植物類外泌體樣納米顆粒特性、成分與功能研究進展

陳春蘋 徐紅艷, 劉帥辰 田雨欣 王羽琛

(1. 延邊大學融合學院,吉林 延吉 133002;2. 延邊大學農學院,吉林 延吉 133002)

植物細胞以傳遞性或調節性方式分泌的納米級囊泡,即類外泌體樣納米顆粒(exosome-like nanoparticles,ELNs),是細胞間重要的通信工具[1]。根據生物發生機制(圖1),可分為3類:① 外泌體:直徑為30～150 nm,來自細胞的胞內體;② 微囊泡:直徑100～1 000 nm,由質膜向外釋放(出芽)產生;③ 凋亡小體:直徑1 000～5 000 nm,由凋亡細胞釋放[2]。外泌體和微囊泡的生物發生并不是嚴格分開的,可以同時形成,并且兩者在物理性質和組成上差異較小[3],它們常被稱為“納米囊泡”“微囊泡”“外泌體”或“外泌體樣囊泡”。國際細胞外囊泡協會(international society for extracellular vesicles,ISEV)號召對植物ELNs研究要標準與嚴謹[4],從植物源分離的粒徑在1 000 nm以下的納米級囊泡,將其稱為植物ELNs。

圖1 植物ELNs的形成及其作為生物藥物在預防和治療各種疾病中的應用

近年來,隨著動物ELNs在診斷、治療、藥物載體等領域的廣泛應用,植物ELNs的功能作用也越來越受關注[5-6]。與動物ELNs相比,植物ELNs具有來源廣、可大量獲取等優點。植物ELNs具有種間“通信”能力,可在動物疾病模型中發揮治療作用(圖1)。一方面是由于其本身存在的生物活性物質。Deng等[7]從西蘭花中分離出ELNs,證明其可作用于腸道上皮細胞并維持腸道免疫穩態。另一方面,植物ELNs也可以用作藥物載體,如裝載miRNAs、蛋白質和其他藥物,低免疫原性的特點和表面特殊的成分可促進其進入器官、組織和細胞[8-9]。Xu等[10]發現人參ELNs可將裝載的miRNAs轉移到骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),促進BMSCs的神經分化;與番茄ELNs相比,葡萄ELNs表現出更好的負載外源性蛋白Hsp70并遞送到神經膠質瘤細胞的能力[11]。因此,含有活性成分和可作為載體的植物ELNs具有較好的研究前景。文章擬總結近年來植物ELNs的分離方法、特性、組成成分及功能,以期為植物ELNs的功能食品開發提供理論參考。

1 植物ELNs的分離

依據植物ELNs的大小、形態、表面標志物等特征,其常見的分離方法主要有超速離心、蔗糖密度梯度離心、超濾、聚合物沉淀、免疫親和、體積排阻色譜、微流體技術、親和捕獲和非對稱流場流分餾技術等(表1)。目前,大多采用超高速離心法和蔗糖密度梯度離心法分離并純化植物ELNs[7,10-11],但存在ELNs受損、純度低、耗時長等缺點。近年來,新興技術(微流體、電、聲、力等)逐漸被用于ELNs的分離,并表現出相對更好的分離效果,但仍不完善[12-13]。因此,植物ELNs不同的分離方法具有不同的優點和局限性,分離技術的選擇取決于樣品的性質和后續試驗需求。

2 植物ELNs的特性

2.1 穩定性

超高速離心法被稱為ELNs提取的“金標準”[14]。但反復超高速離心會造成ELNs損傷,影響其生物活性[14-15]。植物ELNs提取后,懸浮于PBS緩沖液中,短期保存于4 ℃,長期貯藏于-80 ℃,需避免反復凍融。4 ℃條件下,百合、黃精和天麻ELNs隨貯藏時間延長,粒徑逐漸增大,可能發生了顆粒聚集;但在-80 ℃環境下,粒徑均未發生明顯變化[16]?；瘜W解構劑Triton X-100和超聲可破壞ELNs的磷脂膜,使其結構不完整。Triton X-100處理后人參ELNs的粒徑無法測得,且誘導巨噬細胞極化的能力被顯著降低[14]。此外,超聲處理也降低了植物ELNs的抗氧化活性和細胞內吞能力[16]。綜上,植物ELNs的穩定性受其提取方法、貯藏條件和結構完整性的影響。

2.2 耐酸性

在胃腸道溶液中保持穩定性是植物ELNs可以口服的前提。分別在水、0.5 mol/L HCl和0.5 mol/L NaOH溶液中37 ℃孵育30 min,相較于中性和堿性溶液,葡萄柚ELNs在酸性溶液中粒徑分布最均勻。胃液中不僅具有低pH,還存在多種消化酶[17-18]。體外模擬消化評估生姜ELNs的消化穩定性[19-20],其粒徑在模擬胃液中增加,在模擬小腸液中則進一步增大;同時,在模擬胃液中,Zeta電位從負變為正,而在模擬小腸液中,Zeta電位從正向負轉變;活體成像和器官成像結果也表明其主要富集在結腸組織,表明生姜ELNs可通過低pH的胃到達高pH的結腸中。綜上,植物ELNs在酸溶液中粒徑更穩定。

2.3 內含物差異性

植物ELNs含有脂質、miRNAs和蛋白質等生物活性成分。同一品種不同大小葉片的茶葉ELNs,液相色譜與串聯質譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)結果表明脂質組成具有差異性,但都主要為磷脂酸(PA,占總脂質的32.7%～45.7%)、磷脂酰甘油(PG,占總脂質的19.3%～22.7%)和磷脂酰肌醇(PC,占總脂質的13.6%～19.2%)[21]。植物ELNs含有多種miRNAs,但不同物種的miRNAs類型和水平與其來源有關。11種果蔬ELNs樣本中,共鑒定418種miRNAs,每個物種分別含有32～127種;其中生姜ELNs的miRNAs種類最少(n=32),大豆ELNs的miRNAs種類相對較多(n=127)[22]。與檸檬的蛋白質數據庫相比,檸檬ELNs的蛋白質種類的覆蓋率達到84%[23]。因此,植物ELNs的內含物具有差異性。

2.4 低免疫原性

植物ELNs的功能作用取決于多種因素,包括來源、組成成分、驗證模型和給藥途徑等。在果蔬中分離得到的植物ELNs,例如葡萄[24]、葡萄柚[25]、生姜[19-20,26]、檸檬[17]、西蘭花[7]、胡蘿卜[27]、椰子[28-29]、蘋果[30]、人參[31]和藍莓[32],不攜帶人畜共患病原體,具有安全可靠、副作用小、生物利用度高等優點。腸黏膜免疫系統在食物(如植物ELNs)導致的不良反應方面起著重要作用[33]。從葡萄柚中分離的ELNs可以被腸道巨噬細胞選擇性吸收,從而改善葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt,DSS)誘導的結腸炎。檸檬ELNs通過胃腸道轉運入血液中并送達腎區,阻斷草酸鈣結石誘導的細胞內質網應激反應,將受激的胞內鈣信號恢復穩態,改善腎結石[34]。此外,植物ELNs可作為藥物載體,相比人造納米載體[例如基于共聚物的納米顆粒、金屬基納米顆粒(金/銀)和碳基納米顆粒],具有低免疫原性[35-37]。用葡萄柚或生姜ELNs裝載藥物后不會增加炎性因子或轉氨酶的表達水平,也不會引起組織病理學損傷[38-39]。不同的給藥途徑也會影響ELNs的安全?？诜参顴LNs不會影響試驗動物的生理生化指標,也不會引起局部或全身毒性[20,24],但其他給藥方式是否具有危險性目前仍不清楚。綜上,植物ELNs安全性仍然缺乏證據,還需要進一步研究。

2.5 生物相容性

眾所周知,食物對哺乳動物細胞穩態的調節有很大的影響,特別是消化系統中的細胞。天然來源的植物ELNs,因其可逃避免疫系統分解的生物相容性而受到關注,并且其跨物種傳遞“信息”的功能也得到了廣泛關注。蘆薈ELNs在人類皮膚細胞上表現出良好的細胞相容性,通過激活Nrf2信號通路促進傷口愈合[40]。ELNs能在細胞間通信,可能是自身的miRNAs、脂質和蛋白質等生物活性物質在發揮作用。生姜ELNs中的脂質可通過抑制NLRP3炎癥小體活化,治療慢性牙周炎[41];黃豆ELNs中的miRNA-5781可以直接靶向白細胞介素-17A,在炎癥反應中起重要作用[22];大蒜ELNs的表面配體(II凝集素)與HepG2細胞上的CD98糖蛋白結合并介導ELNs的內化以發揮抗炎作用[42]。植物ELNs不僅可跨物種與動物交流“信息”,還可以與微生物交流。擬南芥ELNs中siRNA能夠跨物種運輸進入疫霉菌,抑制疫霉菌的生長[43]。綜上,植物ELNs可跨物種傳遞“信息”,具有一定的生物相容性。

2.6 靶向性

植物ELNs的囊泡狀結構使其可以裝載脂溶性物質、核酸或蛋白質等,通過ELNs表面受體或胞吞作用與靶細胞膜融合將“貨物”釋放到細胞質中來發揮作用[44]。檸檬ELNs可通過特異性靶向腫瘤部位,激活TRAIL信號通路引發細胞凋亡,抑制癌細胞增殖[45]。西蘭花ELNs可作用于腸道樹突狀細胞,靶向效應器核糖體蛋白S6激酶1調節mTOR信號通路,激活樹突狀細胞AMPK以釋放炎癥因子,維持腸道免疫穩態[7]。Kalarikkal等[46]通過提取生姜以及柚子來源ELNs中的miRNAs,篩選出22個可能針對SARS-CoV-2基因組的miRNAs,發現其中11個miRNAs對SARS-CoV-2具有絕對的靶向性。綜上,植物ELNs具有多組分,分別可與受體發生特異性識別,具有靶向性。

3 植物ELNs的成分分析

植物ELNs可將自身生物活性物質運輸到特定部位并發揮作用(圖2)[10,12,44]。隨著測序和質譜技術的不斷發展,涌現出的脂質組學、轉錄組學和蛋白質組學等技術能夠在不同維度上反映植物ELNs的組成成分,多組學探究植物ELNs的功能逐漸成為研究熱點。通過組學對植物ELNs在分子水平進行探究,可為植物ELNs的結構、功能和應用等方面提供參考。

3.1 脂質分析方法及功能

脂質主要存在于植物ELNs雙層磷脂膜上,常用有機溶劑法提取,如Folch法、Bligh-Dyer法和Matyash法等。脂質分析方法主要有薄層色譜法(thin-layer chromatography,TLC)和LC-MS/MS。TLC是最早運用在脂質組學中的色譜工具,分析步驟主要包括薄層板的制備、點樣、展開、顯色和分析。Bokka等[47]通過TLC證明了番茄ELNs中含有磷脂酰絲氨酸(PS)、PA、PC和磷脂酰乙醇胺(PE)。但TLC檢測范圍小,靈敏度較低。目前,LC-MS/MS在植物ELNs的脂質分析中應用較多(表2)。通過三重四極桿質譜儀分析確定生姜ELNs富含PC(占比47%)[41];電噴霧電離三重四極桿質譜儀對大蒜ELNs進行脂質鑒定,發現其主要含有PC(占比43%)和PE(占比33%)[48]。

表2 脂質組學在植物ELNs功能研究中的應用

脂質對ELNs有直接的保護作用。脂質主要位于ELNs的外層膜上,可保護內含物抵御外界環境的變化,溫度、pH、模擬生理環境和超聲等[33]。體外模擬消化表明植物ELNs在胃液中較穩定,可被腸道微生物或者腸道上皮細胞吸收[17]。被熒光染料標記后藍莓和大蒜ELNs主要富集在結腸組織[32,48]。植物ELNs中主要為磷脂類脂質,對機體也可發揮間接調控作用,如抗炎、抗癌、調節腸道菌群等功能(表2)。生姜ELNs中的脂質通過作用于原代骨髓巨噬細胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)的NLRP3炎癥小體,發揮抗炎作用[49];大蒜ELNs中的PA可與腦酸溶性蛋白1(BASP1)發生作用,使更多鈣調素被招募到BASP1,導致缺乏維持c-Myc活性所需的c-Myc/鈣調素復合物的形成,抑制腦小膠質細胞中的c-Myc基因的激活,從而抑制c-GAS/STING炎癥通路相關因子表達[48];磷脂也可影響植物ELNs在腸道中的存在時間和積累程度,改變腸道菌群的豐度[53]。綜上,脂質是植物ELNs的重要成分,對內含物有直接的保護作用和間接的功能作用。

3.2 miRNA分析方法及功能

miRNA是高效的基因表達調控因子,不僅在機體內執行生物學功能,還可跨界調控基因表達[43]。植物ELNs中的miRNA相對分子質量小、含量低,磷脂雙分子層保護其不被降解[32]。微量RNA提取試劑盒或ELNs-RNA提取專用試劑盒可用來提取植物ELNs中的RNAs。瓊脂糖凝膠電泳對RNAs進行表征是比較傳統的方法。通過提取藍莓RNAs,1%瓊脂糖凝膠電泳表明其主要含有小相對分子質量RNAs[32]。測序技術可對miRNA定性和定量,并通過靶基因預測植物ELNs的功能作用(表3)。

表3 測序技術在植物ELNs功能研究中的應用

植物ELNs中的miRNAs可跨物種進入細胞。通過ExoGlow RNA EV試劑盒標記生姜ELNs的RNA,激光共聚焦顯微鏡下觀察到RNA穿過BMDM細胞膜被運輸到細胞核附近[52]。植物ELNs的miRNAs具有抗炎、抗癌、抗氧化以及改善神經性退行性疾病等作用(表3)。Xiao等[22]對11種果蔬ELNs進行miRNA測序,生物信息學分析表明可靶向編碼炎癥相關基因(如白細胞介素-6、白細胞介素-2、白細胞介素-5和白細胞介素-1)和癌癥相關基因(如小細胞肺癌、子宮內膜癌和結直腸癌等)。因此,植物ELNs的miRNA可跨物種發揮作用,具有調節基因表達影響機體功能的作用。

3.3 蛋白質分析方法及功能

蛋白質的傳統表征方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western Blot。SDS-PAGE可以鑒定出是否具有蛋白質以及蛋白質相對分子質量區間,但不能確定含有的蛋白質種類。Western Blot可對ELNs的標志蛋白(CD9、CD81等)進行鑒定,但目前植物ELNs的標志蛋白尚未統一。蛋白質組學可以在一定水平上探究蛋白質的特征,包括蛋白質的表達水平、翻譯后的修飾、蛋白與蛋白相互作用等,定性和定量分析某些關鍵蛋白,來獲得對蛋白質水平上的疾病發生及細胞代謝等過程的整體認識,并且結合生物信息學方法對關鍵蛋白功能進行挖掘,揭示植物ELNs的生理病理功能。常用于植物ELNs蛋白質組學的研究方法有LC-MS/MS、納米高效液相色譜—電噴霧電離(ESI)—質譜分析、鳥槍法和標記技術等(表4)。

表4 蛋白組學在植物ELNs功能研究中的應用

蛋白質濃度和囊泡數量可以用來評估ELNs的純度[54]。囊泡數量與蛋白質濃度的比值越高,表明提取到的ELNs純度越好。ELNs磷脂膜結構的穩定性也與蛋白質的含量和存在位置有關(表4)。較高含量的膜相關蛋白會增加離子和水分子的轉運,維持囊泡結構的穩態[12]。植物ELNs中的蛋白質主要來源于胞質,多數為膜相關蛋白[23,51,61-62]。西蘭花ELNs中的水通道蛋白與囊泡的穩定性和通透性有關[58]。通道蛋白也可影響植物ELNs的貯藏穩定性[63]。此外,植物ELNs中的蛋白也可在生理代謝、信號傳導等方面發揮作用。植物ELNs磷脂膜表面的蛋白配體,可促進機體識別并攝入ELNs。大蒜ELNs的表面配體(II凝集素)與HepG2細胞上的CD98糖蛋白結合并介導大蒜ELNs的內化以發揮抗炎作用[42]。綜上,植物ELNs中蛋白含量豐富,多數為膜蛋白,可維持ELNs結構的穩定以及作為生物活性成分發揮作用。

3.4 其他活性物質

植物ELNs還含有糖類、酯類和酚類物質等。西蘭花ELNs中的萊菔硫烷通過激活AMPK,導致樹突狀細胞發生耐受并改善結腸炎[7]。生姜ELNs中的6-姜醇可激活核因子Nrf2從而改善小鼠酒精性肝損傷[19]。蘋果衍生的ELNs含有的類黃酮和呋喃香豆素,被證明具有抗菌作用[64]。來自生姜的ELNs含有姜黃素類似物6-姜辣素和6-大黃素,具有抗氧化的作用[64-65]。草莓ELNs富含花青素、葉酸、黃酮醇和維生素C,對BMSCs沒有細胞毒性,并且以劑量依賴性方式預防BMSCs的氧化應激[54]。檸檬和柑橘ELNs具有多種黃酮類化合物,例如檸檬黃素、槲皮素、維西寧-2、柚皮苷、橙皮苷和檸檬苦素等,這可能使其發揮抗炎作用[53]。綜上,植物ELNs似乎具有多種組分,充分體現了多靶點、多功能的特點。

4 結論及展望

植物類外泌體樣納米顆粒(ELNs)含有脂質、miRNA、蛋白質等生物活性成分,具有一定的穩定性、耐酸性、內含物差異性、低毒性以及較好的生物相容性和靶向性,多組學分析技術也逐漸應用在植物ELNs的功能研究上。但相較于動物ELNs,植物ELNs研究仍具有很大的發展空間。關于植物ELNs的研究仍存在以下問題:① 植物ELNs的表征主要是通過形貌觀察以及組分進行確定,關于其標志性蛋白尚未統一;考慮到未來更進一步在臨床上的應用,其純度也需要作為表征因素之一。② 由于植物ELNs的形成通常受到植物的季節性和區域性因素的限制,并且長期的田間培養是一個耗時費力的過程,可嘗試組織培養技術來提供持續、穩定和可大量分離植物ELNs的解決方案。③ 植物ELNs具有多種組分,可通過多組學聯用的方法,多角度去探究功能。雖然目前植物ELNs存在較多未知與挑戰,但其在生物相容性、治療能力、靶向能力和細胞攝取等方面也顯示出許多優勢,可通過多學科交叉融合,開發為多種常見疾病的可靠治療劑。