絞股藍提取物用于護膚品的功效初探

莫 夏

(福建三狀元生物科技有限公司，福建 福州 350700)

絞股藍喜歡陰濕，不耐旱，是一種分布很廣泛的植物，在國內外均有分布，多分布于海拔300～3200 m 的山林地帶，我國主要分布于秦嶺以南的陜西、四川、湖北、湖南、廣東、廣西、福建等地[1]。由于氣候差異，南部早熟，北部略遲，其有三葉、五葉和七葉生態類型[2]。

絞股藍性寒，民間用于治療高脂血癥、高血壓、高血糖，尤其是高脂血癥，其他藥物和食物難以替代[3-4]。絞股藍含有皂苷、多糖、黃酮類、水溶性氨基酸、多種維生素、微量元素、礦物質，這些營養成分對絞股藍的藥用價值有很多作用，加上其效用和人參相似，也被稱為“南參”[5-6]。

1984年，我國注意到絞股藍的功效，對其分布資源進行了調研和開發。由于絞股藍具有很高的藥用價值和保健價值，國家科學委員會于1986年將其列為星火計劃中最有價值的中草藥[7]。2002年3月5日，原衛生部將其列入保健品目錄。全國各地的茶葉加工企業將其制成茶葉，并銷往市場[8]。絞股藍能很好地改善腦力，提高大腦機能，它除了能降低“三高”之外，還能抑制血栓形成，讓老人遠離動脈硬化。日常飲用絞股藍，還能活化人體內的細胞，緩解疲勞，促進良好睡眠。除人參的功效外，它還具有人參所沒有的多種功效，并且沒有人參過量的反應和任何其他毒副作用[7，9]。

現代研究表明，絞股藍具有極高的藥用價值和觀賞價值，這引起了學者和許多普通百姓的關注。目前，絞股藍已經不拘泥于藥用和茶類[9]，它在保健食品、化妝品、飼料等制品均有涉獵。許多學者對絞股藍的化學成分、組織培養、栽培技術等方面進行了研究[8，10]。隨著科學技術發展，天然產物的提取方法越來越多[11]。絞股藍的提取工藝也豐富多彩，最常見的有超聲波輔助提取、微波輔助提取、超臨界流體萃取、溶劑萃取等[12]。因此，絞股藍具有良好的發展前景[13-15]。

隨著經濟的發展，人們的壓力越來越大，生活不規律，使得黑色素形成，皮膚老化。因此，美白抗衰老化妝品成為化妝品領域的一個熱點[5，16]。其中，天然產品化妝品的開發，特別是含有中草藥活性成分的化妝品，越來越受到國內外廠商的重視[17]。

本工作研究絞股藍有效成分對黑色素的抑制作用、抗氧化能力和抗菌能力，探討絞股藍提取物在化妝品中應用的可能性，為絞股藍這一藥用資源的研究開發提供試驗科學依據[16，18-19]。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

絞股藍，安國市佳雨參茸藥材行；營養瓊脂粉，廣東環凱微生物科技有限公司；酪氨酸酶(25 KU/480)，美國Worthington；L-多巴胺，南京奧多福尼生物科技有限公司；菌種，福建師范大學生命科學學院；其他試劑均為國產分析純。

1.2 主要儀器與設備

電子天平，VAriAn；電熱干燥箱，上海亞榮生化儀器廠；旋轉蒸發儀，臨沂正衡化玻儀器有限公司；721可見分光光度計，上海佑科儀器儀表廠；細菌培養箱，上海一恒科技有限公司；霉菌培養箱，上海一恒科技有限公司；無菌操作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 試劑、溶液配制

1.3.1 絞股藍樣品溶液制備

配制 25 mL 2.32 mg/mL 絞股藍樣品溶液(60%的乙醇溶液為溶劑)用于絞股藍總黃酮含量測定；

配制 1000 mL 0.4 mg/mL 絞股藍樣品溶液(PBS為溶劑)用于羥基自由基清除能力的測定；

配制 1000 mL 0.02 mg/mL 絞股藍樣液(用無水乙醇溶液為溶劑)用于DPPH自由基清除能力測定；

配制 10000 μg/mL 絞股藍樣液(PBS為溶劑)用于體外美白評價。

1.3.2 其他樣品溶液制備

pH=6.8的磷酸鹽緩沖溶液 (PBS)；0.04 mg/mL 的蘆丁標準液(60%乙醇為溶劑)；0.4 mg/mL 抗壞血酸(VC)溶液(PBS為溶劑)；0.3% H2O2溶液；9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液(75%的乙醇為溶劑)；9 mmoL/L 硫酸亞鐵溶液；2 mmoL/mL DPPH溶液(無水乙醇為溶劑)；酶活為 100 U/mL 酪氨酸酶溶液(PBS為溶劑，4 ℃ 避光保存)；2.0 mmoL/LL-多巴胺溶液(PBS為溶劑，4 ℃ 避光保存)。

1.4 實驗方法

1.4.1 絞股藍中黃酮類物質的提取

將一定量的絞股藍草藥粉碎后過篩(100目)。將過篩后的絞股藍粉末放入 50 ℃ 的烘箱中干燥至恒重，取干燥后絞股藍粉末m1放入 250 mL 的圓底燒瓶中，設置溫度為 90 ℃，加入80%乙醇溶液 (料液比為 1 g∶20 mL)，提取 2 h 后，抽濾的提取液放置 60 ℃ 烘箱蒸發乙醇，放置 70 ℃ 烘箱干燥得絞股藍提取物m2。參照公式(1)計算其提取率：

提取率=(m2/m1)×100%

(1)

1.4.2 蘆丁標準曲線的繪制

取 25 mL 容量瓶8個，分別加入 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL 蘆丁標準液，再往其中加入 1 mL 40 g/L NaNO2溶液和 1 mL 100 g/L Al(NO3)3溶液，搖勻且靜置 6 min 使其反應完全，最后加入 10 mL 40 g/L 的NaOH溶液，蒸餾水定容至刻度線，搖勻后靜置反應 15 min。調節分光光度計的波長為 510 nm，測量各溶液吸光度，各測3次，取平均值，繪制蘆丁標準曲線。

1.4.3 絞股藍總黃酮含量測定

移取 2.32 mg/mL 絞股藍樣品溶液 4.0 mL 于 50 mL 容量瓶中，依次加入 40 g/L 的NaNO2溶液 2 mL 和 100 g/L 的Al(NO3)3溶液 2 mL，搖勻后靜置 6 min 使其反應完全，再加入 40 g/L 的NaOH 20 mL，用蒸餾水定容至刻度線，搖勻靜置 15 min。在與測定蘆丁對照品吸光度同樣的環境下，測定溶液的吸光度，記錄數據，參照公式(2)計算其總黃酮含量：

w(總黃酮)=(ρ×V×V2)/(V1×m)×100%

(2)

式中：ρ為依據吸光度A計算出的濃度；V為溶解試樣所需溶劑體積；V1為吸取試樣溶液體積；V2為稀釋試樣溶液體積；m為試樣質量。

1.4.4 絞股藍提取物抗氧化性能測定

目前人們常利用Fenton法[20]和DPPH法[21-22]測量清除羥基自由基和DPPH自由基的能力，從而得出抗氧化劑的抗氧化效果。

1)羥基自由基清除能力測定

取 50 mL 容量瓶11個，分別加入 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL 0.4 mg/mL VC溶液，再往其中依次加入 5 mL 9 mmoL/L 硫酸亞鐵、5 mL 9 mmoL/L 水楊酸-乙醇溶液；最后加入 5 mL 0.3% H2O2溶液開啟反應，加入蒸餾水至刻度線，搖勻后靜置 40 min；測定各溶液的吸光度，利用吸光度計算抗壞血酸對羥自由基的清除率。絞股藍提取物羥基自由基清除能力測定步驟同上。參照公式(3)計算其羥基自由基清除率(S)：

S=(A0-A1)/A0×100%

(3)

式中：A0為空白組吸光值；A1為加抗氧化劑的吸光值。

2)DPPH自由基清除能力測定

分別往8個試管中分別加入 1.0 mL 0.0015、0.0030、0.0045、0.0060、0.0075、0.0090、0.0105、0.0120 mg/mL 的絞股藍樣液，再加入 2.0 mL 2 mmoL/mL DPPH溶液，在避光條件下反應 10 min 后，在波長 517 nm 處，測各溶液的吸光值A1，并測量空白組A2、A0的吸光值。

參照公式(4)計算其自由基清除率：

樣品對DPPH的清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

(4)

式中，A1為不同濃度絞股藍樣品液+DPPH溶液的吸光值；A2為不同濃度絞股藍樣品液+無水乙醇的吸光值；A0為無水乙醇 +DPPH溶液的吸光值。

1.4.5 體外美白評價

1)酶活力測定[23]

依次加入 2 mLL-多巴胺溶液、0.5 mL pH=6.8的PBS、0.5 mL 酪氨酸酶溶液于比色杯中，快速搖勻，避光恒溫 37 ℃ 條件下，于 475 nm 波長處每分鐘測定一次溶液的吸光度值，平行測量三組，直至吸光度無變化，得出吸光度A隨時間的變化曲線。

2)絞股藍提取物濃度對酪氨酸酶的抑制作用

每管分別加入 2.0 mLL-多巴胺溶液、0.5 mL 質量濃度分別為為 50、100、200、400、600、800、2000、4000 μg/mL 的絞股藍樣品溶液、0.5 mL 酪氨酸酶溶液，待酶活數據在 37 ℃ 水浴中穩定后，在 475 nm 處測定吸光度值。

空白組用等體積PBS代替酪氨酸酶溶液，酶活數據在 37 ℃ 水浴中穩定后，用PBS將紫外分光光度計調零，在 475 nm 處測定吸光度值。

3)抑制率計算

根據吸光值A參照公式(5)計算絞股藍提取物對酪氨酸酶的抑制率：

抑制率=[1-(C-D)/(A-B)]×100%

(5)

式中：A為磷酸鹽緩沖液 0.5 mL+L-多巴胺溶液 2.0 mL+酪氨酸酶溶液 0.5 mL 混合后測得吸光度；B為磷酸鹽緩沖液 1.0 mL+L-多巴胺溶液 2.0 mL 混合后測得吸光度；C為L-多巴胺溶液 2.0 mL+絞股藍提取液溶液 0.5 mL+酪氨酸酶溶液 0.5 mL 混合后測得吸光度；D為L-多巴胺溶液 2.0 mL+絞股藍取液溶液 0.5 mL+磷酸鹽緩沖液 0.5 mL 混合后測得吸光度。

1.4.6 絞股藍提取物的保濕評價

1)在兩個不同的干燥器內分別加入飽和碳酸鉀溶液和變色硅膠，并存放于 20 ℃ 的恒溫箱中，制成相對濕度分別為43%和硅膠環境[24-25]。

2)將載玻片洗凈烘干，并貼上醫用膠帶。將絞股藍提取物，1%丙二醇溶液分別在膠帶上涂抹均勻，呈不會有液滴落下的濕潤狀態，稱質量，測量3次，取平均值m3。

3)將上述涂抹均勻的玻片放置于相對濕度為43%和硅膠環境的干燥器中，放置 8 h，每隔 2 h 迅速取出稱重后放回干燥器，平行測量3次，取平均值m4。

4)參照公式(6)計算其失水率(R)：

R=((m3-m4))/m3×100%

(6)

1.4.7 抗菌評價[26]

將 0.0344 g/mL 絞股藍提取物溶液、帶細菌培養基、打孔器、移液器等放于超凈臺中滅菌 15 min，用打孔器于培養基中心打孔后，取出孔內瓊脂，用移液器將 200 μL 絞股藍提取物加入孔內。將帶有絞股藍提取物的培養基(不倒扣、不封口)放入 37 ℃ 培養箱中，培養 24 h 后取出培養基，測抑菌圈直徑大小。

1.4.8 抗炎評價

將試劑盒提前 20 min 從冰箱中取出，并平衡至室溫，按說明書提前制備標準品，稀釋至一系列質量濃度梯度，濃縮洗滌液按體積比1∶20稀釋。取出本實驗所需的條帶，分別加入標準稀釋劑或樣品 100 μL/孔，保留空白孔，用膜密封板，在 37 ℃ 下孵育 90 min。洗滌板5次后，除空白孔外，加入預先制備好的生物素化的抗體工作液 100 μL/孔，蓋膜，37 ℃ 下避光孵育 60 min。洗板5次，每孔加酶結合工作液 100 μL，覆磨封板，37 ℃ 暗孵 30 min。洗板5次，每孔加顯色底物 100 μL/孔，37 ℃ 下避光孵育 15 min，加終止液 100 μL/孔，振蕩器震蕩 2 min，攪拌均勻，立即測量OD450。

2 結果與分析

2.1 絞股藍中黃酮類物質的提取

在溫度為 90 ℃，料液比為1 g∶20 mL下，用80% 乙醇溶液中提取2 h，可得出提取率為13.75%。

2.2 黃酮含量

為了測量絞股藍提取物中的黃酮含量，通過標準曲線法繪制蘆丁標準曲線，如圖1所示。再用紫外分光光度計測出絞股藍提取物的吸光度，代入蘆丁曲線，得出絞股藍提取物中黃酮的含量。

圖1 蘆丁濃度與吸光度關系圖

絞股藍提取物試樣用分光光度計測得吸光度為0.240，把測得的值代入蘆丁標準曲線中A=16.0714ρ-0.16557 (R2=0.9997)，計算出黃酮含量為1.34%。

2.3 抗氧化性測定

2.3.1 清除羥基自由基能力測定

為了探究絞股藍提取物是否能對自由基氧化反應進行阻止，通過實驗，利用Fenton法對VC與絞股藍提取物進行抗氧化測試，得出絞股藍提取物清除羥基自由基的能力并與VC清除羥基自由基能力進行對比，所得結果如圖2所示。

圖2 絞股藍與VC對自由基清除率對比圖

由圖2可知，當質量濃度達到 0.04 mg/mL 時，兩者抗氧化性接近；之后絞股藍抗氧化性會超過VC。絞股藍提取液和VC均具有清除羥自由基的能力，且清除率與質量濃度呈正相關。從圖2看出，隨著絞股藍提取物質量濃度的增加，對羥自由基的清除作用不斷上升，達最高清除率85%后不再變化。但總體來看，絞股藍最佳清除率略低于VC。結果表明，絞股藍提取物具有一定的抗氧化作用，但抗氧化效果一般。

2.3.2 DPPH自由基清除能力測定

由于DPPH自由基有單電子，在 520 nm 處有一強吸收，醇溶液呈紫色，被廣泛用于抗氧化能力的測定。為探究絞股藍提取物的抗氧化功效，測量樣品清除DPPH自由基的能力來預估絞股藍提取物的抗氧化能力，最終得到絞股藍提取物濃度對DPPH自由基清除率的變化圖，如圖3所示。

圖3 絞股藍提取物對DPPH的清除率

由圖3知，隨著加入不同質量濃度的提取物，對DPPH自由基的清除率呈上升趨勢，可見絞股藍提取物對DPPH自由基有消除能力，有一定地抗氧化效果，其在質量濃度達到 0.018 mg/mL 左右時絞股藍提取物對DPPH的清除率到達最大89.64%。

2.4 體外美白評價

2.4.1 酪氨酸酶酶活力測定曲線

酪氨酸酶活力越高，代表形成黑色素的速率快，因此酪氨酸酶活力的測定在美白評價中是非常有意義的。為了探討L-多巴與酪氨酸酶在單變量時間內相互作用的影響，設置在不同時間下的吸光度變化測定酶活性，得到時間對酶活性的影響曲線，如圖4所示。

圖4 酪氨酸酶活力隨時間變化曲線圖

從圖4中看出，100 U/mL 的酪氨酸酶活力隨著時間呈增長趨勢，特別在前 15 min 內，酶活力與時間呈正比增長。由圖4可知，30 min 后酪氨酸酶活力的增長趨勢基本趨于平緩，故本實驗選擇在 30 min 作為反應時間，用于測定各個體系的吸光度值A。

2.4.2 絞股藍提取物對絡氨酸酶活力的影響

為探究絞股藍提取物的美白效果，通過控制單因素變量法，測定了不同質量濃度下絞股藍提取物和煙酰胺對酪氨酸酶活力的抑制率，從靜置相同時間下的實驗組和空白組的吸光度計算出抑制率，得出絞股藍提取物和煙酰胺對絡氨酸酶抑制率的對比圖，如圖5所示。

圖5 煙酰胺與絞股藍提取物對絡氨酸酶活力抑制率對比圖

抑制酪氨酸酶活性能是有效降低黑色素形成，提取物溶液對酶的活性抑制率越高，代表酪氨酸酶活力越低，合成黑色素就越少 。從圖5可看出，絞股藍質量濃度在6000～10000 μg/mL 時，抑制率基本穩定在55%～60%之間，有一定的美白效果；對比絞股藍提取物與煙酰胺對酪氨酸酶活力的抑制效果，相差不大。所以絞股藍提取物總體抑制作用較強。

2.5 保濕評價

為探究絞股藍提取物的保濕效果，通過在相對濕度為43% 與硅膠環境下進行實驗，得絞股藍提取物的失水率同1% 丙二醇失水率對比圖，如圖6。

圖6 相對濕度43%環境下失水率對比圖

保濕是在相對干燥情況下，通過保濕劑使皮膚保持水分，改善肌膚濕潤度。通過對保濕劑進行保濕評價，測量保濕劑水分揮發到空氣中的能力，從而得出該保濕能力的好壞。從圖6看出，在相對濕度43% 條件下，絞股藍提取物溶液在 8 h 之內，失水率從2.56% 增加到 4.85%，但都低于1% 丙二醇溶液；從圖7看出，在硅膠環境下，絞股藍提取物在 8 h 之內，失水率從1.56%增加到4.22%，也都低于1% 的丙二醇。由此可知，絞股藍可能有一定的保濕作用，但有待進一步純化研究。

圖7 硅膠環境下失水率對比圖

2.6 抗菌評價

為探究絞股藍提取物的體外抑菌效果，將絞股藍提取物進行抗菌實驗，抑菌圈測量結果如表1所示。

表1 絞股藍提取物的抑菌圈直徑

國家標準WS/T 650—2019[27]抗菌和抑菌效果評價方法中(牛津杯測量法中)，當抑菌圈直徑>7 mm 時，可視為有抑菌效果。由于本實驗采取打孔法，且打孔直徑為 12 mm，所以當抑菌圈直徑>12+7 m=19 mm 者，才可視為有抑菌作用。由表1所知，絞股藍提取物對大腸桿菌抑菌圈直徑為 43 mm>19 mm、金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為 25 mm>19 mm，所以絞股藍提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑制作用，而對銅綠假單胞菌的抑菌圈基本沒有抑菌圈，沒有抑制作用。

2.7 抗炎評價

為了評價絞股藍提取物的抗菌效果，將不同濃度提取物進行抗炎測試，并用ELISA法檢測炎癥因子，所的結果如表2所示。

表2 絞股藍提取物的OD值

OD值越小，代表抗炎因子濃度越高，抗炎效果越好。由表2可得，當絞股藍質量濃度為 486 μg/mL 時，溶液顏色較淺，當質量濃度達到 24300 μg/mL 時，溶液基本呈透明，OD值可達0.1。由此可知，絞股藍提取物有較好的抗炎效果，可應用于抗痘、消炎等日用化妝品中。

3 結論

在溫度為 90 ℃，V(絞股藍粉末)∶m(80%乙醇)=1∶20，回流時間 2 h 提取條件下，絞股藍提取率為13.75%，絞股藍提取物中的黃酮質量分數為1.34%。絞股藍提取物對羥基自由基和DPPH自由基的清除率均在85%以上，有較強的抗氧化能力。通過分析絞股藍提取物對絡氨酸酶活力的抑制率，可得絞股藍提取物質量濃度在 600 μg/mL 基本達到最大抑制率58%，但與煙酰胺相比看出，絞股藍提取物的美白效果不顯著；絞股藍提取物在相對濕度43%和硅膠環境下的失水率均小于1%丙二醇失水率，但是具體還有待研究。通過抗菌研究，發現絞股藍提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有良好的體外抑菌效果，特別是對大腸桿菌有較強的抑菌效果，抑菌圈可達 43 mm，但銅綠假單胞菌幾乎沒有效果。通過分析測定絞股藍提取物抗炎效果可知，絞股藍提取物的OD值可達0.1，抗炎因子濃度高，有較強的抗炎效果。