工業發酵雪茄煙葉霉變微生物的分離鑒定及生物學特性研究

劉琳琳，蘆 柯，胡延奇*，常月勇，李 艷，時永楠，李 萌，李 曉*

工業發酵雪茄煙葉霉變微生物的分離鑒定及生物學特性研究

劉琳琳1，蘆 柯2，胡延奇1*，常月勇1，李 艷1，時永楠1，李 萌2，李 曉2*

（1.山東中煙工業有限責任公司濟南卷煙廠，濟南 250104；2.鄭州輕工業大學煙草科學與工程學院，鄭州 450000）

為明確引起工業發酵雪茄煙葉霉變的微生物種類及其生物學特性，從工業發酵霉變雪茄煙葉表面分離純化得到3株霉菌，采用形態學和分子生物學結合的方法進行種屬鑒定，并研究其生物學特性。結果表明曲霉屬是本研究中引起工業發酵雪茄煙葉霉變的主要菌種，分離純化得到3株霉變菌株分別為煙曲霉、黃曲霉和蒙地曲霉A。3株霉菌在不同培養基上的生長速度為黃曲霉>煙曲霉>蒙地曲霉。3株霉菌在25～35 ℃都能生長，40 ℃只有黃曲霉能生長，45 ℃及以上3株霉菌均不能生長。黃曲霉生長的最適pH為4，煙曲霉和蒙地曲霉生長最適pH為8～9。3株霉菌均對紫外光較敏感，紫外光照射15 min后致死率均達到90%以上。綜上，本研究發現工業發酵過程中引起雪茄煙葉霉變的3種曲霉分別是煙曲霉、黃曲霉和蒙地曲霉，合理運用溫度調控和紫外光照射對于防霉控霉有重要意義。

雪茄；霉變；微生物；鑒定；生物學特性

近年來雪茄消費量呈現高速增長的趨勢，但優質雪茄原料的緊缺限制了雪茄產能的進一步提升[1]。發酵是提升雪茄煙葉品質的重要技術環節[2-5]，國內雪茄煙葉發酵一般分為農業發酵和工業發酵兩個環節完成[6]。農業發酵主要在雪茄煙晾制之后進行，而工業發酵主要目的是彌補初次發酵的不足，可以進一步改善雪茄的香吃味、提高煙葉工業可用性，所以雪茄煙葉在工業發酵之后才能進行卷制[7]。由于煙葉含水量較高且環境相對濕度較大，雪茄煙葉在工業發酵過程中發生霉變較為普遍，給企業帶來巨大損失的同時也使得原料緊缺問題愈發突出。

煙葉霉變研究多集中于烤煙煙葉，曲霉屬和青霉屬真菌是其主要致霉微生物，不同地區主要霉菌有所不同[8-17]。如廣西煙倉主要致霉微生物為溜曲霉、匍匐散囊菌和桔青霉[13]；導致云南烘烤期煙葉霉變的微生物為少根根霉菌[16]；山東倉儲片煙霉菌主要類群為黃柄曲霉、黑曲霉、黃曲霉和桔青霉等[17]。

目前雪茄煙葉霉變的相關研究較少，有研究對倉儲期間雪茄煙葉和成品雪茄煙的致霉菌進行了分離和鑒定[18-21]，尚未見工業發酵中致霉菌的鑒定和生物學特性研究。本研究以工業發酵霉變雪茄煙葉為研究對象，對重要霉菌進行分離、純化，并應用形態學結合系統發育樹構建確定其分類地位，同時研究致霉菌的生物學特性，旨在為工業發酵中雪茄煙葉的霉變防控提供基礎信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

工業發酵過程中霉變雪茄樣品由山東中煙提供；PDA培養基，CYA培養基[22]，煙汁培養基（1000 mL水加10 g雪茄煙葉，煮沸過濾后加水至1000 mL，加20 g瓊脂，滅菌后得到1%煙汁培養基，同理可得5%、10%、20%煙汁培養基）。真菌基因組DNA快速抽提試劑盒購于上海尚寶生物科技有限公司；2×Taq Plus Master Mix II購于上海源葉生物有限公司；CaM5（5'-TCCGTAGGTGAACCTG CGG-3'）和CaM6（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）通用引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 研究方法

1.2.1 致霉微生物分離、純化和致霉性驗證 在無菌條件下，用接種環在霉變煙葉樣品表面霉層挑取少量菌絲在PDA平板上點接，30 ℃恒溫培養，待長出單菌落后，挑取單菌落在PDA平板點接培養，重復此操作2～3次，得到形態單一的菌落，即為疑似霉變病原菌菌株。取適量未霉變雪茄煙葉置于玻璃培養皿中，121 ℃滅菌30 min，將分離得到的疑似病原菌菌株用打孔器（內徑為5 mm）打取菌餅，接種于滅菌后的雪茄煙葉表面，30 ℃培養5 d，觀察疑似霉變菌株對雪茄煙葉的致霉效果，并打開培養皿蓋對菌株生長情況進行拍照。從人工接種后發生霉變的煙葉上再次分離、純化霉菌，觀察與原菌株是否一致。

1.2.2 形態學鑒定 培養特征觀察：將菌株分別接

種至PDA和CYA培養基，30 ℃恒溫培養3～5 d，觀察其菌落形態特征。鏡檢：采用斜插鏡檢法。將蓋玻片傾斜45°插入PDA培養基中，將分離得到的霉變菌株分別點接于插有蓋玻片的PDA平板培養基中央，待霉變菌株菌絲長至蓋玻片1/2處時取出。將其固定在無水乙醇浸泡過的載玻片上，用結晶紫均勻染色后在顯微鏡下觀察。

1.2.3 系統發育樹構建 用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒提取霉菌基因組DNA。應用通用引物和擴增鈣調蛋白基因（）片段，擴增程序參考宋嘉寶等[18]的試驗條件略有改動。觀察瓊脂糖凝膠電泳產物條帶；由生工生物工程（上海）有限公司對PCR產物測序，在NCBI數據庫進行BLAST同源性比對測序結果，利用MEGA X軟件構建系統發育樹[23]。

1.2.4 生物學特性 （1）不同培養基對霉菌生長的影響。供試培養基有PDA、CYA和煙汁培養基（1%、5%、10%、20%）。菌株在PDA中培養3 d（30 ℃）后，用打孔器（內徑為5 mm）打取菌餅，將其移入供試培養基，30 ℃培養3 d后測量菌落直徑。每個處理設3個重復，下同。

（2）不同培養溫度對霉菌生長的影響。將菌餅（直徑為5 mm）移入新的PDA培養基，分別在25、30、35、40、45和50 ℃下培養，3 d后測量菌落直徑。

（3）不同pH對霉菌生長的影響。取直徑為5 mm的菌餅用無菌水沖洗表面孢子，再將其稀釋成適宜濃度的孢子懸浮液。用HCl和NaOH溶液調節CYA液體培養基的pH，使CYA培養基的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0。分別取1 mL孢子懸浮液加入梯度pH培養基中，于恒溫搖床中28 ℃、110 r/min培養3 d，所得菌液在4 ℃下4000 r/min離心20 min，將上清液倒出，沉淀烘干稱重。離心管質量為初始質量，菌絲體干質量=總質量?初始質量。

（4）紫外光對霉菌生長的影響。無菌條件下將0.1 mL（107cfu/mL）孢子懸浮液涂布于PDA平板上。涂布后將培養皿蓋打開，分別在超凈工作臺的紫外燈下照射0（對照）、5、10、15、20和30 min后，在30 ℃下倒置培養5 d，記錄平板單菌落數量。

致死率=（對照菌落數?處理后菌落數）/對照菌落數×100%。

1.3 數據處理

應用Excel和SPSS進行數據處理和統計分析。

2 結 果

2.1 霉變微生物的分離、純化及致霉性驗證

經過多次分離純化，從霉變雪茄煙葉樣品得到3株真菌，分別命名為SD4、SD8和SD9。為確定其致霉性，分別將3株菌株接種至雪茄煙葉，接種煙葉表面均出現與霉變煙葉樣品相同的霉層（圖1）。接種霉變煙葉可再次分離得到菌株SD4、SD8和SD9且無其他雜菌，證明3株菌株均為雪茄煙葉致霉菌。

圖1 SD4、SD8、SD9接種后在煙葉上的生長情況

2.2 形態學分析及鏡檢

如圖2所示，菌株SD4菌落在PDA培養基上整體呈淡褐色，邊緣呈白色，表面較為平整；在CYA培養基上呈白色，菌落中間凸起，背面有淺橙色色素沉積。菌株SD8菌落在PDA培養基上整體呈淡綠色，邊緣呈淺黃色，表面呈粉末狀；在CYA培養基上呈白色，中間呈黃色粉末狀，菌落表面呈不規則凸起，背面有褶皺且有淡黃色色素沉積。菌株SD9菌落在PDA培養基上整體呈翠綠色，表面有黃綠色顆粒，中間凸起；在CYA培養基上菌落整體呈墨綠色，表面呈均勻褶皺狀，背面中心有深褐色色素沉積。

菌絲形態均在100倍油鏡下觀察，結果如圖3所示。SD4菌株孢子呈圓形或橢圓形，菌絲有隔膜。SD8菌株孢子呈圓形，菌絲有隔膜，頂囊呈近球形，分生孢子呈放射狀。SD9菌株孢子呈橢圓形，菌絲有隔膜，頂囊呈近球形，分生孢子頭為輻射狀或疏松柱狀。

圖2 菌株SD4、SD8、SD9菌落形態特征

圖3 菌株SD4、SD8、SD9鏡檢

2.3 分子鑒定

PCR擴增產物在550 bp處有單一且明亮的條帶，可用于菌株鑒定（圖4）。根據基因序列構建的系統發育樹如圖5、圖6和圖7所示。根據菌株形態特征和序列比對結果可知，SD4、SD8和SD9均屬于曲霉屬，分別為煙曲霉、黃曲霉和蒙地曲霉（表1）。

2.4 生物學特性

2.4.1 不同培養基對霉菌生長的影響 如表2所示，3種霉菌在CYA上生長最好，在PDA上次之，在煙汁培養基上生長最慢。SD8在幾種供試培養基上的生長速度均最快，其次為SD4，而SD9整體生長速度較慢。3株霉菌在不同培養基上的生長速度和適應性為SD8>SD4>SD9。

圖4 PCR產物電泳圖

圖5 菌株SD4系統發育樹

圖6 菌株SD8系統發育樹

圖7 菌株SD9系統發育樹

表1 雪茄煙葉霉變菌株的序列分析

表2 3株霉菌在不同培養基上生長3 d 的菌落直徑

注：表內數據為平均值±標準誤，同行不同小寫字母、同列不同大寫字母表示差異顯著（<0.05)，下同。

Note: The data in the table are presented as mean ± standard error, and different lowercase letters in the same row and different uppercase letters in the same column indicate significant differences (<0.05), as indicated in the following tables.

2.4.2 不同培養溫度對霉菌生長的影響 如表3所示，3株霉菌在25 ℃～35 ℃均生長較好，只有SD8在40 ℃還能生長，45 ℃及以上溫度3株霉菌均不能生長。SD4在25 ℃～35 ℃范圍內隨著溫度的升高生長速度逐漸加快；SD8和SD9在可生長溫度范圍內，均呈現隨溫度升高菌株生長速度先增高后降低的趨勢，且均在30 ℃生長狀況最好。

2.4.3 不同pH對霉菌生長的影響 如圖8所示，3株霉菌在pH為3～10的環境中均能生長，SD4的最適pH在8～9之間，適合在偏堿性的環境中生長；SD8的最適pH為4，表現出較好的耐酸性；SD9的最適pH為9，堿性環境更適合菌株SD9生長。

2.4.4 紫外光對霉菌生長的影響 不同紫外光照射時間對3種霉菌的影響如圖9所示，紫外光照射5 min后SD8的死亡率達到51%；10 min后SD4、SD8和SD9的死亡率分別達到了96%、71%、64%；15 min后3株霉菌的死亡率均高于90%；隨著照射時間的增加，3株霉菌的死亡率最終均接近100%。3株霉菌均對紫外光較為敏感，可以考慮在發酵前對車間環境進行紫外消殺。

表3 3株霉菌在不同溫度下生長3 d 的菌落直徑

圖8 不同pH對3種霉菌生長狀況的影響

圖9 不同紫外光照射時間對3種霉菌的影響

3 討 論

目前針對煙草制品霉變的研究多集中于烤煙和成品煙支，對雪茄煙葉的研究較少。宋嘉寶等[18]研究發現曲霉屬、藍狀菌屬和帚霉屬是引起海南倉儲雪茄煙葉霉變的主要霉菌種類，朱貝貝等[19]和張岱源等[20]分別以雪茄煙葉和手工雪茄為研究對象，均分離得到了聚多曲霉（）和產黃青霉（）兩種霉菌。本研究分離鑒定的工業發酵過程中引起雪茄霉變的3株霉菌均為曲霉屬，分別是煙曲霉、黃曲霉和蒙地曲霉，其中黃曲霉與付克劍等[21]的研究結果一致，其余兩種均為首次報道。但本研究只通過致霉性試驗確定上述菌株為致霉菌，未定量研究導致煙葉霉變的接種量臨界值，后續將開展相關試驗，為優化雪茄煙葉微生物群落生態系統提供相應的數據支撐。

試驗結果表明3株霉菌均在CYA培養基上生長最好。除黃曲霉的最適pH為4外，其余兩種菌株的最適pH均為8～9。3株霉菌最適生長溫度均在25～35 ℃之間，煙曲霉的最適溫度高于其他兩種霉菌，均在霉菌適宜生長溫度范圍內[24]；煙曲霉和蒙地曲霉在40 ℃就停止生長，而黃曲霉在45 ℃及以上不生長。發酵過程中合理調控發酵溫度一定程度上可以抑制霉菌正常生長，從而減少煙葉霉變。

Calado等[25]討論了紫外照射對于霉菌生長的抑制作用，白冬紅等[26]研究了不同方式（使用食品防腐劑和紫外照射等方式）對產黃青霉和黑曲霉生長的影響，結果表明紫外照射10 min，對兩種霉菌的殺菌率分別達到93.85%和76.65%。本研究中紫外光照射對于3種菌株的影響均較大，紫外光照射15 min后3種菌株的死亡率分別為99%、93%和91%。煙葉發酵前合理運用紫外光對車間環境進行消殺，可以抑制霉菌的生長，從而減少發酵過程中雪茄煙葉的霉變。

4 結 論

從工業發酵霉變雪茄煙葉上分離到3株致霉微生物SD4、SD8、SD9，經鑒定分別為煙曲霉、黃曲霉和蒙地曲霉，除黃曲霉外的兩株霉菌為首次報道；3株霉菌均在CYA培養基上生長最好，PDA次之，在煙汁培養基上生長的最慢，在不同培養基上的生長速度和適應性表現為SD8>SD4>SD9；3株霉菌在25～35 ℃都能正常生長，只有SD8在40 ℃能生長，其余2株霉菌在40 ℃及以上不生長；3株霉菌在pH 3～10的環境內均能生長，SD8最適pH為4，SD4和SD9最適pH為8～9；3株霉菌對紫外光均較敏感，照射15 min后死亡率均高于90%，可以考慮在發酵前對車間環境進行紫外消殺。

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Isolation, Identification and Biological Characterization of Mold Species from Industrial Fermented Cigar Tobacco Leaves

LIU Linlin1, LU Ke2, HU Yanqi1*, CHANG Yueyong1, LI Yan1, SHI Yongnan1, LI Meng2, LI Xiao2*

(1. Jinan Cigarette Factory of China Tobacco Shandong Industry Limited Company, Jinan 250104, China; 2. College of Tobacco Science and Engineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450000, China)

To identify the mold species during the industrial fermentation process of cigar tobacco leaves, fungi were isolated and purified from the surface of moldy cigar tobacco leaves, and were identified with the combination of morphological and molecular techniques. The biological characteristics of mold were also investigated. The results showed that the main mold causing moldiness of cigar tobacco leaves werein this study, and three strains of mold were identified as,and. The growth rate of the three mold strains were in the order of>>on different culture media. All three mold strains could grow at 25 ℃ to 35 ℃, onlycould grow at 40 ℃, and none of the strains could grow at 45 ℃or higher temperature. The optimal pH forwas 4, whileandwere most suitable for pH 8-9. All three mold strains were sensitive to UV radiation, and after 15 minutes of exposure, the mortality rate was over 90%. Overall, the results from this study indicated that the three types ofthat cause cigar tobacco leaf mold during industrial fermentation are,and. The rational use of ultraviolet irradiation is important for mold control and prevention.

cigar; mold; microorganisms; identification; biological characteristics

TS41+4

A

1007-5119(2023)06-0100-06

中國煙草總公司重大科技項目（110202201034）；山東中煙工業有限責任公司科技項目（KJXM-GS-202202006）

劉琳琳（1990-），女，助理工程師，碩士，主要從事微生物技術研究。E-mail：lll9066@163.com*通信作者。胡延奇，E-mail：huyanqi1971@163.com；李 曉，519389150@qq.com

2023-06-16

2023-10-11

10.13496/j.issn.1007-5119.2023.06.014