動物源性食品中氯霉素類藥物殘留分析方法研究進展

袁 喆 彭茂民 劉 麗 彭西甜 夏 虹

(1. 湖北省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所,湖北 武漢 430064;2. 農產品營養品質與安全湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430064;3. 長江大學,湖北 荊州 434023)

氯霉素類藥物(chloram phericols,CAPs)是一種殺菌劑,也是高效廣譜的抗生素,被廣泛應用于動物疾病治療中。但氯霉素類藥物濫用會導致動物源性食品中藥物殘留超標,對人體健康可能造成潛在危害,例如,可以引起過敏反應,呼吸系統損傷,肝、腎等器官損傷,甚至導致癌癥等嚴重健康問題。此外,動物養殖業和食品行業的生產實踐往往未能防止氯霉素類藥物殘留的發生,這給公眾的健康帶來潛在的風險,同時也加劇了食品行業的信譽問題。因此,通過建立科學、有效的檢測方法和限量標準,保證食品中氯霉素類藥物殘留的安全水平十分重要。文章擬綜述近年來有關氯霉素類藥物的研究,對氯霉素類藥物種類、限量標準及其對機體健康的相關影響進行論述,從現有檢測技術出發闡述動物源性食品中氯霉素類藥物的檢測方法,并總結各檢測技術的優缺點,討論如何提高氯霉素類藥物檢測精度和效率的措施,以期為開辟動物源性食品中氯霉素類藥物檢測新方法提供參考。

1 氯霉素類藥物性質

1.1 氯霉素類藥物種類和理化性質

氯霉素類藥物主要包括氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺等,其結構式如圖1所示。其中,氯霉素為白色或無色至微帶黃綠色,針狀或片狀結晶,易溶于甲醇、乙醇、丙酮、丙二醇及乙酸乙酯,其分子式為C11H12Cl2N2O5;甲砜霉素為白色或類白色結晶性粉末或晶體,易溶于二甲基甲酰胺中,是氯霉素的同系結構物,以甲磺?；?H3C—SO2)替代了氯霉素結構中的硝基(—NO2);氟苯尼考為白色或類白色粉末,極易溶于二甲基甲酰胺中,在甲醇中溶解,氟苯尼考在結構上以F原子取代了氯霉素、甲砜霉素中丙烷鏈3C位置上的羥基(—OH);氟苯尼考胺為白色固體粉末,易溶于水,不溶于有機溶劑,氟苯尼考中的二氯乙醛基被H取代即為氟苯尼考胺,氟苯尼考胺為氟苯尼考的主要代謝產物。

圖1 氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的結構式

1.2 氯霉素類藥物毒性和殘留限量

氯霉素類藥物屬于廣譜抗生素,可對大多數革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌產生一定的抑制作用。其中,氯霉素在藥物市場上問世時間較早,且具有穩定性和低成本的優點,因此被廣泛應用于畜牧業。氯霉素是一種可逆地與細菌細胞內結合的藥物,其殺菌機理是抑制細菌肽鏈的形成,導致蛋白質無法合成,從而使得細菌因缺乏必需的營養物質供給而死亡。長期食用氯霉素超標的動物源性食品會給人體生命健康帶來巨大危害,因此,氯霉素在國際上被相繼禁止使用[1]。氯霉素結構中芳香環上對位硝基是引起再生障礙性貧血的主要基團,而當硝基被甲磺?；〈鷷r,不會產生再生障礙性貧血的不良反應。因此,在動物疾病防治上,尤其是食品動物,甲砜霉素逐漸替代氯霉素,具有廣闊的應用前景。但甲砜霉素免疫抑制作用比氯霉素強,仍然存在著較大的危害[2]。相較于這兩種藥物,氟苯尼考具有毒性較低的特點,不會產生質粒介導的耐藥性,并不存在再生障礙性貧血的問題。此外,氟苯尼考仍然對許多氯霉素耐藥菌株具有敏感性。但需要注意的是,氟苯尼考會輕度抑制生殖激素的產生,用藥后會出現腹瀉等副作用,同時也具有胚胎毒性[3]。

根據《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中華人民共和國農業部公告第235號的規定,氯霉素被禁止用于所有食品動物。而GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》則規定,甲砜霉素在牛、羊、豬、魚等家禽各部分靶組織中的最大殘留限量均為50 μg/kg,在家禽產蛋期禁用。氟苯尼考在魚的皮和肉中最大殘留限量為1 000 μg/kg,而在牛、羊的泌乳期以及家禽的產蛋期均禁止使用。如何控制動物源性食品中的氯霉素類藥物殘留是政府監管部門所面臨的主要難題,加強動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的檢測和監控是必然的趨勢。

2 氯霉素類藥物殘留測定方法

氯霉素作為一種廣泛用于動物養殖和畜禽養殖業中的抗生素,其殘留會對人類健康造成潛在危害。因此,建立快速可靠的氯霉素類藥物殘留檢測體系對于保障食品安全具有重要意義。目前,隨著科技的不斷進步,已經開發出了多種快速、準確、靈敏的氯霉素類藥物殘留檢測方法,包括微生物法、免疫分析法、氣相色譜法、氣相色譜—串聯質譜法、液相色譜法和液相色譜—串聯質譜法等。這些方法的出現與廣泛應用,保障了動物源性食品中氯霉素類藥物檢測的安全有效性。

2.1 樣品的前處理

為了提高氯霉素類藥物殘留的檢測效率和減少基質對檢測結果的影響,在進行檢測前通常需要對動物源性樣品進行提取和凈化。氯霉素類藥物微溶于水,溶于有機溶劑,常用乙腈和乙酸乙酯等有機溶劑進行提取[4]。曹麗麗等[5]對比了氨化乙腈、乙酸乙酯和甲醇等在雞蛋基質中對氯霉素類藥物的提取效果,結果顯示,使用乙腈和乙酸乙酯可以減少基質效應,使得提取效果滿足檢測要求。在采用有機溶劑對動物源性食品樣品進行提取時,同時會提取出大量的脂質或類脂物質。因此,在動物源性食品樣品中,將固相萃取技術運用于氯霉素類藥物殘留檢測前處理,可以除去脂溶性雜質,降低基質對樣品提取的影響,達到濃縮純化的目的[6]。楊方等[7]發現,對于復雜基質的樣品(如烤鰻等),使用正己烷脫脂的凈化效果不佳;使用C18固相萃取小柱對氟苯尼考胺的檢測無凈化作用;PSA固相萃取小柱對氟苯尼考胺的凈化效果不錯,但對于甲砜霉素和氟苯尼考的凈化效果不佳;采用串聯的C18固相萃取柱和PSA固相萃取柱進行樣品凈化可以取得較好的效果,并且可以同時檢測多種氯霉素類藥物。由此可見,動物源性食品樣品成分復雜,分析過程存在顯著的基質干擾,影響分析結果的準確性,故對樣品的提取和凈化均有較高的要求。

2.2 分析方法

2.2.1 微生物法 微生物法是一種常用的氯霉素類藥物殘留檢測方法,其原理是利用樣品中的氯霉素類藥物對培養基中的細菌形成抑菌圈的作用,通過觀察抑菌圈的形態特征來判斷檢測結果。微生物法的種類較多,包括發光細菌法、杯碟法等。其中,發光細菌法是微生物檢測中較為常用的檢測方法之一,通過利用鰒發光桿菌建立水產品中氯霉素殘留篩選方法,檢測靈敏度可以達到0.1 ng/mL[8]。杯碟法則被廣泛應用于肌肉組織中氯霉素殘留的檢測,該方法抗干擾能力強,結果準確可靠[9]。微生物法具備操作簡單、經濟快捷等優點,適合基層檢測和大批量篩查,但其準確性和靈敏度受到同族抗生素干擾較大,無法確定藥物殘留的具體量。因此,在高精度測量方面存在限制,需要結合其他檢測方法進行綜合判斷。

2.2.2 免疫分析法 放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)是一種利用同位素標記的抗原與未標記的抗原競爭同抗體結合進行定量測定的微量分析方法[10]。氯霉素的放射免疫檢測法于1985年建立,該方法對奶類基質最低檢出限為0.2 μg/kg,回收率達95%以上[11]。但是,放射免疫分析法使用放射性同位素進行微量分析,存在放射性污染的風險,可能會對周圍人員和環境造成危害。此外,該方法也存在交叉反應、假陽性等缺點,在氯霉素類藥物殘留檢測領域的發展也受到了一定限制。

酶聯免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是一種將特定的抗體或抗原與酶標記結合,并通過檢測酶標記來檢測樣品中目標物質的方法[12-13]。梁娟等[14]采用ELISA檢測方法檢測了蝦、蟹、參、魚等基質苗種中氯霉素類藥物殘留,結果顯示該方法具有高回收率和良好的重復性,回收率為71.2%～113.5%,相對標準偏差為3.3%～9.2%。許小炫等[15]采用碳酸鉀和乙酸乙酯作為提取試劑,建立了間接競爭化學發光酶聯免疫分析法,在0.010～0.179 μg/L線性范圍內,氯霉素的平均添加回收率為92.00%～112.50%,檢出限為0.009 μg/L。酶聯免疫法靈敏快捷、高精密度,且操作簡便,為工作中的檢測提供了很大的便利。

膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatography assay,GICA)是一種基于膠體金標記技術和免疫層析技術建立的生物分析方法。該方法利用膠體金作為熒光物質,在特異性抗原—抗體反應中實現檢測功能,待測物通過毛細作用流過層析膜上的檢測線(T線)與質控線(C線)時,與上面標記的特異性抗原或抗體結合,通過觀察C線與T線的顏色變化,實現樣品定性或半定量檢測。李倩等[16]使用膠體金免疫層析法來檢測帶魚中氯霉素殘留,樣品采用水和乙酸乙酯提取后,用正己烷去脂,正相硅膠固相萃取小柱凈化濃縮,緩沖液復溶,最后用快速檢測卡顯色,檢測結果與傳統的液相色譜—質譜法一致。膠體金免疫層析法不需要昂貴的儀器和專業人員的操作,結果直觀,適合作為初篩手段,被廣泛應用于基層現場檢測。

2.2.3 色譜法 氣相色譜法(gas chromatography,GC)是一種基于氣體流動相的色譜法。通常在采用氣相色譜法檢測氯霉素類藥物殘留時,需要對樣品進行衍生化預處理,以提高檢測的靈敏度和準確度。楊秋紅等[17]對水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺進行了固相萃取結合氣相色譜法的研究,采用不同的萃取劑、固相萃取柱、洗脫劑和定容試劑進行比較試驗,在最佳試驗條件下,氟苯尼考胺、氯霉素、氟苯尼考和甲砜霉素的檢出限分別為1.0,0.3,1.0,1.0 μg/kg,定量限分別為3.0,1.0,3.0,3.0 μg/kg,該方法具有較好的準確度和回收率。

與氣相色譜法相比,高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)操作簡便、迅速且不需要衍生化,因而備受推崇[18-19]。王安偉等[20]應用高效液相色譜法檢測羅非魚中氯霉素殘留量,發現在0.1～5.0 μg/mL的質量濃度范圍內,氯霉素濃度和峰面積呈較好的線性關系,且具有很好的精密度和回收率,檢測限為0.02 μg/g。章琦等[21]將分子印跡技術引入樣品前處理,采用表面沉淀聚合法制備氯霉素磁性分子印跡聚合物,用于樣品中氯霉素的富集提取,結合高效液相色譜法對牛奶基質中的氯霉素進行分析檢測。該方法的平均加標回收率為97.3%～104.3 %,檢出限為2.7 μg/kg,定量限為8.9 μg/kg。

2.2.4 質譜法 現代色譜和質譜技術的結合在動物源性食品質量控制和安全監管中發揮重要作用[22-23]。邵會等[24]建立了一種基于氣相色譜—串聯質譜法(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)的方法,用于檢測水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺多殘留。在樣品提取溶劑、凈化方法、衍生化方式及定容試劑相同的試驗條件下,該方法的檢測限和定量限均比氣相色譜法更低,其中氯霉素的檢測限為0.2 μg/kg,定量限為0.5 μg/kg,甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢測限為1.0 μg/kg,定量限為3.0 μg/kg。在此基礎上,勞哲等[25]開發了一種在線凝膠滲透色譜—氣相色譜串聯質譜法,用于測定動物源性食品中的氯霉素,該方法優化了各種條件,檢測限可以進一步降低至0.05 μg/kg。

張偉瑋等[26]使用液相色譜—串聯質譜方法(LC-MS)檢測雞肌肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺等藥物殘留。這項研究采用了具有強陽離子交換和反相交換雙重作用機理的Oasis MCX固相萃取柱對樣品進行凈化處理,在酸性溶液中,氟苯尼考胺以離子狀態存在,被保留在Oasis MCX柱上,而氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考則通過反相交換機理也被保留在Oasis MCX柱上,以提高檢測效率和準確性。崔悅等[27]比較了不同流動相,如乙酸銨溶液—乙腈或甲醇,在液相色譜—串聯質譜分析中的效果。結果表明,使用濃度為10 mmol/L的乙酸銨溶液—乙腈作為流動相可以提高離子化效率,并得到較好的色譜峰形。

超高效液相色譜—串聯質譜法(ultra performance liquid chromatograph mass spectrometer,UPLC-MS)具有更高的分離速度、分辨率、靈敏度和選擇性[28-29]。陸鄭紅等[30]使用UPLC-MS系統,建立了一種同時測定豬肉、雞肉和魚肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺的分析方法。該方法對氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限均為0.1 μg/kg,對氟苯尼考胺的檢出限為0.5 μg/kg。李龍[28]優化了流動相,采用梯度洗脫程序,建立了在0.1～10.0 μg/L濃度范圍內檢測水產品中氯霉素類藥物殘留的UPLC-MS檢測分析方法,對氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的檢出限均為0.1 μg/kg,平均回收率99.8%～112.5%。同時,常波[31]使用QuEChERS/固相萃取/液質聯用法測定魚基質中氯霉素的方法,在0.2～10.0 ng/mL線性范圍內,平均添加回收率在100%～115%,方法操作簡單、靈敏度高,適合大批量水產品中氯霉素殘留的篩查。此外,辛曉晨等[32]將提取液采用Captiba EMR-Lipid直通式固相萃取柱凈化,優化了樣品前處理過程的同時降低了雞蛋樣品基質干擾,提高了測定結果準確性,在0.2～5.0 μg/L線性范圍內,氟苯尼考胺、氟苯尼考和氯霉素的檢出限分別為0.04,0.01,0.02 μg/kg,定量限分別為0.12,0.03,0.06 μg/kg,平均回收率92.3%～109.6%。

2.2.5 其他方法 近年來,一些新型的檢測技術也開始被逐漸應用于動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的檢測。生物傳感器技術是其中一種。生物傳感器技術利用生物體系對氯霉素藥物的特異性反應,實現了快速、靈敏、準確的藥物殘留檢測[33-35]。程慧等[33]基于氯霉素與適配體—磁珠復合體的競爭反應(氯霉素的特異性結合可解離適配體與DNA酶的結合,從而抑制DNA酶與血紅素結合催化顯色反應活性),建立了一種用于雞蛋中氯霉素殘留檢測的方法,該方法通過引入DNA酶及磁性納米微球,簡化操作的同時減少了假陽性結果的產生。此外,也有一些研究者[36-38]嘗試開發了一些新型化學分析方法,如磁性化學發光酶免疫法、分子印跡電致化學發光傳感器等,用于檢測動物源性食品中氯霉素的殘留。王玲等[36]基于磁性納米粒子建立了一種用于豬肉中氯霉素殘留檢測的磁性化學發光酶免疫方法。該方法將磁性微球替代酶標板作為固定相,降低了空間位阻,使免疫反應進行得更加充分,方法檢出限為0.013 μg/kg,回收率為85.24%～93.57%。艾晨昊等[37]以硫化鎘作為發光試劑,結合分子印跡技術,構建了一種用于測定蜜蜂樣品中氯霉素殘留檢測的分子印跡電致化學發光分析方法,該方法的檢出限為6.1×10-13mol/L,用于實際樣品添加回收時,回收率為95.0%～109.0%。這些新型檢測技術還處于研究和探索階段,在食品安全檢測行業具有廣闊的應用前景和發展潛力[39-40]。

綜上所述,動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的檢測方法主要包括微生物法、免疫學方法、色譜法、質譜法等。微生物法無需復雜的儀器設備,但操作復雜、耗時長且結果易受到環境因素和操作者技術水平的影響。免疫學方法操作簡單、成本低,但常存在檢測結果誤差大、檢測限高、易受樣品基質和其他抗生素藥物的干擾。色譜法具有高靈敏度和準確性,但前處理過程復雜且需要高級儀器,對技術水平的要求也比較高。色譜—質譜聯用方法是目前測定氯霉素類藥物殘留的主流方法,具有高靈敏度和準確度。新型基于材料化學的檢測技術在該領域引起研究人員的廣泛關注,但仍然缺乏深入的研究和應用,同時簡單、快速和準確、靈敏的檢測方法仍然是未來需要突破的技術瓶頸。

3 總結與展望

目前,評估動物源性食品中氯霉素類藥物殘留的檢測方法包括高效液相色譜法、液相色譜—串聯質譜法和氣相色譜—串聯質譜法。而前處理方法主要有固相萃取法和液液萃取法等。這些方法準確度高、精密度好,但是也存在一些問題,比如樣品前處理的復雜性、凈化過程的繁瑣和耗時性、所需的儀器設備昂貴、技術人員要求熟練以及分析周期較長等。為了彌補這些缺點,新型的基于材料化學的檢測技術應運而生。這些新技術是實驗室常規檢測方法的有益補充,特別是新版《食品安全法》和《農產品質量安全法》均認可了快速檢測方法對食品或農產品質量安全監督抽檢的結果,極大地推動了快速檢測技術的發展。然而,在快速檢測技術快速發展的同時,問題也逐漸顯現,自主創新技術、產品質量均一性和穩定性不足,研發和應用脫節,快檢產品難以滿足市場監管和用戶需求。目前中國對快速檢測方法和儀器的有效性評價還缺乏統一的標準,嚴重影響結果的可靠性,特別是在監督執法的場合。為滿足市場監管需求,研究和應用動物源性食品中的氯霉素類藥物殘留快速檢測技術和方法的同時,發展和完善傳統實驗室定量檢測分析方法具有重要意義,建立快速檢測標準化體系也是未來氯霉素類藥物殘留檢測的一個重要發展方向。