%,60.33%,其IC50值分別為0.35,1.00,16.00 mg/mL,抗氧化能力(FRAP法)為1.82 μmol/mL Trolox。堇葉碎米薺低聚肽表現出較好的抗氧化能力,可能是蛋白被酶解后,低相對分子質量水解物或肽更能有效地與自由基發生反應[29];產生了一些離子化的氨基、羧基等供氫體與富含疏水氨基酸的肽和活性氨基酸序列[30-32],從而提高了抗氧化活性。有研究[33]報道,多肽分子量越小,表現出的抗氧化能力越強,堇葉碎米薺蛋白水解度越好,相對分子質量越小,抗氧化活性越好?？傮w而言,堇葉碎米薺低聚肽清除自由基的能力相對于抗壞血酸要稍弱一些,但其作為植物來源,安全性高,是開發功能食品的良好原料。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

試驗表明,堇葉碎米薺低聚肽的蛋白質、肽含量較高,硒含量為(412.67±12.00) mg/kg,必需氨基酸含量為24%且種類豐富,主要成分為相對分子質量<1 000的小肽,外觀結構呈明顯的球體顆粒狀,在200 nm處有肽鍵的特征吸收峰,二級結構以多種構象并存,β-轉角為主要結構(57.4%)。堇葉碎米薺低聚肽的總抗氧化能力較強,對羥自由基、ABTS自由基的IC50值分別為0.5,1.0 mg/mL。綜上,堇葉碎米薺低聚肽是一種有效的抗氧化小肽,是開發富硒功能食品的優質原料。后續可進一步研究堇葉碎米薺低聚肽的精制純化、穩定性、體內抗氧化活性及其他功能活性。