應用CRISPR/Cas9技術構建Raji-Luc CD19 KO淋巴瘤細胞系

劉靜靜，劉秀盈，馮婭茹，馮義超，于夢圓，王建勛,3（.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 0488；.深圳細胞谷生物醫藥有限公司，廣東深圳 588；3.深圳北京中醫藥大學研究院，廣東深圳 588）

淋巴瘤是最常見的血液腫瘤之一，主要分為非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）和霍奇金淋巴瘤（hodgkin lymphoma，HL）兩類[1]。其中，NHL 占所有淋巴瘤的90%，B 細胞非霍奇金淋巴瘤（B-cell non-hodgkin’s lymphoma，B-NHL）的發病率是T 細胞淋巴瘤的三倍，在我國常見的惡性腫瘤當中可以排在前10 位[2-3]。其發病率隨年齡增長呈上升趨勢，致死率較高。據中國國家癌癥中心和美國國家癌癥研究所預估數據顯示，2022年我國NHL 患病人數97 788 例，死亡人數高達57 929例[4-5]。

白細胞分化抗原CD19 是一種表達于除漿細胞以外的所有B 細胞系、惡性B 細胞與濾泡樹突狀細胞(follicular dendritic cells，FDCs)上的表面蛋白，在B 細胞成熟并最終分化為漿細胞的整個過程中都有表達[6]。有研究表明，大多數B 細胞惡性腫瘤患者的癌細胞中CD19 表達均為正常至高水平。因此，CD19 是B 細胞惡性腫瘤中最重要的靶抗原之一，是開發嵌合抗原受體T 細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）對抗NHL 和B 細胞白血?。˙ cell leukemia，BCL）最有希望的靶點[7]。然而，約60%治療后復發患者的癌細胞會出現CD19 表達減少或完全喪失的現象[8]。目前，盡管抗CD19 CAR-T 細胞在治療B 細胞惡性腫瘤方面效果顯著，但治療后經常會出現腫瘤復發的現象，而腫瘤復發的主要原因與抗原逃逸有關[9-10]。因此，需要一種能夠模擬CAR-T 治療過程中免疫逃逸現象的細胞模型以用于相關研究。Raji 是一種非霍奇金淋巴瘤，起源于B 淋巴細胞，其CD19 和CD38 呈雙陽性表達，常被用做靶細胞進行非霍奇金淋巴瘤的相關研究[11]。本研究通過CRISPR/Cas9 技術，構建了Raji-Luc CD19 KO 細胞，為后續探索如何解決CAR-T 細胞療法由于抗原免疫逃逸而產生的腫瘤復發問題構建了細胞模型，并奠定了實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 研究對象

1.1.1 細胞：Raji-Luc 細胞購自北京維通達生物技術有限公司，于液氮罐中冷凍保存。

1.1.2 質粒：電轉所用的原始質粒pCAG-PBase，PB-CRISPR-Cas9，PB-CRISPR-sgRNA 均由中國農業大學吳森教授饋贈，于-20℃冰箱中冷凍保存。

1.2 儀器與試劑 RPMI 1640 培養液，AIM-V 培養液、PBS 溶液、青霉素-鏈霉素溶液、限制性內切酶、T4 連接酶、瓊脂、酵母提取物、胰蛋白胨、氯化鈉、氨芐青霉素、DH5α 感受態細胞、50×TAE 溶液、DNA marker 和瓊脂糖（北京蘭博利德商貿有限公司）；膠回收試劑盒、質粒小提試劑盒、質粒大提試劑盒和DNA 純化試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；FBS 胎牛血清（北京百諾威生物科技有限公司）；7-AAD 抗體、PEMYC 抗體、APC anti human CD19 抗體和FITC anti human CD38 抗體（深圳市達科為生物技術股份有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 構建PB-CRISPR-CD19 sgRNA 質粒：在NCBI 網站以“CRISPR/Cas9 CD19 sgRNA”為關鍵詞進行相關文獻檢索，并通過IDT 網站驗證off-target 以及on-target，按照打分由高到低的順序，選擇合適的sgRNA 序列，見表1。由擎科生物進行引物合成，將合成的引物片段退火形成所需的目的片段，將目的片段與線性化載體CRISPR-sgRNAvector 在16℃恒溫條件下采用T4 連接12h，轉化至感受態大腸埃希菌后擴大培養，提取質粒并進行濃縮。

表1 sgRNA 片段序列表

1.3.2 Raji-Luc 細胞的培養：復蘇Raji-Luc 細胞，于37℃，5ml/dl CO2細胞培養箱中無菌培養，每48h 用含10g/dl FBS 的RPMI 培養液傳代一次，使接種密度為5×105個/ml，培養至對數生長期用于后續實驗。

1.3.3 篩選最優sgRNA 序列：將Raji-Luc 細胞分為4 組，每組1×106個，分別命名為sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3 和sgRNA4，300g 離心5 min，棄去上清，加入無血清RPMI 培養液重懸，每組加入pCAG-PBase 轉座酶，PB-CRISPR-Cas9 及PBCD19 sgRNA 質粒各4μg，混勻后轉移至電轉杯中。采用伯樂電轉儀，選擇K562 模式進行電轉染。電擊結束將細胞置于培養箱穩定30 min 后緩慢滴加雙倍血清。電轉染48 h 后，取適量電轉后的4 組細胞和未電轉的原始Raji-Luc 細胞，400g 離心5min，去除上清，用適量PBS 洗滌細胞，離心，去除上清，分別加入染色緩沖液重懸細胞，APC anti human CD19 流式抗體避光染色1h。染色結束后加入PBS洗滌細胞，離心后用PBS 重懸，用流式細胞儀檢測細胞CD19 的表達情況。

1.3.4 電轉染PB-CRISPR-CD19 sgRNA1 質粒制備Raji-Luc CD19 KO 細胞：取1×107個Raji-Luc 細胞原液量，350g 離心8min。棄去上清，加入含有sgRNA1 電轉質粒的無血清RPMI 培養液重懸。采用伯樂電轉儀，選擇K562 模式進行電轉染。電擊結束將細胞置于培養箱穩定30min 后緩慢滴加雙倍血清。

1.3.5 流式細胞術檢測電轉染效率并篩選穩定敲除的單克隆細胞株：電轉染48h 后，取適量電轉后的Raji-Luc CD19 KO 細胞和未電轉的原始Raji-Luc細胞，400g 離心5min，去除上清，用適量PBS 洗滌細胞，離心，去除上清，分別加入2g/dl FBSPBS 染色緩沖液重懸細胞，并向其中加入FITC anti human CD38，APC anti human CD19 和7-AAD 流式抗體避光染色1h。染色結束后加入PBS 洗滌細胞，離心后用PBS 重懸，用流式細胞儀檢測細胞的轉染效率，將7-AAD-CD38+CD19-的分群設為目標細胞，進行流式分選，將分選后的細胞極限稀釋至2.5 個/ml，在96 孔板中每孔加入200μl 篩選單克隆細胞。將96 孔板中的單克隆細胞株進行擴大培養，再次取適量單克隆細胞用抗體FITC anti human CD38，APC anti human CD19 染色，以未轉染的Raji-Luc 細胞作為陽性對照，對比檢測Raji-Luc CD19 KO 細胞表面CD19 和CD38 的表達情況，以確定篩選得到的細胞是否成功敲除表面CD19抗原。

1.3.6 細胞系表面熒光素酶表達的檢測：分別取原始的Raji-Luc 細胞、Raji-Luc CD19 KO 細胞2 號單克隆、Raji-Luc CD19 KO 細胞20 號單克隆各1×105個，依次梯度稀釋為1×105，1×104，1×103，102個/ml 接種于96 孔白板中，每孔分別加入100μl Bright-LumiTM螢火蟲熒光素酶檢測試劑，反應5min后，選擇化學發光模式，檢測各組各孔細胞的相對發光光度（relative light unit，RLU）。

1.3.7 Raji-Luc CD19 KO 細胞基因序列檢測：擴大培養流式檢測篩選出的單克隆細胞，分別取適量原始的Raji-Luc，Raji-Luc CD19 KO 2 號、20 號單克隆細胞提取基因組，以此為模板分別PCR 擴增出CD19 基因片段。引物序列為：FOR：5’-ATGCCA CCTCCTCGCCTC-3’，REV：5’-ACCTGGTGC TCCAGGTGC-3’，擴增程序為：①94℃，1min；②98 ℃，10s； ③55 ℃，15s； ④68 ℃，30s/kb；②③④30Cycles。將PCR 擴增產物送至金唯智測序公司進行測序。

1.3.8 熒光素酶化學發光法驗證CAR-T 對Raji-Luc 和Raji-Luc CD19 KO 細胞的殺傷作用：取對數生長期的Raji-Luc 和Raji-Luc CD19 KO 細胞，以8×105個/ml 每孔50μl 的密度接種于96 孔白板中作為靶細胞。取適量實驗室前期制備的Pan-T 以及CD19 CAR-T 和CD38 CAR-T 細胞為效應細胞[12-13]。各分為三個實驗組：靶細胞+Pan-T 細胞組、靶細胞+CD19 CAR-T 細胞組、靶細胞+CD38 CAR-T 細胞組，每組分別設置效靶比為1∶1，1∶2，1∶4 和1∶8，各三個復孔。取適量CAR-T 和Pan-T 細胞，處理至合適密度，在上述96 孔板中每孔加入50μl CAR-T細胞或Pan-T 細胞，置于37℃，5ml/dl CO2細胞培養箱中共培養。培養8h 后，分別在各組每孔加入100μl Bright-LumiTM螢火蟲熒光素酶檢測試劑，反應5min 后，選擇化學發光模式，檢測各組各孔細胞的相對光單位（relative light unit，RLU），計算殺傷效率，計算公式：殺傷效率=1-（實驗孔-空白孔）/（最大裂解孔-空白孔）×100%。

1.4 統計學分析 實驗數據采用GraphPad Prism 8 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功構建PB-CRISPR-CD19 sgRNA 質粒 測序結果見圖1a，構建所得四組PB-CRISPR-CD19 sgRNA 質粒序列與預期序列一致，成功構建PBCRISPR-CD19 sgRNA 質粒，質粒構造見圖1b。

2.2 sgRNA1 序列效果最佳 流式細胞術檢測結果見圖2。原始Raji-Luc 細胞CD19 表達率為98.52%，電轉染48h 后sgRNA1，sgRNA2，sgRNA3 和sgRNA4 四組細胞CD19 的表達率均低于原始Raji-Luc 細胞，分別為58.96%，65.81%，70.83%和67.78%。sgRNA1 的序列靶向性較強，并且電轉染過后細胞狀態最佳。

圖2 流式細胞術檢測四組sgRNA 轉染細胞及Raji Luc 細胞CD19 的表達率

2.3 電轉染PB-CRISPR-CD19 sgRNA 質粒成功制備Raji-Luc CD19 KO 細胞 流式細胞術鑒定結果見圖3a，極限稀釋法篩選得到的單克隆細胞株中2號單克隆和20 號單克隆細胞表面CD19 表達缺失，而CD38 表達正常。進行凍存復蘇后，兩株單克隆細胞的CD19 表達依舊穩定缺失，且兩組細胞電轉導效率均達到99%以上（即CD19 陰性，CD38 陽性細胞），見圖3b。

圖3 流式細胞術檢測Raji-Luc CD19 KO 單克隆細胞表面蛋白表達情況

2.4 Raji-Luc CD19 KO 細胞與原始Raji-Luc 細胞的熒光素酶表達比較 經酶標儀檢測結果見圖4。2 號單克隆Raji-Luc CD19 KO 細胞和20 號單克隆Raji-Luc CD19 KO 細胞與原始Raji-Luc 細胞相比熒光素酶表達差異無統計學意義。

圖4 Raji-Luc CD19 KO 細胞系熒光素酶檢測

2.5 單克隆Raji-Luc CD19 KO CD19 細胞表面抗原的表達敲除 測序結果見圖5。Raji-Luc CD19 KO 2號單克隆在CD19 基因處發生了大片段的堿基丟失，Raji-Luc CD19 KO 20 號單克隆細胞株的基因序列在該基因片段發生了小片段的丟失，兩個細胞株CD19 表面抗原的表達都被成功敲除。

圖5 原始Raji-Luc 細胞與CD19 KO 單克隆細胞基因序列對比圖

圖6 CAR-T 細胞對Raji Luc 及Raji-Luc CD19 KO 細胞的殺傷效率檢測

2.6 Raji-Luc CD19 KO 細胞不能激活對應的CAR-T細胞 流式檢測結果顯示，實驗室此前構建成功的CD19 CAR-T 和CD38 CAR-T 細胞均出現明顯細胞分群，轉導效率分別為72.4%和72.9%，見圖6a。熒光素酶測定殺傷效率實驗結果顯示，當靶細胞為Raji-Luc 細胞時，CD19 CAR-T 與CD38 CAR-T 細胞殺傷能力相當，且明顯強于Pan-T 細胞，差異具有統計學意義（t=3.405～3.771，均P＜0.05），見圖6b。當靶細胞為Raji-Luc CD19 KO 細胞時，CD19 CAR-T 細胞與Pan-T 細胞的殺傷能力相當，CD38 CAR-T 細胞的殺傷能力明顯強于Pan-T 細胞和CD19 CAR-T 細胞（t=5.428～6.804，均P＜0.05），見圖6c。該結果表明敲除CD19 的Raji-Luc 細胞株不能激活對應的CAR-T 細胞進行殺傷。

3 討論

CD19 屬于免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）超家族的成員，位于16 號染色體短臂上(16p11.2)，在調節B 淋巴細胞選擇、激活和分化的細胞表面受體的信號傳導閾值中起到非常重要的作用。ENGEL等[14-15]人的研究表明CD19 的缺失會使小鼠外周血淋巴組織中B 細胞的數量明顯減少，B 細胞對有絲分裂原的增殖反應明顯降低，血清免疫球蛋白水平也顯著降低。過表達CD19 的小鼠在骨髓早期B 細胞發育中存在明顯的缺陷，有絲分裂反應增強，血清免疫球蛋白水平升高。

近年來，抗CD19 CAR-T 細胞在治療復發或難治性急性B 淋巴細胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）方面取得了快速而持久的顯著療效[16]。目前有700 多項相關臨床試驗在 ClinicalTrials.gov中注冊，其中41%針對CD19。PAN 等[17-18]人指出，在現有抗CD19 CAR-T 細胞的治療過程中有相當大比例的患者由于CD19 抗原的逃逸或表達下調，復發率顯著增加。RUELLA 等[19]人在臨床研究當中發現，一例B-ALL 患者在接受抗CD19 CAR-T 細胞注入19 天后病情得到了完全緩解，但在治療后第261 天出現病情復發并最終死亡，該患者復發后的白血病細胞均異常表達抗CD19 CAR，無法檢測到CD19 的表達。

抗原逃逸現象的出現，迫使我們去探究如何使CAR-T 細胞在腫瘤細胞抗原丟失后仍然對其具有殺傷作用或是尋找更加合適的替代靶點[20]。ZHAO等[21]人開發了一種新型CD19/CD22/CD3 三特異性抗體，用于克服腫瘤免疫逃逸對CAR-T 的限制。DAI 等[22]人為了解決CD19 抗原丟失而造成腫瘤復發的情況，設計了一種靶向CD19 和CD22的雙特異性CAR-T 細胞用于治療成人B-ALL。然而，在上述的研究當中，實驗者均采用對比單抗原CAR-T 與多抗原CAR-T 對同一腫瘤細胞的殺傷情況來驗證CAR-T 對于腫瘤的體外治療情況，并未通過產生CD19 抗原丟失的腫瘤細胞來進行直接驗證，本研究所構建的Raji-Luc CD19 KO 細胞正是為此類研究提供了可以直接驗證的模型支持，為后續研究者進行補充實驗提供了研究對象。

CRISPR/Cas9 是繼ZFN，TALENs 等基因編輯技術推出后的第三代基因編輯技術，在基因敲入、基因敲除、堿基突變等方面更加快速高效和便捷。近年來，CRISPR/Cas9 技術也被應用于構建各種細胞系以滿足不同領域的研究，解決了很多在過去的科研過程中無法克服的困難[23]。黃小琴等[24]人通過CRISPR/Cas9 系統構建了敲除AMPKα1的A549 和H460 肺癌細胞的細胞株，為后續研究AMPKα1 對于肺癌的促癌機制提供了細胞模型。盡管CRISPR/Cas9 在腫瘤治療研究方面顯示出光明的前景，但它依賴DSB 刺激基因編輯過程可能會破壞其安全性，其基因敲除的隨機性可能會產生新的基因型，其中一些可能會產生潛在致病后果[25]。在本研究中，篩選最適的sgRNA 彌補了CRISPR/Cas9 質粒敲除效率不一致的缺點，通過篩選單克隆以及基因測序解決了敲除隨機性的問題。并且在敲除CD19 后仍不影響細胞原始熒光素酶基因的表達，這為后續在動物實驗中對腫瘤進行長期觀察提供了檢驗手段。